Name: Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Langzeitintravital-Multiphotonenmikroskopie zur Beobachtung von Leukozytenmigration und -interaktionen in der Leber bei CXCR6.Gfp-Reportermäusen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung über mehrere Stunden.

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Die Autoren danken der Zentralen Tierhaltungseinrichtung des Universitätsklinikums Aachen für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) und durch das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Aachen. Diese Arbeit wurde auch durch die Core Facility "Two-Photon Imaging" unterstützt, eine Core Facility des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF) Aachen innerhalb der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen.

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Rechtsvorschriften über Tierversuche nach dem &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren&quot; (NIH Veröffentlichung, 8. Auflage, 2011) durchgeführt und der Richtlinie 2010/63 / EU über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (Amtsblatt der Europäischen Union, 2010) verwendet. Offizielle Genehmigung wurde von der staatlichen Tierpflege und Verwendung Büro (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Deutschland) gewährt. HINWEIS: Die Schritte, die für kurzfristige Bildgebungs weggelassen werden können (zB Schnappschüsse, 3-D-Stapel oder auch kurzen Dauer Zeitraffer-Mikroskopie) sind mit einem Stern (*), um die Vorbereitungszeit zu reduzieren und vereinfachen das chirurgische Protokoll markiert. Bildgebung kann auch ohne umfangreiche Überwachung und Umlaufsteuerung ausgeführt wird, wenn jedoch notwendig, die Überlebenszeit merklich verringert werden. 1. Mikroskop-Setup und Pre-Chirurgie Vorbereitung (5-10 kmn) <ol><li> Switch-System auf (Mikroskop, Netz Lab, Laser, Heizkissen, Klimakammer, Webcam, Spritzenpumpe Gerät, Atemschutzmaske). </li><li> Schließen O 2 Versorgung Isofluran Vapor und stellen Isofluran Ebene bis 1,5 Vol% (V / V), eine Verbindung zu einem kleinen Tierbeatmungsgerät. <ol><li> Für kurzfristige Bildgebung, halten die Anästhesie mit Isofluran nur nach der ersten IP-Narkose (siehe Schritt 2.2). Dann nutzen Sie 2 Vol% (v / v) Isofluran, und halten Sie die Aufnahmezeit weniger als 2 Stunden, um eine stabile Lebermikrozirkulation zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Atmung zu 120-140 Atemzyklen / min mit einem Volumen von 150 bis 200 &amp; mgr; l. </li><li> Einrichten der Maus Agarose Bühne. Bereiten 100 ml 3% (w / v) Agarose, Gießen in eine Schale (ca. 10 cm x 15 cm-Basis) in einem Winkel von 40 °. </li><li> Einrichten chirurgischen Arbeitsbereich sammeln die erforderliche Messtechnik. Um mikrobielle Infektion zu verhindern, Desinfektion Instrumente mit einer 1% igen Lösung von Sekusept Forte S (9,9% w / v) Glutaral 9,8% w / v, Formaldehyd für 5 min vor dem Experiment (Figur 1A). </li><li> Erhalten übrigen Komponenten: Hautdesinfektionsmittel (zB 10% Povidon-Iod-Lösung), Leber-Stufe (Stapeln und Steg) und Agarose-Lösung (3% (w / v) in PBS), Spritzenpumpe mit 5% (w / v) Glucoselösung (G-5), Spritzenpumpe mit Anästhesielösung I (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml), Wattestäbchen, n-Butyl-2-Cyanoacrylat und 1x PBS. Setzen Agarose Bühne Gericht in Inkubationskammer zur Vorwärmung. </li></ol> 2. Tracheotomie (10-15 min) <ol><li> Verwenden C57BL / 6 Mäuse von Haus in Zucht einem Gewicht von 25 bis 28 g. Haus die Mäuse unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien FELASA, in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung mit 12 Stunden Licht / 12 h Dunkel-Zyklus. Lassen Tiere freien Zugang zu Standardmäusen Ernährung (Sniff Standard-Nagerfutter) und Wasser ad libitum. </li><li> Betäuben die Maus von initial intraperitoneale (ip) Injektion von 250 ul Anästhesielösung II (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 1 mg / ml, Buprenorphin 10 ug / ml). <ol><li> * Für Halt während intravitalen Bildgebung, kontinuierlich zu verabreichen Anästhesielösung I durch kontinuierliche Injektion ip (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml) mit einer Spritze Pumpvorrichtung mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml / h in Kombination mit inhalativen Isofluran 0,5 Vol% (v / v). </li><li> Überprüfen Reflexe nach 5 min (zB Prise Fuß-Pad mit einer Pinzette), desinfizieren die Haut für Tracheotomie Startvorbereitung, wenn die Maus in der chirurgischen Anästhesie tolerant Zustand. </li><li> Anwenden Augenschutzcreme (zB Dexpanthenol 50 mg / g) auf der Hornhaut vor dem Austrocknen (1B) zu verhindern. </li></ol></li><li> Fixieren Sie die Maus auf Vorbereitungstisch auszusetzen Bauchseite mit Klebeband für den Extremitäten; sanft dehnen Hals, in dieser Position zu fixieren, z. B., indem ein Gummiband eingehakt to der Schneidezähne. <ol><li> Desinfizieren Sie Haut und Fell mit Povidon-Iod-Lösung, durch die Anwendung Desinfektionsmittel mit einem Wattestäbchen. </li></ol></li><li> Mit den ersten Hautschnitt (0,5 bis 1 cm Länge) direkt unter das Kinn (1C) <ol><li> Sorgfältig sezieren Bindegewebe zwischen Speicheldrüsen (1D). </li><li> Vorsichtig aufreißen Muskelschlauch umgebenden Luftröhre (1E, F). </li></ol></li><li> Zeigen chirurgischen Faden unter der Luftröhre zur späteren Belüftungsschlauch Fixierung (1G). <ol><li> Offene Luftröhre mit Mikroscheren zwischen Knorpelringe Führen eines T-förmigen Einschnitt (Figur 1H) </li></ol></li><li> Zeigen Belüftungsschlauch in die Luftröhre durch den Einschnitt (~ 0,5 cm). Um das Rohr nach vorne schieben, greifen Schwanzende mit