Name: Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Lernen Sie den paarweisen Wachstumswettbewerb-Assay zur Bestimmung der Replikationsfitness von HIV-1-Stämmen. Diese Methode nutzt quantitative Echtzeit-PCR und Sanger-Sequenzierung für präzise virale Fitnessmessungen.

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Diese Studien wurden durch Zuschüsse des US Public Health Services P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 und dem Functional Profiling and Computational Biology Core des Center for AIDS Research der University of Washington (P30 AI027757) finanziert.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Die hier geäusserten Meinungen sind diejenigen der Autoren und sind nicht als offizielle oder repräsentieren die Ansichten des US Department of Defense oder die Abteilung der Armee aufgefasst werden.

Die vorgestellten Protokolle bestand aus zwei Hauptteilen: Konstruktion von rekombinanten HIV-1 molekularen Klonen und Wachstum Kompetitionsassays. Um zwei Viren in einer doppelt infizierten Zellkultur zu unterscheiden, ist es wichtig, dass die konkurrierenden molekulare Klone enthalten Sequenz-Tags, die durch eine RT-qPCR-Primer-Sonden-Tests oder durch die Sanger-Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Dieses Protokoll verwendet die VIFA und VIFB Tags, welche den gleichen Bereich von HIV-1 NL4-3 vif zu besetzen und codieren die gleiche Aminosäuresequenz, unterscheiden sich jedoch von sechs auch Mutationen. Diese Mutationen zeigten keine Auswirkungen auf virale Replikation Fitness 20. Die in diesem Protokoll verwendeten PCR-basierten Klonierungsverfahren bietet mehr Flexibilität bei der Auswahl der Klonierungsstellen, im Vergleich zu basierte Klonen Restriktionsstelle. Allerdings nimmt die Effizienz der PCR-Klonierung wie die Insertgröße zunimmt. Die Stromgrenze des Einsatzes Größe ist ~ 5 kb 34. Für die PCR-basierte Klonen und die Website geleitet mutagenesis, ist die Verwendung eines High-Fidelity-DNA-Polymerase entscheidend, um die Wahrscheinlichkeit von zusätzlichen Mutationen, zu verringern. Verwendung der minimalen Anzahl von PCR-Zyklen erforderlich, um ausreichende Mengen an Produkten zu ergeben wird auch empfohlen. Nach unserer Erfahrung haben wir keine zusätzlichen Mutationen nach den hier beschriebenen PCR-basierte Klonen und ortsgerichtete Mutagenese Schritte zu erkennen. Dennoch sollte die PCR-Produkte sequenziert, um für jegliche unerwünschte Mutationen zu überprüfen. Idealerweise sollte die gesamte HIV kodierende Region erneut sequenziert werden. Mindestens drei Abtastzeitpunkte innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase 9 untersucht werden. Die viralen Wachstumskinetik muss zuvor mit täglichen Probenahme, um die entsprechenden Kulturdauer und Abtastzeitpunkte für das Wachstum Wettbewerb festzustellen, festgelegt werden. Ein Faktor, der die virale Wachstumskinetik beeinflusst, ist die Multiplizität der Infektion (MOI). Dieses Protokoll verwendet insgesamt MOI von 0,005 für beide Monoinfektion und Wachstum Wettbewerb, wie es dargestellt wurde, um mehr zu erhalten roBüste Ergebnisse als untere MOIs 9. Dennoch kann unteren MOIs verwendet werden, um eine längere Phase exponentiellen Wachstums falls erforderlich zu erhalten, aber auf Kosten der Folge Konsistenz. Dieses Protokoll legt eine erste Infektion Verhältnis von 50:50, unter der Annahme, dass das Fitness Unterschiede der Viren sind in der Regel nicht