Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Migration und Interaktion von Leukozyten bei fortschreitender entzündlicher Lebererkrankung zu verfolgen. Um die Abfolge der Ereignisse besser zu verstehen, die der Rekrutierung dieser Zellen in das Lebergewebe zugrunde liegen, und um deren potenzielle Beteiligung an der Immunpathologie aufzuklären, wird zunächst eine Tracheotomie durchgeführt, um die Atmung der Maus zu kontrollieren – ein entscheidender Schritt, um das Langzeitüberleben des Tieres sicherzustellen.

Als zweiter Schritt wird beim Mäuschen eine Laparotomie durchgeführt, um die Leber chirurgisch freizulegen und so den Zugang zum Organ mit dem Multiphotonen-Mikroskop zu ermöglichen. Anschließend wird die Leber fixiert und positioniert, indem sie in ein Gel eingebettet wird, um Bewegungsartefakte zu minimieren. Die Bildaufnahme kann über mehrere Stunden erfolgen, wodurch hochauflösende Zeitrafferaufnahmen entstehen, die die Veränderungen in Rekrutierung, Positionierung und Interaktion einzelner Leukozyten verfolgen.

Bei der Entstehung von Leberentzündungen kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der akuten und chronischen Leberentzündung zu beantworten, wie beispielsweise die Rekrutierung von Leukozyten, Zell-Zell-Interaktionen oder Mechanismen der Immunpathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zur konventionellen Mikroskopie liegt darin, dass die multifokale Mikroskopie Langzeit-Aufnahmen mit praktisch keiner Störung der Probe ermöglicht, bei geringer Farbstoffbleiche oder Phototoxizität sowie optischen Schnitten bis zu einer Tiefe von 100 Mikrometer im Gewebe – dies liegt an der einzigartigen Physik des Lasers mit Licht im fernen Rotbereich. Diese Methode kann somit Einblicke in Lebererkrankungen liefern.

Sie kann leicht auf andere Systeme übertragen werden. Da die Methode der Stabilisierung und Fixierung das Gewebe nahezu für alle Fragestellungen der intravitale Mikroskopie geeignet macht, lassen sich Organe wie Milz, Niere oder sogar subkutane Tumore unter Verwendung fluider verbundener Zellen problemlos abbilden. Es ist ebenfalls möglich, alle Leukozyten-Subpopulationen zu visualisieren und ihre Wechselwirkungen sowie Leberentzündungen zu untersuchen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der extremen Komplexität der Kleintierchirurgie Schwierigkeiten haben. Aufgrund unserer eigenen Erfahrung ist dies jedoch nur für einige Wochen ein einschränkender Faktor und erfordert lediglich etwas praktische Routine. Aufgrund der Zerbrechlichkeit des Lebergewebes sind die Präparationsschritte schwer zu erlernen, und eine visuelle Demonstration der Methode ist unerlässlich. Nachdem Sie die Anästhesie vorbereitet haben, füllen Sie die Mausarosphase mit 3 % Aros, wobei Sie es in einem Winkel von 40 Grad hinzugießen.

Danach sicherstellen, dass der chirurgische Arbeitsbereich vollständig desinfiziert ist, ebenso wie alle erforderlichen Instrumente und sonstigen Utensilien. Anschließend das Maus mit einer intraperitonealen Injektion eines Anästhetikum-Cocktails narkotisieren. Fünf Minuten später die Reflexe des Tieres überprüfen, die Haut desinfizieren und Augensalbe auf die Augen auftragen.

Befestigen Sie nun die Maus am Präparationstisch. Positionieren Sie sie mit Hilfe von Klebeband so, dass die Bauchseite freiliegt und der Hals sanft überstreckt wird. Dies kann auch mithilfe eines Gummibands, das an den Schneidezähnen befestigt wird, erreicht werden.

Führen Sie nun einen initialen Schnitt unterhalb des Kinns von etwa 0,5 bis einem Zentimeter Länge durch. Danach dissezieren Sie vorsichtig das Bindegewebe zwischen den Speicheldrüsen und suchen die muskuläre Röhre, die die Luftröhre umgibt. Reißen Sie den Muskel vorsichtig, um die Luftröhre freizulegen.

Ziehen Sie einen Faden unter die Luftröhre, öffnen Sie dann die Luftröhre mit einer mikrochirurgischen Schere mittels eines T-förmigen Schnitts in den Schnitt. Führen Sie die Beatmungssonde etwa einen halben Zentimeter ein. Schieben Sie die Sonde mit kleinen anatomischen Pinzetten vorwärts.