kleinen anatomischen Pinzette und vorsichtig voran den Schlauch in die Luftröhre (1I) </li><li> Fixieren Sie Rohr mit chirurgischen Faden (zB </em&gt;, 5-0) mit Gewinde in Schritt 2.5 Binden eines Knotens um das Rohr im Inneren der Luftröhre platziert; zuführen zweiten kraniale Fixierung des Rohres in der Haut, um ein versehentliches Depositioning (Figur 1J, K) zu vermeiden. </li><li> Dichtung geschnitten mit Gewebekleber (beispielsweise n-Butyl-2-Cyanoacrylat) (Abbildung 1 l). </li><li> Fixieren Sie Rohr an der Spitze mit Klebeband. </li></ol> 3. Laparatomie (15-20 min) <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf Heizkissen zu Unterkühlung zu verhindern. Rasur Bauch, entfernen Sie vorsichtig das Haar aus der Haut. Desinfizieren Sie rasierte Haut und Fell, indem Povidoniod Lösung. </li><li> Führen Sie eine kleine Haut unterhalb des Brustbeins mittels chirurgischer Scheren (2A) geschnitten. Erweitern Sie den Schnitt seitlich unterhalb der Rippen für beide Seiten, Kauterisieren alle sichtbaren Blutgefäße, um Blutungen zu verhindern. </li><li> Einen kleinen Schnitt an der Linea alba unterhalb des Brustbeins sorgfältig durchzuführen, das Öffnen der Bauchfell (2B). Erweitere Schnitt auf beiden Seiten mit cauterization Blutungen (2C, D) zu verhindern. </li><li> Zeigen Maus in Agarose Bühne Schale (2E). Platzieren Stapel in geeigneter Höhe auf beiden Seiten der Maus (in der Regel 12-14 Deckgläschen) (2F). </li><li> Zeigen Atemtriggersensor unter Nackenbereich, damit das Mikroskop mit der Atmung zu synchronisieren. Aktivieren Auslöseeinheit (2G). </li><li> Zeigen chirurgischen Faden (5-0) durch das Brustbein zu Rippen (2I) zurückzuziehen. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig Bandanschluss Leber und Zwerchfell (Ligamentum falciforme) sowie Leber und Magen-Darmtrakt mit gebogenen chirurgische Scheren. Schneiden Sie das Ligamentum falciforme bis zur Aorta (2J). </li></ol> 4. Sample Setup (10-15 min) <ol><li> Platzieren der Maus auf der rechten Seite mit einem Winkel von 45 ° zum einfachen Zugriff auf große Leberlappen. </li><li> Fügen Inszenierung Brücke unterhalb der Rippen, für den BauchHöhle. Herstellung einer Brücke mit Hilfe eines Standard-Deckglas mit Klebeband Beschichtung auf scharfe Kanten (Abbildung 2 K) zu decken. </li><li> Legen Sie großen Leberlappen auf der Bühne. Vorsichtig rutschen Doppelkugel Stift-Sonde oder eine gepolsterte Spatel unterhalb der Leber und halten Sie die Spitze des Organs mit einem feuchten Wattestäbchen oder Feuchtgewebe. Heben Lappen auf den Objektträger und gelten sanften Widerstand. Lobe gebogen oder gefaltet werden. Geben Sie besonders darauf, nur sanfte Manipulation der Leber (Abbildung 2 l). </li><li> Platzieren seitlichen Stütz Einsätze, beispielsweise Stapel von kleinen Deckplättchen (20 mm x 20 mm), der etwa auf gleicher Höhe der Leberlappen daneben Abdecküberzug zu unterstützen. </li><li> Legen Sie großen Deckglas (24 mm x 50 mm) an der Leberlappen. Stellen Sie sicher, dass die Deckglas wird möglichst horizontal (Abbildung 2 M) ausgerichtet ist. HINWEIS: Das Deckglas sollte in Kontakt mit dem Gewebe, ohne zu quetschen. Überprüfen auf sichtbare Beeinträchtigung des Blutflusses (weiße Gewebe). Wenn MICROCIRCulation gestört ist, fügen Sie weitere Unterstützung Einsätze. </li><li> * Platz zwei unabhängige intraperitoneale Katheter (Abbildung 2 N) für langfristige Anästhesie und G-5-Anwendung. Installieren Katheter seitlich im Unterbauch neben den hinteren Gliedmaßen. HINWEIS: Die intraperitoneale Katheter können self-made durch Anschluss 27 G Nadeln mit flexiblen Silikonschlauch (Abbildung 3). </li><li> * Fixieren Nadel mit einer Schleife von 5-0 chirurgischen Faden auf der Haut, um eine versehentliche Verschiebung zu vermeiden. </li><li> * Bringen Sie Spritzenpumpe mit Anästhesie-Lösung I mit dem Katheter 1, Durchflussmenge von 0,2 ml / h; befestigen Spritzenpumpe mit G-5 zum Katheter 2, eingestellt Flussrate von 0,1 ml / h. </li></ol> 5. Maus-Überwachung <ol><li> * Ort EKG-Elektroden in einen vorderen und hinteren Extremitäten (4A). </li><li> * Bringen Sie Ablaufschlauch bis 2 Niveausensor CO. </li><li> In externen Temperatursensor, um Heizkissen verbunden (4C). </li></ol> 6. Embedding und Gewebefixierung (5-10 min) <ol><li> Bereiten 100 ml 3% (w / v) Agarose in 1x PBS. Einbetten Leber, wenn die Temperatur auf 41 ° C unter Verwendung einer 5 ml-Spritze und einer 18 G-Nadel (5A). </li><li> Strömen restliche Agarose auf Deckglas oder in der Maus (5B, C). Warten Sie, bis Agarose vollständig verkleistert wird. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Agarose mit dem Heidemannspatel, die Vorbereitung einer View groß genug, um die vorbereitet Leberlappen (5D, E) zu scannen. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Übertragen Sie die Maus in Mikroskop Klimakammer. </li><li> Fügen Sie 50-100 ml 1x PBS (vorgewärmt auf 37 ° C). </li><li> Bedecken Sie Probenschale zu verhindern Verdampfung (5F). </li><li> * Reduzieren inhalative Isofluran bis 0,5 Vol% (v / v). </li><li> * Start Monitoring-Software, Aufzeichnung EKG, Herzfrequenz und exspiratorische CO 2. </li><li> Starten Bildgebung: la öffnenser Läden, identifizieren Ansicht Interessengebiete definieren obere und untere Grenze für Z-Stapel, und starten Sie Zeitrafferaufnahmen. Nachstellen Z-Stapel, falls erforderlich, Z-Drift zu korrigieren (z. Aufgrund von Änderungen im Blutdruck oder Temperaturschwankungen, Figur (5G). HINWEIS: Nach Abschluss der Bildperiode oder wenn der Kreislauf oder Betäubung des Tiers wird instabil, opfern Mäuse durch Genickbruch (ohne Erwachen aus der Narkose). </li></ol>

