Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Migration und Interaktion von Leukozyten bei fortschreitenden entzündlichen Lebererkrankungen zu verfolgen. Um die Abfolge der Ereignisse besser zu verstehen, die der Rekrutierung dieser Zellen in das Lebergewebe zugrunde liegen, und ihre mögliche Beteiligung an der Immunpathologie. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Tracheotomie durchgeführt wird, um die Kontrolle über die Atmung der Maus zu erlangen, ein entscheidender Schritt, um das langfristige Überleben des Tieres zu sichern.

In einem zweiten Schritt führt die Maus eine Laparotomie durch, um die Leber chirurgisch freizulegen und mit dem Multiphotonenmikroskop Zugang zum Organ zu erhalten. Anschließend wird die Leber fixiert und positioniert, indem sie in das Entstanden eingebettet wird, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Die Bildgebung kann über mehrere Stunden durchgeführt werden, was zu hochauflösenden Zeitraffersequenzen führt, die die Veränderungen in der Rekrutierung, Positionierung und Interaktion einzelner Leukozyten verfolgen.

Bei der Entwicklung einer Leberentzündung kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der akuten und chronischen Leberentzündung zu beantworten, wie z.B. die Rekrutierung von Leukozyten, Zellzellinteraktionen oder Mechanismen der Immunpathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zur herkömmlichen Mikroskopie besteht darin, dass die multifokale Mikroskopie eine Langzeitbildgebung praktisch ohne Probenstörung mit geringem Fohlenbleichen oder Phototoxizität ermöglicht, sowie optische Schnitte bis zu 100 Mikrometer tief in das Gewebe, und dies ist auf die einzigartige Physik des Lasers des fernroten Laserlichts zurückzuführen. Nun, diese Methode kann Einblicke in Lebererkrankungen geben.

Es kann leicht an andere Systeme angepasst werden. Seit der Methode der Stabilisierung und Fixierung kann das Gewebe auf praktisch alle Fragestellungen der Intravitalmikroskopie angewendet werden, so dass Organe wie Milz, Niere oder sogar subkutane Tumoren problemlos mit Hilfe von fließend verwandten Zellen abgebildet werden können. Es ist auch möglich, alle Leukozyten-Untergruppen sichtbar zu machen und deren Wechselwirkungen und Leberentzündungen einzusenden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der extremen Komplexität der Kleintierchirurgie Schwierigkeiten haben. Aufgrund unserer eigenen Erfahrung ist dies jedoch nur für ein paar Wochen ein limitierender Faktor und erfordert nur etwas praktische Routine. Aufgrund der Zerbrechlichkeit des Lebergewebes sind die Vorbereitungsschritte schwer zu erlernen, und eine visuelle Demonstration der Methode ist unerlässlich. Füllen Sie nach dem Einrichten der Betäubungsmittel die Maus-Aro-Bühne mit 3%aros und gießen Sie es in einem 40-Grad-Winkel ein.

Stellen Sie dann sicher, dass der chirurgische Arbeitsbereich vollständig desinfiziert ist, ebenso wie alle erforderlichen Instrumente usw. Dann betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion eines Anästhesiecocktails. Fünf Minuten später überprüfen Sie die Reflexe des Tieres, desinfizieren Sie dann die Haut und tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf.

Befestigen Sie nun die Maus am Vorbereitungstisch. Positionieren Sie es mit Klebeband so, dass die Bauchseite freigelegt wird und der Hals sanft überdehnt wird. Ein Gummiband, das an den Schneidezähnen eingehakt wird, kann dies bewerkstelligen.

Führen Sie nun den ersten Schnitt unterhalb des Kinns etwa 0,5 bis einen Zentimeter lang durch. Präparieren Sie dann vorsichtig das Bindegewebe zwischen den Speicheldrüsen und finden Sie den Muskelschlauch, der die Luftröhre umgibt. Reißen Sie den Muskel vorsichtig ein, um die Luftröhre freizulegen.

Ziehen Sie einen Faden unter die Luftröhre und öffnen Sie dann die Luftröhre mit einer Mikroschere mit einem T-förmigen Schnitt in den Schnitt. Führen Sie das Belüftungsrohr etwa einen halben Zentimeter ein. Schieben Sie den Schlauch mit einer kleinen anatomischen Pinzette vor.