im voraus. Die Verwendung von ungleichen Eingangsverhältnisse sind jedoch geeignet, wenn es vorläufige Daten, die auf signifikante Unterschiede in der Kinetik der viralen Replikation. In diesen Fällen ist eine Infektion von 70:30 empfohlen, für die Erfassung eines großen Fitness Unterschied wo die weniger fit Virus im Überschuß 9 platziert ermöglichen. Das Protokoll für die Bestimmung der TCID 50, virale Wachstumskinetik und zur Durchführung der Wachstums Kompetitionstests wurden optimiert unter Verwendung von HIV-1 Subtyp B haben NL4-3 COTB-p24 und PBMCs von einem einzelnen Spender, deren PBMC konsistent Empfindlichkeit nachgewiesen, HIV- 1-Infektion in vitro. Die Kulturzeitund Abtastzeitpunkten in diesem Protokoll dargestellt sind wahrscheinlich für das Studium von HIV-1 Gruppe M-Viren in menschlichen PBMCs sein. Verwenden von PBMCs aus einer Hand ist sehr zu empfehlen, um konsistente Ergebnisse zu erhalten, wie die Virusreplikation in verschiedenen Spenderzellen 35 variieren. Obwohl weniger wünschenswert, kann PBMCs von mehreren Spendern gebündelt eingesetzt werden als Ersatz zur Verfügung gestellt, dass der gleiche Pool ist in allen Versuchen verwendet. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von Zelllinien. Die hier vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich mit der T-Zelllinie CEM × 174 23,36 verwendet. Es ist jedoch wichtig, dass die Anzahl von Zellen ausgesät werden neu optimiert werden, um konsistente Zellwachstum zu erzielen. Viral Wachstumskinetik muss auch wieder hergestellt werden, da sie wahrscheinlich in verschiedenen Zelllinien variieren, um die entsprechenden Abtastzeitpunkten in den Wachstums Wettbewerb Schritte zu bestimmen. Zwei verschiedene Methoden, um die virale Verhältnis zur Berechnung Fitness zu bestimmen sind in der Protok inbegriffenol. Die erste nutzt RT-qPCR, um virale cDNA Kopienzahl zu jedem Probenahmezeitpunkt zu messen. Virusreplikation Fitness wurde dann aus dem viralen Verhältnisses berechnet, basierend auf cDNA-Kopie-Nummer. Alternativ kann die virale Verhältnis basierend auf dem Verhältnis der Peakhöhe bei Chromatogramm der VifAB tag Sites bestimmt werden. Die beiden Verfahren ergab vergleichbare Ergebnisse (Figur 4). Das Chromatogramm-Peakhöhe Verfahren auf andere HIV-1-Stämme ohne konstruiert Sequence Tag angewendet werden. Für RT-qPCR, die Verwendung von Primern oder Sonden zu Virusvarianten unterscheiden muss zunächst sorgfältig geprüft werden (siehe 20). Dennoch bietet RT-qPCR bessere Empfindlichkeit für Proben mit einer geringen Menge an viraler RNA, wie die von dem ersten Zeitpunkt in der exponentiellen Wachstumsphase. Direkte Messung der viralen cDNA ermöglicht auch Detektions technischer Probleme, die von der RNA-Extraktion und cDNA-Synthese entstehen können. Mit molekular Klone mit Sequenz-Tags bietet eine kostengünstige Lösung to die RT-qPCR Verfahren, da nur zwei Paare von Primern und Sonden benötigt werden, um mehrere Viren zu studieren. Diese Strategie vermeidet auch das Problem der Spitzenhöhenvariation nacheinander Chromatogramme durch benachbarte Basen 37, die Sequenzierung wird an der gleichen Stelle für alle Viren in der Studie durchgeführt. Die für die RT-qPCR und Sanger-Sequenzierung hergestellt PCR-Produkte können auch Verwendung bei anderen Methoden zur viralen Verhältnis zu bestimmen, wie Schütt Sequenzierung von einzelnen Klonen 12,13 HTA 4,7,17,19 oder Oligonukleotid-Ligation-Assay (OLA) 38 .