<ol><li>Dusseaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MAIT+cells+are+xenobiotic-resistant%2C+tissue-targeted%2C+CD161hi+IL-17-secreting+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells.</a> Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).</li>
<li>Reese, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypoxia+on+liver+secretion+studied+by+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy.</a> Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).</li>
<li>Bhathal, P. S., Christie, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+study+of+bile+ductule+proliferation+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs.</a> Gut. 10 (11), 955(1969).</li>
<li>Stefenelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+vascular+system+and+microcirculation+of+the+rat+liver+in+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wien+Klin+Wochenschr%22%5BJournal%5D)">Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy.</a> Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sure+methodology+for+massive+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse.</a> Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+dual-colored+visualization+of+colorectal+liver+metastasis+in+living+mice+using+two+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).</li>
<li>Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+injury+is+dramatically+increased+by+gentle+liver+manipulation+during+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest.</a> Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).</li>
<li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+Kupffer+cells+cause+a+hypermetabolic+state+after+gentle+in+situ+manipulation+of+liver+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).</li>
<li>Toiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+DSS-induced+cecal+mucosal+damage+in+GFP-transgenic+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy.</a> J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).</li>
<li>Zimmon, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+vasculature+and+its+response+to+hepatic+injury%3A+a+working+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis.</a> Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).</li>
<li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).</li>
<li>Bonder, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+neutrophil+recruitment+to+the+liver+in+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).</li>
<li>Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fluorescence+excitation%3A+new+spectral+windows+for+biological+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Amore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+reveals+marked+thioflavine-S-associated+alterations+in+neurite+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).</li>
<li>Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+inflammatory+leukocyte+recruitment+in+kidney%2C+lung+and+liver--challenges+to+the+multi-step+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm.</a> Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).</li>
<li>McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+specifically+associated+with+thioflavine+S-positive+amyloid+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy.</a> J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+Immune+Surveillance+by+CXCR6%2B+NKT+Cells+Patrolling+Liver+Sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids.</a> PLoS Biology. 3 (4), (2005).</li>
<li>Velázquez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+activation+by+innate+cytokines+or+microbial+antigens+can+cause+arrest+of+natural+killer+T+cell+patrolling+of+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids.</a> J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).</li>
<li>Wehr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR6-dependent+hepatic+NK+T+Cell+accumulation+promotes+inflammation+and+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis.</a> J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).</li>
<li>Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+contribute+to+postischemic+liver+injury+in+mice+by+interacting+with+sinusoidal+endothelium+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets.</a> Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+T+cell+dynamics+during+the+development+and+disintegration+of+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+donovani-induced+expression+of+signal+regulatory+protein+alpha+on+Kupffer+cells+enhances+hepatic+invariant+NKT-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation.</a> Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330 (6002), 362-366 (2010).</li>
<li>Vanheule, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravital+microscopic+study+of+the+hepatic+microcirculation+in+cirrhotic+mice+models%3A+relationship+between+fibrosis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis.</a> Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).</li>
<li>Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance by the liver.</a> Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+chemokine+pathways+and+immune+cell+infiltration+as+a+novel+therapeutic+approach+in+liver+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).</li>
<li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li>
<li>Karlmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+recruitment+of+the+inflammatory+Gr1%2B+monocyte+subset+upon+liver+injury+promotes+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+macrophage+migration+and+differentiation+critical+for+liver+fibrosis+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+C-C+motif+chemokine+receptor+8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice.</a> Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).</li>
<li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Ly-6C+expression+identifies+the+recruited+macrophage+phenotype%2C+which+orchestrates+the+regression+of+murine+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).</li>
<li>Moles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TLR2%2FS100A9%2FCXCL-2+signaling+network+is+necessary+for+neutrophil+recruitment+in+acute+and+chronic+liver+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse.</a> J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).</li>
<li>Hammerich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CCR6-dependent+accumulation+of+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+injured+liver+restricts+hepatic+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis.</a> Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).</li>
<li>Syn, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT-associated+hedgehog+and+osteopontin+drive+fibrogenesis+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+CD44+and+hyaluronan+is+the+dominant+mechanism+for+neutrophil+sequestration+in+inflamed+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids.</a> J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li>
<li>Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+microcirculation+in+murine+sepsis%3A+role+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Surg+Int%22%5BJournal%5D)">Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes.</a> Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).</li>
<li>Khandoga, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS One. 4 (3), e4693(2009).</li>
</ol>

Die Autoren legen keinen Interessenkonflikt offen.