Dann befestigen Sie das Röhrchen mit Nähten. Zur zusätzlichen Sicherung nähen Sie das Röhrchen an der Haut fest, verschließen Sie den Hautschnitt mit Cyanoacrylat und sichern Sie das Röhrchen am Kopf des Tieres. Unter Verwendung von Klebeband wird die Anästhesie durch einen kontinuierlichen Fluss von 2% Iso-Fluoran aufrechterhalten.

Nach der Vorbereitung der Maus für die Operation einen kleinen Hautschnitt unterhalb des Brustbeins vornehmen und den Schnitt beidseitig seitlich unterhalb der Rippen verlängern. Alle sichtbaren Blutgefäße während dieses Vorgangs kauterisieren. Um die Blutung zu minimieren, einen kleinen initialen Schnitt am linearen Ellbogen durchführen, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.

Verlängern Sie den Schnitt horizontal, verschließen Sie alle Blutgefäße und gewinnen Sie so Zugang zur Leber. Bringen Sie die Maus nun auf die Arbeitsbühne und stapeln Sie Objektträger auf beiden Seiten des Tieres, um es an Ort und Stelle zu halten. Diese Stapel sollten die Höhe der Maus erreichen, damit die später platzierte Unterlage für die Leber nicht mit übermäßigem Druck auf den Bauchraum wirkt.

Jetzt mit Nähten am Brustbein die Rippen zurückziehen. Eine 4-0-Naht ist ausreichend. Nach dem Zurückziehen der Rippen die Bänder durchtrennen, die Leber und Zwerchfell verbinden, und bis zur Aorta durchschneiden, jedoch mit besonderer Vorsicht arbeiten, um den Gefäßverband nicht zu rupturieren oder zu verletzen. Außerdem das Band durchtrennen, das die Leber mit dem Magen-Darm-Trakt verbindet.

Drehen Sie die Maus um 45 Grad, um einen besseren Zugang zum größeren Leberlappen zu erhalten. Nehmen Sie einen normalen Deckgläser und kleben Sie ihn an den Kanten fest, sodass er nicht scharfkantig ist. Legen Sie ihn über die Bauchhöhle.

Dies dient als Unterlage, um die Leber darauf zu platzieren. Führen Sie vorsichtig eine Doppelspitzen-Tastsonde oder einen gepolsterten Spatel unter die Leber ein und halten Sie die Oberseite des Organs fest. Da durch mechanischen Druck mit einem feuchten Tuch die Lebergewebe sofort beschädigt werden können, ist es unerlässlich, das Organ sorgfältig zu behandeln.

Heben Sie dann das Läppchen auf den Objektträger und ziehen Sie es vorsichtig zurecht. Das Läppchen wird normalerweise leicht gebogen oder gefaltet sein; versuchen Sie, die Ränder vorsichtig auseinanderzufalten, indem Sie das Gewebe mit einem dünnen Spatel oder einem feuchten Tuch anheben. Fügen Sie anschließend seitliche Stützen in Form von Deckgläsern oder Objektträgern hinzu.

Stapeln Sie die Deckgläser so, dass sie die gleiche Höhe wie der Leberlappen haben. Die Positionierung und Fixierung der Leber ist der wichtigste Schritt im Protokoll. Mechanische Belastungen, Torsionen oder Druck führen sofort zu Gewebeschäden oder zumindest zu einer beeinträchtigten Durchblutung der sinusoidalen Gefäße.

Legen Sie nun ein großes Deckglas mit abgeklebten Kanten über den Leberlappen, der von den seitlichen Halterungen gestützt wird. Positionieren Sie dieses Deckglas so waagerecht wie möglich. Es sollte die Leber nicht zusammendrücken.

Weißes Gewebe weist auf eine beeinträchtigte Durchblutung hin, es sei denn, die Bildgebung erfolgt sehr schnell. Nun müssen zwei unabhängige intraperitoneale Katheter eingesetzt werden, um eine Langzeitanästhesie bereitzustellen und G fünf anzuwenden. Diese bestehen aus 27-Gauge-Nadeln und flexiblen Silikonröhrchen.