Virale Replikation Fitness ist als die Fähigkeit eines Virus der infektiösen Nachkommen in einer bestimmten Umgebung 1 produzieren definiert und ist ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Prävalenz von einer Virusvariante auf Bevölkerungsebene im Laufe der Zeit 2. In vivo-Studien Fitness nicht machbar mit humanpathogenen Viren, wie HIV-1, verschiedene in vitro und ex vivo-Replikation Fitness Assays wurden entwickelt, um die Auswirkungen auf die Eignung, die aus Arzneimittelresistenz und Immun-Escape-Mutationen epistasis und der Entwicklung zu untersuchen viraler Populationen 3-6. Unter den verschiedenen Fitness Assays werden Wachstums Kompetitionstests erkannt empfindlicher und gültig Maßnahmen Kondition Unterschiede ergeben, da zwei oder mehrere virale Varianten konkurrieren um die gleiche Zellpopulation unter exakt denselben Umweltbedingungen wie in vivo 1,7,8 auftritt. Vor Beginn der Wachstums Kompetitionsexperimente mehrere variables muss bestimmt werden, einschließlich der Verwendung von verschiedenen Multiplizitäten der Infektion (MOI), virale Eingangsverhältnis, und der Zeitpunkt der Probenahme für die Analyse. Wir haben die Auswirkungen dieser Parameter auf die virale Wachstumskinetik und auf das Ergebnis der Konkurrenzexperimenten studiert und haben wichtige Faktoren für robuste Messungen von HIV-1 Fitness erforderlich in Zellkultur 9 identifiziert. Zusätzlich zum Test Variablen gibt es eine Vielzahl von Verfahren zur Quantifizierung Virusvarianten in Wachstums Kompetitionsexperimenten. Bulk 10,11 oder 12,13 klonale Sequenzierung wurde verwendet, um das Verhältnis der konkurrierenden Viren auf der Grundlage der Nucleotid-Frequenzen an der Stelle (n) von Interesse zu bestimmen. Relative Fitness von Änderungen in diesem Verhältnis im Laufe der Zeit ab. Dieses Verfahren ist praktisch, da die DNA-Sequenzierung Dienstleistungen sind überall erhältlich. Die parallele allelspezifische Sequenzierung (PASS) Verfahren ermöglicht die Sequenzierung an mehreren Standorten und den Nachweis von Rekombinanten 14 </sup&gt;, Aber es erfordert auch speziell entwickelten Reagenzien und Nachweissystemen. Im Wesentlichen wurden diese Methoden entwickelt, um Virusstämme mit einer geringen Anzahl von Nukleotid-Differenzen in einer Region von Interesse zu untersuchen. Andere Methoden mit einem kleinen Reporter-Gen 15 oder auch Mutationen 4,16-18 als Tags, die konkurrierenden Viren durch Sequenzierung, Heteroduplex-Tracking-Tests (HTA) 4,7,17,19 unterscheiden oder reverse Transkription-quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) 15,16,18,20, von denen alle für studieren konkurrierenden Stämme unabhängig von Sequenzähnlichkeit werden. Ein zusätzlicher Schritt ist erforderlich, um Tags in virale Genome einführen und die RT-qPCR-Assay erfordert auch spezifische Reagenzien und Instrumentierung. Wir haben festgestellt, daß Schütt Sanger Sequenzierung Ausbeuten 9 vergleichbare Ergebnisse. Nach einem Wachstum Wettbewerb wird die virale Replikation Fitness als relative Fitness, oder ein Fitness-Verhältnis zwischen t vorgestelltwo Virusvarianten. Die relative Eignung eines Virus kann als der endgültige Anteil einer Virusvariante durch die ursprüngliche Anteil im Inokulum oder als die Netto-Wachstumsrate Differenz zwischen den zwei konkurrierenden Viren normalisiert definiert werden. Wir fanden, dass das letztgenannte Verfahren, mit Längsdatenpunkte nur in der exponentiellen Wachstumsphase, erzeugt die robustesten Ergebnisse 9,20. In-vitro-Assays Fitness in erster Linie verwendet werden, um biologische Klone 6-8 und infektiöse molekulare Klone von HIV-1 zu untersuchen. Letzteres ist zugänglich Genmanipulation werden oft eingesetzt, um die Wirkung auf die Eignung von bestimmten Mutationen oder spezifische Sequenzen von Interesse 3-5,21,22 studieren. Die folgenden Protokolle beschreiben einen Workflow unter dem Aspekt der Bau neuer voller Länge infektiösen HIV-1 molekulare Klone mit HIV-1-Vektoren, die eine Sequenz-Tag, die Einführung von Mutationen von Interesse, so