Das Ziel unserer Studie war es, eine hoch standardisierte, stabile und reproduzierbare Methode zur intravital TPLSM Bildgebung der Leber zu entwickeln. Intravital Imaging im Allgemeinen hat wertvolle Einblicke in das Zellverhalten unter realen Bedingungen folgenden Referenzfahrt und der Interaktion verschiedener Leukozyten-Populationen in der Entwicklung, Homöostase und Krankheit gegeben. Die etwas schwierig anatomischen Position der Leber, durch die Atemwege und peristaltische Darmbewegung direkt an die Leber sowie ihr...

Die Visualisierung von Zellen und Zellfunktionen in ganzer Organe oder ganze Organismen von großem Interesse für mehr als 50 Jahren, darunter nahezu alle Teile des Körpers 2. Daher sind einige frühe Studien bereits intravital Bildgebung der Leber 3,4 eingesetzt. Es gibt jedoch einige Einschränkungen auf dem neuesten Stand in Bezug auf langzeitstabil hochauflösende Bildgebung von Lebergewebe. Aufgrund der anatomischen Position der Leber in engem Kontakt mit der Membran und dem Gastrointestinaltrakt 5, das häufigste Problem für mikroskopische intravitalen Bildgebung Bewegung aufgrund der Atmung und, in geringerem Maße, Peristaltik des Verdauungstraktes 6. Im Vergleich zu anderen soliden Organen, ist die Leberchirurgie eine besondere Herausforderung. Aufgrund der dichten mikrovaskuläre Struktur kann chirurgische Manipulation zu massiven hämorrhagische Läsionen führen, Mikrozirkulationsstörungen 7 und auch die Aktivierung der ansässigen immune Zellen, wie Kupffer-Zelle 8. Daher mechanische Fixierung des Gewebes wie anderswo veröffentlicht 6,9 ist wahrscheinlich mit dem Intravitalmikroskopie Abbildungs ​​stören. In einer gesunden Leber, 10-15% des Gesamtblutvolumens befindet sich innerhalb der Leber Gefäßsystem und das Organ erhält etwa 25% des Gesamtherzleistung 10, wodurch das Organ sehr anfällig für Veränderungen in der Blutzirkulation (zB Blutdruckschwankungen ). Daher werden Störungen in der Leberdurchblutung aufgrund zB Schubspannung, Vertreibung, Verletzungen, die durch eine übermäßige Gewebebehandlung oder zentrale Zirkulation künstliche Veränderungen der Leukozyten Zugverhalten, eingeschränkter Lebersauerstoffversorgung und damit weitere Leberschäden sowie führen, beeinflussen Leber Immunreaktionen als Organkonservierung und die Gesamtlebenszeit des Tieres. Frühe mikroskopischen Untersuchungen wurden an Intravital Epifluoreszenz mi basiertMikroskopie, aber einige technische Einschränkungen wie Fotobleichung und geringe Eindringtiefe begrenzen den Einsatz dieser Technik für die langfristige Leber-Bildgebung 4,11,12. Mit der Entwicklung der Multiphotonen-Mikroskopie in den 1990er Jahren wurden die Grenzen der Fotobleichung oder Eindringtiefe im Wesentlichen gelöst, wie diese neue Methode technisch in der Lage, um bildgebende Studien in nahezu allen Organen unter realen Situationen 13-15 durchzuführen war. Jedoch sind die Haupt verbleibenden Herausforderungen bezüglich Bildgebung der Leber waren: Atembewegung, Autofluoreszenz von Lebergewebe, die Sicherung unveränderten Durchblutung der Leber-Sinusoiden und besonders stabile Bildgebung für längere Zeiträume von mehreren Stunden 16. Obwohl mehrere Studien behandelt die Funktion und die Wanderung von verschiedenen Leukozyten in der Leber 17, zB NKT-Zellen 18-20, T-Zellen 21,22, Leber Makrophagen oder Neutrophile 23,24 25, langfristige Multi microscopy Abbildungs ​​noch nicht erfolgreich hergestellt wurde, die Aufgabe noch schwieriger bei Tieren mit akuten oder chronischen Lebererkrankung aufgrund der vorhandenen Schäden und damit eine höhere Anfälligkeit für weitere Schäden 26. Allerdings, Überwachungs- Zugverhalten und zelluläre Funktion von Leukozyten in der Leber und in Echtzeit ermöglicht neue Einblicke in ihre jeweilige Rolle bei Leber Homöostase und Krankheits 27. Das Chemokinrezeptor CXCR6 an mehreren Lymphozytensubsets, einschließlich natürlicher Killerzellen (NK), NKT-Zellen und einige T-Zell-Populationen 18,28 ausgedrückt. Frühere Studien an Mäusen haben gezeigt, dass CXCR6 und ihre zugehörigen Liganden CXCL16 kann die Patrouillen der NKT-Zellen auf Lebersinusoide während Homöostase steuern. Folglich ist die Verwendung von CXCR6.gfp Mäusen (Tragen einer Knock-in-der Green Fluorescent Protein [GFP] im CXCR6 Locus) ist beschrieben worden, um die Migration von Lymphozyten in verschiedenen Organen, wie Gehirn 29 zu untersuchenund auch Leber 18,20 und zeigt bei Entzündungen erhöht Infiltration CXCR6.gfp Zellen. Mit dem in dieser Studie zur Verfügung gestellten Verfahren war es möglich, diese Prozesse über einen langen Zeitraum unter stabilisierten Bedingungen zu folgen. Die Intravitalmultiphotonen-basiertes Verfahren erlaubt Bildgebung, die in hohem Maße reproduzierbar mit minimaler Störung des Tieres und der Orgel; optimiert für die langfristige Überleben der Tiere durch umfangreiche Überwachungs gefolgt von genaue Kontrolle der Atmung und Kreislauf; und hoch flexibel und leicht auch auf andere parenchymatösen Organen wie Niere oder Milz erlassen.