Sichern Sie dann den Schlauch mit Nähten. Nähen Sie dann für zusätzliche Sicherheit den Schlauch mit der Haut, versiegeln Sie den Schnitt in der Haut mit Cyanacrylat und befestigen Sie den Schlauch am Kopf des Tieres. Halten Sie die Anästhesie mit Klebeband mit einem kontinuierlichen Fluss von 2% Iso-Fluor aufrecht.

Nachdem Sie die Maus für die Operation vorbereitet haben, machen Sie einen kleinen Hautschnitt unterhalb des Brustbeins und verlängern Sie den Schnitt seitlich unterhalb der Rippen auf beiden Seiten. Verätzen Sie dabei alle freiliegenden Blutgefäße. Um Blutungen zu minimieren, führen Sie einen kleinen ersten Schnitt am linearen Ellenbogen durch, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.

Verlängern Sie den Schnitt horizontal, verschließen Sie alle Blutgefäße und geben Sie Zugang zur Leber. Übertragen Sie nun die Maus auf die Agro-Bühne und stapeln Sie die Objektträger auf beiden Seiten des Tieres, um es an Ort und Stelle zu halten. Diese Stapel sollten auf die Höhe der Maus abgestimmt sein, damit die Bühne für die Leber, die später platziert wird, keinen übermäßigen Druck auf den Bauch ausübt.

Ziehen Sie nun mit Nähten im Brustbein die Rippen zurück. Vier Null-Naht reicht aus Nach dem Zurückziehen der Rippen durchtrennen Sie die Bänder, die die Leber und das Zwerchfell verbinden, und schneiden Sie bis zur Aorta, aber arbeiten Sie mit besonderer Vorsicht, um das Gefäß nicht zu reißen oder zu durchtrennen. Durchtrennen Sie auch das Band, das die Leber und den Magen-Darm-Trakt verbindet.

Drehen Sie die Maus um 45 Grad, um den Zugang zum größeren Leberlappen zu verbessern. Nehmen Sie einen handelsüblichen Deckslip und kleben Sie ihn an den Rändern fest, damit er nicht scharf wird. Legen Sie es über die Bauchhöhle.

Dies dient als Bühne für die Leber, um die Leber auf der Bühne zu positionieren. Schieben Sie vorsichtig eine Doppelkugel-Taststiftsonde oder einen gepolsterten Spatel unter die Leber und halten Sie die Oberseite des Organs. Durch die Verwendung eines feuchten mechanischen Drucks auf das Gewebe wird das Lebergewebe sofort geschädigt, daher ist es wichtig, das Organ mit Vorsicht zu behandeln.

Heben Sie dann den Lappen auf die Rutsche und ziehen Sie ihn vorsichtig in Position. Der Lappen wird in der Regel gebogen oder gefaltet, versuchen Sie vorsichtig, die Ränder zu entfalten, indem Sie das Gewebe mit einem dünnen Spatel oder einem feuchten Taschentuch anheben. Fügen Sie als Nächstes seitliche Stützen in Form von Deckgläsern oder Rutschen hinzu.

Stapeln Sie die Deckgläser so, dass sie die gleiche Höhe wie der Leberlappen haben. Das Staging und die Fixierung der Leber ist der wichtigste Schritt im Protokoll. Jede mechanische Beanspruchung, Torsion oder Druck führt zu einer sofortigen Schädigung des Gewebes oder zumindest zu einer Beeinträchtigung der Durchblutung der sinusförmigen Gefäße.

Legen Sie nun einen großen Deckbogen mit verklebten Kanten über den Leberlappen, der von den seitlichen Stützen gestützt wird. Positionieren Sie diesen Deckglas so waagerecht wie möglich. Es sollte die Leber nicht zusammendrücken.

Weißes Gewebe deutet auf eine gestörte Durchblutung hin, es sei denn, die Bildgebung erfolgt schnell. Es ist nun notwendig, zwei unabhängige intraperitoneale Katheter zu legen, um eine Langzeitanästhesie zu gewährleisten und G fünf zu applizieren. Diese bestehen aus 27-Gauge-Nadeln und flexiblen Silikonschläuchen.