dass virale Bestände und zur Errichtung virale Wachstum KinetikZur Durchführung der Wachstums Kompetitionsassays und die Berechnung der relativen fitness (Abbildung 1). Mit unserer optimierten Verfahren, wir drei rekombinanten HIV-1-Mutanten erzeugt und bestimmt ihre Replikation Fitness. Das rekombinante molekularen Klon wurde zuerst durch Ersetzen des HIV-1 gag-p24-Genregion pNL4-3, einem Plasmid, das ein Volllängen-infektiöse Genom des HIV-1-Stamm NL4-3 Labor, mit einem synthetischen COTB (Mitte-of konstruiert Baum, Subtyp B) gag-p24-Sequenz 23, um den Prototyp-Stamm zu erstellen. Einzel amino Änderungen (T186M, T242N und I256V) wurden dann eingebracht, um drei mutierten Klone erstellen. Jede Mutante wurde gegenüber dem Prototyp-Virus konkurrierten um die Fitness Auswirkungen der einzelnen Mutation im gegebenen genetischen Hintergrund zu beobachten. Die drei Mutanten demonstrierten unterschiedlichem Replikation fsitness von gering bis deutlich niedriger als der Prototyp-Virus. Die T242N Mutation wurde bereits berichtet, eine moderate fitne habenss kosten 24-26, ähnlich zu dem in dieser Untersuchung gezeigte Ergebnis. Der Fitnesskosten der anderen zwei Mutationen zuvor nicht berichtet worden.

<table><tbody><tr><td>Konstruktion von rekombinanten Klonen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chimäre Primer/Mutagene/Sequenzierungsprimer</td><td>IDT</td><td></td><td>Custom DNA-Oligos</td></tr><tr><td>pNL4-3VifA und pNL4-3VifB Plasmid</td><td></td><td></td><td>Bitte kontaktieren Sie Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu)</td></tr><tr><td>High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>High-Fidelity Puffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems&reg; GeneAmp&reg; PCR-System 9700</td></tr><tr><td>DNA-Ladefarbstoff</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA-Leiter</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI-Enzym</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 chemisch kompetente Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bouillon Base Pulver</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Research Products International</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Transfektion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA-Transfektionsreagenz</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>0,22 &#956; m Filter Oberrohr</td><td>VWR International</td><td>89220-716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&prime; s Modifiziertes Dulbecco&prime; s Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medien</td><td>Life Technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Phytohämagglutinin (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>humanes Interleukin-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Platte</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit flachem Boden</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit rundem Boden</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Röhrchen mit O-Ring</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glycerin Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-HIV-1 SF2 p24 Antiserum</td><td>NIH AIDS Reagenz Programm</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen HRP KPL</td><td></td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>TMB Microwell Peroxidase Substrat</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher</td><td>Scientific A300-500</td><td>Verursacht schwere Verbrennungen auf allen Expositionswegen. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung. Nur unter einem chemischen Abzug verwenden. Sofort mit viel Wasser für mindestens 15 min abwaschen.