<table><tbody><tr><td>Anästhetika</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Rotex Medica</td><td>Gebühr: 30819</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Anästhesiesystem</td><td>Harvard Apparatur</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>Glukose 5%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Isoflurane Vapor) Verdampfer</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Isotonische (0,9%) NaCl Lösung</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 10%</td><td>ceva</td><td>Füllung: 36217/09</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin 2%</td><td>medistar</td><td>Füllung: 04-03-9338/23</td><td></td></tr><tr><td>Verbrauchsmaterial</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spritze</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyerkolben</td><td>Schott Duran</td><td>21 226 36</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Becher 2x</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Spritze</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl Naht</td><td>Ethicon</td><td>V7980</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>handelsüblich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen Eye und Nasensalbe</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Deluxe High-Temp Kauterset</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 24x50 mm</td><td>ROTH</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>Durapore Seidenband</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Feder Einwegskalpell</td><td>Feder</td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch mit feiner Bohrung 0,58 mm ID</td><td>Smiths medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>5x 0,5 ml</td></tr><tr><td>Leukoplast</td><td>BSN Medical Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>ROTH</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Alcohol Haut&hellip; farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Nadel 18 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Nadel 27 3/4 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Seidenpapier</td><td>handelsüblich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amalgam Polierer 3PL</td><td>Gatz</td><td>0110?</td><td></td></tr><tr><td>Blair Retraktoren (4 Zacken (stumpf)) x2</td><td>Storz& Klein</td><td>S-01134</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Nr. 7 Pinzette</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Zange gebogen x1</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Zange gerade x2</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Heidemann Spatel HD2</td><td>Stoma</td><td>2030.00</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Semken Zange</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische Schere, gebogen</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische Schere gerade</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Zange mit Standardmuster</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Geräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EKG-Triggereinheit</td><td>Rapid Biomedical</td><td>3000003686</td><td></td></tr><tr><td>MICROCAPSTAR Endtidaler Kohlendioxid-Analysator</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minivent Typ 845</td><td>Harvard Apparatur</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskop Trimskop I</td><td>LaVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Compact</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 8-Kanal-Rekorder</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturgesteuertes Heizkissen</td><td>Sygonix</td><td>26857617</td><td></td></tr><tr><td>Temperatursensor</td><td>kommerziell erhältlich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperaturgesteuertes System für Mikroskope -Cube & Box</td><td>Life Imaging-Dienstleistungen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

langzeitintravital multiphotonen mikroskopie imaging von immunzellen in gesunden und kranken leber mit cxcr6.gfp reporter mäuse

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

<html> Leberentzündung als Reaktion auf eine Verletzung ist ein hochdynamischer Prozess, der die Infiltration von verschiedenen Subtypen von Leukozyten einschließlich Monozyten, Neutrophile, T-Zellen-Untergruppen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und die NKT-Zellen. Intravitalmikroskopie an der Leber zur Überwachung Immunzellmigration ist besonders herausfordernd aufgrund der hohen Anforderungen an die Probenvorbereitung und die Fixierung, die optische Auflösung und die langfristige Überleben des Tieres. Dennoch könnte die Dynamik von entzündlichen Prozessen sowie zellulären Interaktionsstudien kritische Informationen, um die Initiation, Progression und Regression von entzündlichen Lebererkrankungen besser zu verstehen ist. Daher wurde eine hochempfindliche und zuverlässiges Verfahren eingerichtet, um die Migration und Zell-Zell-Wechselwirkungen von verschiedenen Immunzellen in Mausleber über lange Zeiträume (ca. 6 h), die durch intravitale Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) in Kombination mit Intensiv studieren Überwachung. ent &quot;&gt; enthält die vorgesehenen Verfahren eine schonende Zubereitung und stabile Fixierung der Leber mit minimaler Störung des Organs, langfristig intravital Bildgebung mit Mehrfarben-Multiphotonen-Mikroskopie praktisch ohne Bleichen oder phototoxische Effekte über einen Zeitraum von bis zu 6 Stunden, so dass Tracking- spezifischer Leukozytenuntergruppen und stabile Bilderzeugungsbedingungen durch umfangreiche Überwachung Maus Vitalparameter und Stabilisierung der Zirkulation, Temperatur und Gasaustausch. Lymphozytenmigration auf Leberentzündung untersuchen CXCR6.gfp Knock-in-Mäusen wurden intravitalen Bildgebung der Leber unter Ausgangsbedingungen und nach akuter und chronischer Leberschädigung durch intraperitoneale Injektion (en) von Kohlenstofftetrachlorid (CCl 4) verursacht wird, ausgesetzt. CXCR6 ein Chemokin-Rezeptor auf Lymphozyten exprimiert, hauptsächlich auf Natural Killer T (NKT) -, natürliche Killer (NK) - und Untergruppen von T-Lymphozyten, wie CD4-T-Zellen, sondern auch Schleimhaut associATED invariant (MAIT) T-Zellen ein. Im Anschluss an die Migrationsmuster und die Positionierung der CXCR6.gfp + Immunzellen erlaubt einen detaillierten Einblick in ihr verändertes Verhalten auf Leberschäden und damit ihre mögliche Beteiligung im Fortschreiten der Krankheit.