Starten Sie dann den Fluss mit Spritzenpumpen. Führen Sie die Katheter in den Unterbauch in der Nähe der Hintergliedmaßen ein. Nachdem Sie wichtige Monitore an die Maus angeschlossen haben, bereiten Sie 100 Milliliter 3%aros in einem XPBS vor.

Wenn der Aros auf 41 Grad Celsius abgekühlt ist, betten Sie die Leber mit einer Fünf-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel darin ein. Sobald die Aeros abgekühlt sind, verwenden Sie einen Heideman-Spatel, um den Überschuss zu entfernen und ein Sichtfeld freizulegen, das groß genug ist, um die Leber zu scannen. Fahren Sie dann mit dem Scannen fort.

Nachdem das Sichtfeld vorbereitet wurde, bewegen Sie die Maus unter das Mikroskop, um geeignete Scanbereiche für die Zeitrafferaufnahme auszuwählen. Das Lebergewebe wird mit dem Auge mit einer externen Weißlichtquelle abgetastet, um repräsentative Felder mit ausreichendem Blutfluss und minimaler Probenstörung CXCR zu identifizieren. Sechs GFP-heterozygote Mäuse wurden als Experiment einer intravitalen T-P-L-S-M-Bildgebung unterzogen. Einige erhielten eine intraperitoneale Injektion von Tetrachlorid, um akute Leberschäden auszulösen.

Modale Zellen, die GFP exprimieren, wurden per Video verfolgt und ihre Spuren überlagert, um einen Schnappschuss der zellulären Mobilität zu erhalten. Die Spuren wurden dann normalisiert. Normale Lebern hatten Zellen mit zufälligen Migrationsmustern.

Lebern, die mit CCI vier injiziert wurden, zeigten eine Beeinträchtigung der Zellmigration. Bei der Messung der Gesamtverdrängung von ihrem Ursprung aus war klar, dass es 36 Stunden nach der Behandlung mit CCI vier an der Stelle der hepatozellulären Schädigung zu Zellfallen kam. Eine beeinträchtigte Migration durch die Leberschädigung konnte auch gezeigt werden, indem man die Migrationsgeschwindigkeit einzelner Zellen im Zeitverlauf aufzeichnete, wobei ein teilweiser Stillstand nach 18 Stunden und ein vollständiger Migrationsstillstand nach 36 Stunden gezeigt wurde.

Die Verringerung der Geschwindigkeit der wandernden Zellen konnte auch als statistisch signifikant gezeigt werden, wenn die Zellen als Populationen verglichen wurden. Daher eignet sich dieser Ansatz, um Veränderungen in der Zellmigration und -positionierung bei der Entwicklung von Lebererkrankungen zu verfolgen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Leber einer Maus für die intravitale Multi-Photomikroskopie vorbereitet.

Die Methode, die wir hier zur Verfügung stellen, ermöglicht es uns, das Tier für ein langfristiges Überleben zu stabilisieren und Bewegungsartefakte durch die von uns angebotene schonende Fixationsmethode zu minimieren. Einmal maskiert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, die Vitalparameter der Tiere zu kontrollieren und Temperatur, Herzfrequenz, Sauerstoff- und CO2-Spiegel zu stabilisieren. Dies kann erreicht werden, indem die Tiefe der Nekrose und der Atmung nach dieser Technik angepasst wird.

Andere Verfahren wie die Durchflusszytometrie-Analyse oder die Laser-Capture-Mikrodissektion können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie den Phänotyp der infiltrierenden Immunzellen oder Mediatoren, die vom Gewebe oder infiltrierenden Zellen nach seiner Entwicklung sezerniert werden, zu beantworten. Diese Techniken ermöglichten es den Forschern, Einblicke in die Dynamik des Leukozytenverkehrs und der zellulären Wechselwirkungen in der Leber zu gewinnen und die Abfolge von Ereignissen, die zu entzündlichen Lebererkrankungen führen, zu analysieren. Bitte befolgen Sie die Laser-Sicherheitsrichtlinien für die Bildgebung mit einem hochenergetischen Puls-Infrarot-Laser, der für die Multiphotomikroskopie verwendet wird.

Stellen Sie sicher, dass keine Reflexion von Laserstrahlung eine Gefahr für Ihre Augen und Ihre Haut darstellen kann, während Sie dieses Experiment durchführen.