</td></tr><tr><td>HIV p24 standard</td><td>AIDS and Cancer Virus program (NCI-Frederick)</td><td></td><td>Für Bestelldetails wenden Sie sich bitte an Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov); http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>VMax Kinetic ELISA Microplate Reader</td></tr><tr><td>RNA-Isolierung cDNA-Synthese</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp Virale RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Erststrang-Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>RNASE-Inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-qPCR-Maschine</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>TaqMan&reg; Genexpression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Vorwärts-, Rückwärts-Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>Sonde</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>optische 96-Well-Reaktionsplatte</td><td>Life Technologies</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR+Sequenzierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA-Polymerase (Biolase)</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>NH4 Puffer&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzierungsprimer</td><td>IDT</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system DNA-Sequenzierungsdienstleister</td></tr><tr><td></td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GRC-Web-Tool</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/ ChromatQuan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Web-Tool</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

paarweise wachstum wettbewerb assay zur bestimmung der replication fitness von human immunodeficiency viruses

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In-vitro-Fitness-Assays sind wesentliche Werkzeuge zur Bestimmung der viralen Replikationsfähigkeit von Viren wie HIV-1. Zur Extrapolation der Fitness der viralen Replikation wurden verschiedene Messungen verwendet, die von der Anzahl der Viruspartikel pro infektiöser Einheit über die Wachstumsrate in der Zellkultur bis hin zur relativen Fitness reichen, die aus Wachstumswettbewerbsassays mit mehreren Zyklen abgeleitet wurde. Wachstumskonkurrenz-Assays bieten eine besonders empfindliche Messung der Fitness, da die Viren unter identischen Wachstumsbedingungen um zelluläre Ziele konkurrieren. Bei der Durchführung von Wachstumskonkurrenz-Assays sind mehrere experimentelle Faktoren zu berücksichtigen, darunter die Multiplizität der Infektion (MOI), die Probenahmezeiten sowie die Methoden zur Berechnung des Virusnachweises und der Fitness. Jeder Faktor kann das Endergebnis beeinflussen und muss daher bei der Versuchsplanung sorgfältig berücksichtigt werden. Das hier vorgestellte Protokoll umfasst Schritte von der Konstruktion eines neuen rekombinanten HIV-1-Klons über die Durchführung von Wachstumskonkurrenz-Assays bis hin zur Analyse der experimentellen Ergebnisse. Dieses Protokoll verwendet experimentelle Parameterwerte, die zuvor gezeigt wurden, um konsistente und robuste Ergebnisse zu liefern. Alternativen werden diskutiert, da einige Parameter je nach Zelltyp und untersuchten Viren angepasst werden müssen. Das Protokoll enthält zwei alternative Virusnachweismethoden, um Flexibilität zu bieten, da die Verfügbarkeit von Instrumenten, Reagenzien und Fachwissen von Labor zu Labor variiert.

Um die Fitness Auswirkungen der einzelnen Aminosäureänderungen in HIV-1 Gag p24-Studie verwendeten wir Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese, um Mutationen in ein pNL4-3 Plasmid, das die HIV-1-p24-Gen COTB 23,32,33 einzuführen. Virusstammlösungen wurden durch Transfektion von 293T-Zellen erzeugt, und nach 48 h geerntet. Wir schätzten die 50% Gewebekulturinfektionsdosis (TCID 50) jedes virale Stamm durch die Reed-Muench-Methode 31. Die TCID 50 des Prototyps und Mutantenviren reichten von 10. April - 10. MAI IU / ml (Abbildung 3a). Die Wachstumskinetik der rekombinanten Viren wurden in PBMCs aus einem einzigen Spender bei einer MOI von 0,005 hergestellt. RT-qPCR wurde verwendet, um virale cDNA Kopienzahl täglich für sechs Tage zu messen. Alle Mutanten und Prototypen Viren wuchs exponentiell zwischen Tag 2 und Tag 4, wonach das virale Wachstum verlangsamt, wie durch eine verringerte Neigung der Virus-RNA-Kopienzahl erhöhen (angegeben &lt;strong&gt; 3B). Die Abnahme der cDNA-Kopienzahl zwischen Tag 0 (entsprechend dem