Um unsere Intravital TPLSM Ansatz zu validieren, die wir ausgesetzt CXCR6 gfp / + Mäuse Intravital TPLSM Bildgebung. Die Mäuse wurden entweder unbehandelt als Ausgangskontrollen oder auf eine einzelne intraperitoneale Injektion von Tetrachlorkohlenstoff (CCl 4) unterzogen, um akute Leberschäden 20 zu induzieren. Videosequenzen wurden über einen Zeitraum von 2-5 h auf Grund ihrer grünen Fluoreszenz aufgenommen, und die Zellen wurden über die Zeit verfolgt. Um ...

Die stabile intravitale hochauflösende Bildgebung von Immunzellen in der Leber ist eine Herausforderung. Hier bieten wir eine hochempfindliche und zuverlässige Methode zur Untersuchung der Migration und Zell-Zell-Interaktionen von Immunzellen in der Leber von Mäusen über lange Zeiträume (ca. 6 Stunden) mittels intravitaler Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopie in Kombination mit intensivmedizinischem Monitoring.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Migration und Interaktion von Leukozyten bei fortschreitender entzündlicher Lebererkrankung zu verfolgen. Um die Abfolge der Ereignisse besser zu verstehen, die der Rekrutierung dieser Zellen in das Lebergewebe zugrunde liegen, und um deren potenzielle Beteiligung an der Immunpathologie aufzuklären, wird zunächst eine Tracheotomie durchgeführt, um die Atmung der Maus zu kontrollieren – ein entscheidender Schritt, um das Langzeitüberleben des Tieres sicherzustellen.Als zweiter Schritt wird beim Mäuschen eine Laparotomie durchgeführt, um die Leber chirurgisch freizulegen und so den Zugang zum Organ mit dem Multiphotonen-Mikroskop zu ermöglichen. Anschließend wird die Leber fixiert und positioniert, indem sie in ein Gel eingebettet wird, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Die Bildaufnahme kann über mehrere Stunden erfolgen, wodurch hochauflösende Zeitrafferaufnahmen entstehen, die die Veränderungen in Rekrutierung, Positionierung und Interaktion einzelner Leukozyten verfolgen.Bei der Entstehung von Leberentzündungen kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der akuten und chronischen Leberentzündung zu beantworten, wie beispielsweise die Rekrutierung von Leukozyten, Zell-Zell-Interaktionen oder Mechanismen der Immunpathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zur konventionellen Mikroskopie liegt darin, dass die multifokale Mikroskopie Langzeit-Aufnahmen mit praktisch keiner Störung der Probe ermöglicht, bei geringer Farbstoffbleiche oder Phototoxizität sowie optischen Schnitten bis zu einer Tiefe von 100 Mikrometer im Gewebe – dies liegt an der einzigartigen Physik des Lasers mit Licht im fernen Rotbereich. Diese Methode kann somit Einblicke in Lebererkrankungen liefern.Sie kann leicht auf andere Systeme übertragen werden. Da die Methode der Stabilisierung und Fixierung das Gewebe nahezu für alle Fragestellungen der intravitale Mikroskopie geeignet macht, lassen sich Organe wie Milz, Niere oder sogar subkutane Tumore unter Verwendung fluider verbundener Zellen problemlos abbilden. Es ist ebenfalls möglich, alle Leukozyten-Subpopulationen zu visualisieren und ihre Wechselwirkungen sowie Leberentzündungen zu untersuchen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der extremen Komplexität der Kleintierchirurgie Schwierigkeiten haben. Aufgrund unserer eigenen Erfahrung ist dies jedoch nur für einige Wochen ein einschränkender Faktor und erfordert lediglich etwas praktische Routine. Aufgrund der Zerbrechlichkeit des Lebergewebes sind die Präparationsschritte schwer zu erlernen, und eine visuelle Demonstration der Methode ist unerlässlich. Nachdem Sie die Anästhesie vorbereitet haben, füllen Sie die Mausarosphase mit 3 % Aros, wobei Sie es in einem Winkel von 40 Grad hinzugießen.Danach sicherstellen, dass der chirurgische Arbeitsbereich vollständig desinfiziert ist, ebenso wie alle erforderlichen Instrumente und sonstigen Utensilien. Anschließend das Maus mit einer intraperitonealen Injektion eines Anästhetikum-Cocktails narkotisieren. Fünf Minuten später die Reflexe des Tieres überprüfen, die Haut desinfizieren und Augensalbe auf die Augen auftragen.Befestigen Sie nun die Maus am Präparationstisch. Positionieren Sie sie mit Hilfe von Klebeband so, dass die Bauchseite freiliegt und der Hals sanft überstreckt wird. Dies kann auch mithilfe eines Gummibands, das an den Schneidezähnen befestigt wird, erreicht werden.Führen Sie nun einen initialen Schnitt unterhalb des Kinns von etwa 0,5 bis einem Zentimeter Länge durch. Danach dissezieren Sie vorsichtig das Bindegewebe zwischen den Speicheldrüsen und suchen die muskuläre Röhre, die die Luftröhre umgibt. Reißen Sie den Muskel vorsichtig, um die Luftröhre freizulegen.Ziehen Sie einen Faden unter die Luftröhre, öffnen Sie dann die Luftröhre mit einer mikrochirurgischen Schere mittels eines T-förmigen Schnitts in den Schnitt. Führen Sie die Beatmungssonde etwa einen halben Zentimeter ein. Schieben Sie die Sonde mit kleinen anatomischen Pinzetten vorwärts.Dann befestigen Sie das Röhrchen mit Nähten. Zur zusätzlichen Sicherung nähen Sie das Röhrchen an der Haut fest, verschließen Sie den Hautschnitt mit Cyanoacrylat und sichern Sie das Röhrchen am Kopf des Tieres. Unter Verwendung von Klebeband wird die Anästhesie durch einen kontinuierlichen Fluss von 2% Iso-Fluoran aufrechterhalten.Nach der Vorbereitung der Maus für die Operation einen kleinen Hautschnitt unterhalb des Brustbeins vornehmen und den Schnitt beidseitig seitlich unterhalb der Rippen verlängern. Alle sichtbaren Blutgefäße während dieses Vorgangs kauterisieren. Um die Blutung zu minimieren, einen kleinen initialen Schnitt am linearen Ellbogen durchführen, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.Verlängern Sie den Schnitt horizontal, verschließen Sie alle Blutgefäße und gewinnen Sie so Zugang zur Leber. Bringen Sie die Maus nun auf die Arbeitsbühne und stapeln Sie Objektträger auf beiden Seiten des Tieres, um es an Ort und Stelle zu halten. Diese Stapel sollten die Höhe der Maus erreichen, damit die später platzierte Unterlage für die Leber nicht mit übermäßigem Druck auf den Bauchraum wirkt.Jetzt mit Nähten am Brustbein die Rippen zurückziehen. Eine 