Dann starten Sie den Fluss mithilfe von Spritzenpumpen. Führen Sie die Katheter in den unteren Bauchbereich nahe den Hintergliedmaßen ein. Nachdem Sie die lebenswichtigen Überwachungsgeräte am Maus angebracht haben, bereiten Sie 100 Milliliter 3 % Aros in einem XPBS vor.

Wenn das Agarose auf 41 Grad Celsius abgekühlt ist, wird die Leber mit einer Fünf-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel darin eingebettet. Sobald die Agarose abgekühlt ist, wird der Überschuss mit einem Heidemann-Spatel entfernt, um ein ausreichend großes Sichtfeld freizulegen, um die Leber scannen zu können. Danach wird mit dem Scannen fortgefahren.

Nachdem das Sichtfeld vorbereitet wurde, bewegen Sie die Maus unter dem Mikroskop, um geeignete Scannbereiche für die Zeitrafferaufnahme auszuwählen. Das Lebergewebe wird visuell mithilfe einer externen weißen Lichtquelle abgesucht, um repräsentative Felder mit ausreichendem Blutfluss und minimaler Probendestörung zu identifizieren. CXCR6 GFP heterozygote Mäuse wurden einer intravitale T-P-L-S-M-Aufnahme als Experiment unterzogen. Einigen wurde eine intraperitoneale Injektion von Tetrachlorkohlenstoff verabreicht, um eine akute Leberschädigung zu induzieren.

Modale Zellen, die GFP exprimierten, wurden per Video verfolgt, und ihre Bewegungsbahnen wurden überlagert, um einen Überblick über die zelluläre Mobilität zu erhalten. Anschließend wurden die Bahnen normalisiert. In normalen Lebern zeigten die Zellen zufällige Migrationsmuster.

Lebern, die mit CCI vier injiziert wurden, zeigten eine Beeinträchtigung der Zellmigration. Bei der Messung der Gesamtverschiebung von ihrem Ursprung aus war deutlich, dass 36 Stunden nach der CCI-vier-Behandlung am Ort des hepatocellulären Schadens eine Zellfixierung auftrat. Die beeinträchtigte Migration aufgrund der Leberschädigung konnte ebenfalls gezeigt werden, indem die Migrationsgeschwindigkeit einzelner Zellen über die Zeit aufgetragen wurde, was eine teilweise Arrestierung nach 18 Stunden und eine vollständige migratorische Arrestierung nach 36 Stunden zeigte.

Die Verringerung der Geschwindigkeit der wandernden Zellen konnte ebenfalls statistisch signifikant nachgewiesen werden, wenn die Zellen als Populationen verglichen wurden. Somit eignet sich dieser Ansatz zur Verfolgung von Veränderungen in der Zellmigration und -positionierung bei der Entwicklung von Lebererkrankungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Leber einer Maus für die intravitale Multifotonenmikroskopie vorbereitet.

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es uns, das Tier für eine langfristige Überlebensfähigkeit zu stabilisieren und Bewegungsartefakte aufgrund der schonenden Fixierungsmethode zu minimieren. Einmal maskiert, kann diese Technik innerhalb von etwa einer Stunde durchgeführt werden, sofern sie korrekt angewendet wird. Während dieses Vorgangs ist es wichtig, die Vitalparameter des Tieres zu überwachen – insbesondere Temperatur, Herzfrequenz, Sauerstoff- und CO2-Spiegel. Dies kann erreicht werden, indem die Tiefe der Narkose und die Atmung entsprechend angepasst werden.

Andere Verfahren wie die Durchflusszytometrie-Analyse oder die Laser-Mikrodissektion können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zum Phänotyp der eindringenden Immunzellen oder zu Mediatoren, die von Gewebe- oder eindringenden Zellen nach ihrer Entwicklung sezerniert werden. Diese Techniken ermöglichten es Forschern, Einblicke in die Dynamik des Leukozytenverkehrs und zellulärer Interaktionen in der Leber zu gewinnen und die Abfolge der Ereignisse, die zu entzündlichen Lebererkrankungen führen, aufzuschlüsseln. Befolgen Sie bitte die Lasersicherheitsrichtlinien, wenn Sie Bildaufnahmen mit einem Infrarotlaser mit hochenergetischen Pulsen durchführen, der für die Multiphotonenmikroskopie verwendet wird.

Stellen Sie sicher, dass keine Reflexion der Laserstrahlung während des Experiments eine Gefahr für Ihre Augen und Haut darstellt.