Inokulum) und am Tag 2 aufgrund der Absorption von Virus an Zellen und die Entfernung von ungebundenem Virionen von Tag zu Tag 1 Wäsche (Schritt 5.1.6) ist. In der exponentiellen Wachstumsphase, hatten alle drei Mutanten eine langsamere Wachstumsrate (g) als das Prototyp-Virus (Abbildung 3c). Alle drei Mutanten wurden gegenüber dem Prototyp-Virus in Wachstums Kompetitionsassays an insgesamt MOI von 0,005 konkurrierten. Virale Wachstumskinetik in doppelt infizierten Kulturen waren ähnlich der Monoinfektion; das virale exponentiellen Wachstumsphase wurde zwischen den Tagen 2 und 4 und das Viruswachstum ein Plateau um Tag 5 (4A). Virale Wachstum Unterschiede wurden aus der Änderung in der viralen Verhältnis über die Zeit abgeleitet wird. Die virale Verhältnis wurde auf Basis von cDNA Kopienzahl der Referenz und den mutierten Viren unter Verwendung von RT-qPCR, und durch Vergleichen Spitzenhöhen berechnetnacheinander Chromatogramme bei Nukleotid Sites Unterscheidung der zwei Viren (4B). Die Wachstumsdifferenzen unter Verwendung des Spitzenhöhe und Virus-RNA-Kopienzahl Methoden ergab ähnliche Ergebnisse (4C). Alle drei Mutanten hatten niedrigere Replikation Fitness als die Prototypen-Viren mit dem mutierten I256V mit der niedrigsten Fitness (4C). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Abbildung 1: Flussdiagramm der Protokolle in diesem Papier Das Virus Vorbereitung Protokolle Sorge Bau von HIV-1 rekombinanten Klonen und die Erzeugung von Virusbestände.. Der Fitness-Assays Protokolle sind für die Festlegung virale Wachstum Kinetik und Bestimmung der relativen viralen Fitness. Gestrichelten Linien alternative Strömungen für die Protokolle. Zum Beispiel kann eine Mutation direkt in HIV-1 NL4-3 eingeführt werdenmolekularen Klon ohne Erzeugung eines rekombinanten Klons. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Abb. 2: Der Bau der HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 rekombinante molekulare Klone mit Overlap-Extension-PCR (A) Gestalten Sie die chimären Primer. Die 5&#39;-Hälften der Primer enthalten die NL4-3 Vektorsequenz und dem 3&#39;-Hälften enthalten die Enden des Einsatzes Folge. (B) chimäre Primer werden verwendet, um die Insertfragment, COTB Gag-p24 zu verstärken. (C) Die Insert-Fragmente als Primer für eine zweite PCR verwendet, um ein neues rekombinantes Plasmid zu erzeugen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Abb. 3: Viral Wachstumseigenschaften in PBMCs (A) Log 10 TCID 50 </sub&gt; viraler Aktien. (B) Viral Wachstumskinetik in Monoinfektionen bei einer MOI = 0.005 begonnen. (C) Viral Wachstumsraten über sechs Tagen, einschließlich der exponentiellen Wachstumsphase (Tage 2-4) von der Platte (B) abgeleitet ist. Die gezeigten Werte stellen den Durchschnitt von drei Replikaten von einem Experiment. Die Fehlerbalken stellen 95% Konfidenzintervall. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Abbildung 4: Viral Wachstum und relative Fitness-Bestimmungen (A) das virale Wachstum in doppelt infizierten PBMC-Kulturen.. (B) Verhältnisse von T242N und Prototypen Viren bestimmt mittels RT-qPCR oder die Sequenzierung Spitzenhöhe Methode. (C) Net virale Wachstum Unterschiede (d) zwischen der Mutante und der Prototyp-Viren in doppelt infizierten Kulturen, wie in (A) gezeigt. d Werte f berechnetROM Die in (B) gezeigt, virale Verhältnisdaten. Die gezeigten Werte stellen den Durchschnitt von drei Replikaten von einem Experiment. Die Fehlerbalken stellen 95% Konfidenzintervall.