4-0-Naht ist ausreichend. Nach dem Zurückziehen der Rippen die Bänder durchtrennen, die Leber und Zwerchfell verbinden, und bis zur Aorta durchschneiden, jedoch mit besonderer Vorsicht arbeiten, um den Gefäßverband nicht zu rupturieren oder zu verletzen. Außerdem das Band durchtrennen, das die Leber mit dem Magen-Darm-Trakt verbindet.Drehen Sie die Maus um 45 Grad, um einen besseren Zugang zum größeren Leberlappen zu erhalten. Nehmen Sie einen normalen Deckgläser und kleben Sie ihn an den Kanten fest, sodass er nicht scharfkantig ist. Legen Sie ihn über die Bauchhöhle.Dies dient als Unterlage, um die Leber darauf zu platzieren. Führen Sie vorsichtig eine Doppelspitzen-Tastsonde oder einen gepolsterten Spatel unter die Leber ein und halten Sie die Oberseite des Organs fest. Da durch mechanischen Druck mit einem feuchten Tuch die Lebergewebe sofort beschädigt werden können, ist es unerlässlich, das Organ sorgfältig zu behandeln.Heben Sie dann das Läppchen auf den Objektträger und ziehen Sie es vorsichtig zurecht. Das Läppchen wird normalerweise leicht gebogen oder gefaltet sein; versuchen Sie, die Ränder vorsichtig auseinanderzufalten, indem Sie das Gewebe mit einem dünnen Spatel oder einem feuchten Tuch anheben. Fügen Sie anschließend seitliche Stützen in Form von Deckgläsern oder Objektträgern hinzu.Stapeln Sie die Deckgläser so, dass sie die gleiche Höhe wie der Leberlappen haben. Die Positionierung und Fixierung der Leber ist der wichtigste Schritt im Protokoll. Mechanische Belastungen, Torsionen oder Druck führen sofort zu Gewebeschäden oder zumindest zu einer beeinträchtigten Durchblutung der sinusoidalen Gefäße.Legen Sie nun ein großes Deckglas mit abgeklebten Kanten über den Leberlappen, der von den seitlichen Halterungen gestützt wird. Positionieren Sie dieses Deckglas so waagerecht wie möglich. Es sollte die Leber nicht zusammendrücken.Weißes Gewebe weist auf eine beeinträchtigte Durchblutung hin, es sei denn, die Bildgebung erfolgt sehr schnell. Nun müssen zwei unabhängige intraperitoneale Katheter eingesetzt werden, um eine Langzeitanästhesie bereitzustellen und G fünf anzuwenden. Diese bestehen aus 27-Gauge-Nadeln und flexiblen Silikonröhrchen. Dann starten Sie den Fluss mithilfe von Spritzenpumpen. Führen Sie die Katheter in den unteren Bauchbereich nahe den Hintergliedmaßen ein. Nachdem Sie die lebenswichtigen Überwachungsgeräte am Maus angebracht haben, bereiten Sie 100 Milliliter 3 % Aros in einem XPBS vor.Wenn das Agarose auf 41 Grad Celsius abgekühlt ist, wird die Leber mit einer Fünf-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel darin eingebettet. Sobald die Agarose abgekühlt ist, wird der Überschuss mit einem Heidemann-Spatel entfernt, um ein ausreichend großes Sichtfeld freizulegen, um die Leber scannen zu können. Danach wird mit dem Scannen fortgefahren.Nachdem das Sichtfeld vorbereitet wurde, bewegen Sie die Maus unter dem Mikroskop, um geeignete Scannbereiche für die Zeitrafferaufnahme auszuwählen. Das Lebergewebe wird visuell mithilfe einer externen weißen Lichtquelle abgesucht, um repräsentative Felder mit ausreichendem Blutfluss und minimaler Probendestörung zu identifizieren. CXCR6 GFP heterozygote Mäuse wurden einer intravitale T-P-L-S-M-Aufnahme als Experiment unterzogen. Einigen wurde eine intraperitoneale Injektion von Tetrachlorkohlenstoff verabreicht, um eine akute Leberschädigung zu induzieren.Modale Zellen, die GFP exprimierten, wurden per Video verfolgt, und ihre Bewegungsbahnen wurden überlagert, um einen Überblick über die zelluläre Mobilität zu erhalten. Anschließend wurden die Bahnen normalisiert. In normalen Lebern zeigten die Zellen zufällige Migrationsmuster.Lebern, die mit CCI vier injiziert wurden, zeigten eine Beeinträchtigung der Zellmigration. Bei der Messung der Gesamtverschiebung von ihrem Ursprung aus war deutlich, dass 36 Stunden nach der CCI-vier-Behandlung am Ort des hepatocellulären Schadens eine Zellfixierung auftrat. Die beeinträchtigte Migration aufgrund der Leberschädigung konnte ebenfalls gezeigt werden, indem die Migrationsgeschwindigkeit einzelner Zellen über die Zeit aufgetragen wurde, was eine teilweise Arrestierung nach 18 Stunden und eine vollständige migratorische Arrestierung nach 36 Stunden zeigte.Die Verringerung der Geschwindigkeit der wandernden Zellen konnte ebenfalls statistisch signifikant nachgewiesen werden, wenn die Zellen als Populationen verglichen wurden. Somit eignet sich dieser Ansatz zur Verfolgung von Veränderungen in der Zellmigration und -positionierung bei der Entwicklung von Lebererkrankungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Leber einer Maus für die intravitale Multifotonenmikroskopie vorbereitet.Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es uns, das Tier für eine langfristige Überlebensfähigkeit zu stabilisieren und Bewegungsartefakte aufgrund der schonenden Fixierungsmethode zu minimieren. Einmal maskiert, kann diese Technik innerhalb von etwa einer Stunde durchgeführt werden, sofern sie korrekt angewendet wird. Während dieses Vorgangs ist es wichtig, die Vitalparameter des Tieres zu überwachen – insbesondere Temperatur, Herzfrequenz, Sauerstoff- und CO2-Spiegel. Dies kann erreicht werden, indem die Tiefe der Narkose und die Atmung entsprechend angepasst werden.Andere Verfahren wie die Durchflusszytometrie-Analyse oder die Laser-Mikrodissektion können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zum Phänotyp der eindringenden Immunzellen oder zu Mediatoren, die von Gewebe- oder eindringenden Zellen nach ihrer Entwicklung sezerniert werden. Diese Techniken ermöglichten es Forschern, Einblicke in die Dynamik des Leukozytenverkehrs und zellulärer Interaktionen in der Leber zu gewinnen und die Abfolge der Ereignisse, die zu entzündlichen Lebererkrankungen führen, aufzuschlüsseln. Befolgen Sie bitte die Lasersicherheitsrichtlinien, wenn Sie Bildaufnahmen mit einem Infrarotlaser mit hochenergetischen Pulsen durchführen, der für die Multiphotonenmikroskopie verwendet wird.Stellen Sie sicher, dass keine Reflexion der Laserstrahlung während des Experiments eine Gefahr für Ihre Augen und Haut darstellt.