Wachstumskonkurrenz zwischen nahezu isogenen Viren bietet ein sensitives Maß für die Bestimmung der relativen Replikationsfitness. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen die Konstruktion rekombinanter HIV-1-Klone, die Virusvermehrung und Wachstumskonkurrenz sowie Analysemethoden, die optimiert sind, um empfindliche und konsistente Ergebnisse zu erzielen.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die relative Replikationsfähigkeit von HIV-1-Stämmen von Interesse zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst virale molekulare Klone oder DNA-Plasmide hergestellt werden, die vollständige HIV-1-Sequenzen von Interesse enthalten. Der zweite Schritt besteht darin, durch DNA-Transfektion Virusstämme für jeden molekularen Klon zu erzeugen.Anschließend werden die Wachstumskinetik und die exponentielle Wachstumsphase jedes HIV-1-Stamms durch longitudinales Probenehmen aus mono-infizierten Zellkulturen bestimmt. Der letzte Schritt besteht darin, paarweise Wachstumskonkurrenz oder Doppelinfektionen in Zellkulturen durchzuführen. Letztendlich werden umgekehrte Transkription, quantitative Echtzeit-PCR sowie die von der Sanger-DNA-Sequenzierung erhaltenen Chromatogramm-Spitzenhöhen verwendet, um die Virusverhältnisse zu bestimmen, aus denen dann die relative Virusreplikationsfähigkeit berechnet wird.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der para-mono-Infektion oder der Dualinfektion zu zwei Zeitpunkten besteht darin, dass sie empfindlichere und robustere Messungen des Replikationsfitnessunterschieds zwischen zwei Virusstämmen ermöglicht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Protokolle umfassen die Konstruktion von HIV-1-Rekombinantenklonen, die Einführung von Mutationen mittels gezielter Mutagenese, die Herstellung von Virusstämmen sowie die Durchführung von Fitnessassays zur Ermittlung der Virusvermehrungskinetik und zur Bestimmung der relativen Virusfitness. In diesem Video wird der Wettbewerbsansatz zur Virusvermehrung sowie zwei verschiedene Methoden demonstriert.Um das Virusverhältnis zur Berechnung der Fitness zu bestimmen, siehe den Protokolltext für alle weiteren Verfahren. Für den Wachstumswettbewerbsassay werden dreimal 10 hoch 5 PHA-stimulierte periphere mononukleäre Blutzellen oder PBMCs in einem Gesamtvolumen von 500 Mikroliter pro Vertiefung in einer 48-Loch-Flachbodenplatte angesät. Die Platte wird bis zur Infektion bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid aufbewahrt. Anschließend werden drei Milliliter Inokulum mit jeweils 6.000 IE pro Virus hergestellt.In einem typischen Experiment werden mehrere Mutanten getestet, jedoch wird zu Demonstrationszwecken nur eine Mutante gegen das Prototypvirus geprüft. Die sachgemäße Herstellung des viralen Inokulums ist ein entscheidender Schritt dieses Verfahrens, da bei einem Virusstamm mit sehr hohem infektiösem Titer eine serielle Verdünnung erforderlich sein kann. Überführen Sie 1,5 Milliliter jedes viralen Inokulums in ein steriles Gefäß, um das Doppelinfektions-Inokulum herzustellen.Geben Sie 500 Mikroliter des dualen Inokulums zu den PHA-stimulierten PBMCs in jedes Loch der 48-Loch-Platte hinzu. Das endgültige Kulturvolumen beträgt ein Milliliter pro Loch. Aliquotieren Sie 200 Mikroliter pro Loch des dualen Inokulums auf zwei 96-Loch-Platten für die RNA-Isolierung. Bewahren Sie eine Platte als Reserve auf. Inkubieren Sie die inokulierten Zellen bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid für 16 bis 24 Stunden. 16 bis 24 Stunden nach der Inokulation waschen Sie die Kulturen, entfernen und verwerfen 750 Mikroliter des Kulturüberstandes und geben 750 Mikroliter frisches, komplettes Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium oder cIMDM hinzu.Verpacken Sie die Platte in Parafilm und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 ×g. Entfernen und verwerfen Sie danach 750 Mikroliter des Überstandes. Geben Sie 750 Mikroliter frisches cIMDM hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Zum Zeitpunkt der Probenentnahme sollten mindestens drei Zeitpunkte innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase des Virus gewählt werden.Um eine Probe zu gewinnen, überführen Sie 500 Mikroliter Kulturüberstand in ein 1,8-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren eine Minute bei 3000 ×g. Überführen Sie 200 Mikroliter des zellfreien Überstands in zwei 96-Well-Probenplatten zur RNA-Isolierung. Behalten Sie dabei eine Platte als Reserve zurück. Lagern Sie die Überstände bis zur RNA-Isolierung bei −80 °C.Fügen Sie 500 Mikroliter frisches cIMDM zu jeder