long-term-intravital-multiphoton-microscopy-imaging-immune-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden...

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Dieser Artikel berichtet über eine detaillierte Methode zur dynamischen Messung und Quantifizierung der Blutflussgeschwindigkeit in einzelnen Blutgefäßen des Lebergefäßsystems der Maus unter Verwendung der intravitalen mikroskopischen Bildgebung in Kombination mit einer spezifischen Methodik zur Bildaufnahme und -analyse.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom.

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Wir haben eine neuartige chirurgische Protokoll für die zwei-Photonen-Bildgebung live Mäuse Leber mit minimaler Invasion. Mit dieser Technik haben wir die detaillierte Struktur der Leber während Lipopolysaccharid-induzierte Endotoxämie identifiziert. Wir erwarten, dass diese Methode verwendet werden, kann um die Wirksamkeit der verschiedenen Reagenzien Behandlung zur hepatischen Leukozyte Migration zu bestimmen.

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

In diesem Experiment wird eine Maus in ihre Schwanzvene mit Rhodamine B Isothiocyanat-Dextran injiziert, die Blutgefäße färben können. Nachdem die Leber exponiert und fixiert wurde, kann ein bestimmter Teil der Leber ausgewählt werden, um das tiefe Gewebe im lebenden Körper mittels Multiphotonenmikroskopie zu beobachten.

Multiphotonmikroskopische Beobachtung von Gefäßen im Mauslebergewebe

Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.

Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Hier beschreiben wir eine Plattform, die die nicht-invasive In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden ermöglicht, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden. Der Arbeitsablauf reicht von der Erzeugung von Sphäroiden aus primären Leberzellen über die Transplantation in das Mausauge bis hin zur In-vivo-Bildgebung mit zellulärer Auflösung durch konfokale Mikroskopie.

In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Bildgebende Pipeline, um die Morphologie hepatischer Stellatenzellen im intakten Lebergewebe zu visualisieren und zu modellieren. Dieser Ansatz kombiniert fluoreszierende Markierung von Fibroblasten mittels Mausgenetik, in situ leberperfusionsbasierte Gewebevorbereitung und eine modifizierte iDISCO-Gewebereinigungsmethode, um optische Transparenz zu erreichen.

Kartierung der Morphologie hepatischer stellater Zellen in Mausmodellen der Leberfibrose

Erfahren Sie die Langzeitintravital-Multiphotonenmikroskopie zur Beobachtung von Leukozytenmigration und -interaktionen in der Leber bei CXCR6.Gfp-Reportermäusen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung über mehrere Stunden.

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

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