Kultur hinzu und stellen Sie die Platte bis zur nächsten Entnahmzeit in den Inkubator zurück. Anschließend wird RNA aus den Proben isoliert, gefolgt von der cDNA-Synthese. Zwei Methoden zur Bestimmung der Virusanteile werden vorgestellt.Die erste Methode unter Verwendung der reversen Transkription, der quantitativen Echtzeit-PCR oder RT-qPCR, und die zweite Methode unter Verwendung der Chromatogramm-Peakhöhen. Für die qPCR bereiten Sie eine standardmäßige serielle Verdünnungsreihe im Triplikat des Plasmids pNL4-3VifA vor, wobei in jedem Schritt zehnfach verdünnt wird, von dreimal 10 hoch 6 Kopien pro Mikroliter bis hin zu 30 Kopien pro Mikroliter. Richten Sie eine 96-Well-qPCR-Reaktionsplatte ein.Jede Platte sollte mindestens eine negative Kontrolle, die Standardverdünnungsreihe im Triplikat und die Duplikate jeder cDNA-Probe enthalten. Verwenden Sie einen vFIA-Primer und -Sonde, um Signale in den negativen Kontrollen, der Standardverdünnungsreihe und mit einem Duplikat der cDNA-Probe nachzuweisen. Verwenden Sie die vIFB-Primer-Sonde mit dem anderen Duplikat der cDNA-Probe. Für jede qPCR-Reaktion verwenden Sie 12,5 µL der qPCR-Master-Mix-Lösung, 0,2 µM der qPCR-Sonde, jeweils 0,8 µM des forward- und reverse-Primers und 1 µL cDNA. Für die Standardverdünnungsreihe; fügen Sie anstelle von cDNA die serielle Verdünnung von pNL4-3VifA hinzu, für die negativen Kontrollen verwenden Sie Wasser oder Puffer anstelle von cDNA. Stellen Sie die PCR-Zyklenparameter gemäß den Herstelleranweisungen für das qPCR-Gerät ein. Erstellen Sie die Standardkurve anhand der Amplifikationsdaten der Standardverdünnungsreihe.Vergleichen Sie die Amplifikationsdaten der cDNA-Proben mit der Standardkurve, um die Kopienzahl zu bestimmen. Verwenden Sie die Berechnung der viralen Wachstumsrate oder das GRC-Webtool, um die relative virale Fitness zu berechnen. Geben Sie die aus dem RT-qPCR-Schritt erhaltene cDNA-Kopienzahl im angegebenen Format ein. Durch Auswahl von „Berechnen“ wird die Differenz der Netto-Wachstumsrate zwischen zwei konkurrierenden Viren ausgegeben. Um virale Verhältnisse anhand der Peakhöhen im Chromatogramm zu bestimmen, amplifizieren Sie mittels PCR HIV-1-Vif-Fragmente, die den VifAB-Sequenz-Tag enthalten, unter Verwendung von Vif-Vorwärts- und Vif-Rückwärts-Primern. Verwenden Sie für jede PCR-Reaktion ein Mikroliter cDNA, 1× NH₄-Puffer, 1,5 mmol/l MgCl₂, 0,2 mmol/l dNTPs, 2,5 U Taq-Polymerase und 0,45 µmol/l jedes Primers.Geben Sie Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zu erreichen. Stellen Sie die PCR-Zyklusparameter auf drei Zyklen bei 94 Grad Celsius für eine Minute, 55 Grad Celsius für eine Minute und 70 Grad Celsius für eine Minute ein, gefolgt von 34 Zyklen bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, 58 Grad Celsius für 30 Sekunden und 70 Grad Celsius für eine Minute. Schließen Sie mit einer Inkubation bei vier Grad Celsius ab. Reinigen Sie anschließend die PCR-Produkte mithilfe eines im Handel erhältlichen Kits und reichen Sie die gereinigten PCR-Produkte bei einem DNA-Sequenzierungsdienstleister zur Sanger-Sequenzierung ein.Überprüfen Sie den durchschnittlichen Lesegüte-Score, der vom Sequenzierungsservice bereitgestellt wird. Wenn die durchschnittliche Basenaufrufgenauigkeit unter 85 % liegt, wiederholen Sie die PCR-Amplifikation, die Reinigung der PCR-Produkte und die Sanger-Sequenzierung. Verwenden Sie das Chromat-Quantifizierungs-Webtool, um das Virusverhältnis zu jedem Zeitpunkt zu berechnen.Die erforderlichen Eingaben sind die Leitersequenz und die Sequenzchromatogrammdatei im .ab1-Format. Das Tool misst die Peakintensität an der angegebenen Stelle.Das Verhältnis der Peak-Intensitäten entspricht dem Verhältnis der beiden Viren. Verwenden Sie das GRC-Web-Tool, um die relative Virus-Fitness zu berechnen. Die Eingabe erfolgt über die Sequenz-Chromatogramm-Peakhöhe, die mit dem Chromat-Quantifizierungs-Web-Tool im angegebenen Format ermittelt wurde. Das GRC-Web-Tool berechnet die Differenz der Netto-Wachstumsrate zwischen den beiden konkurrierenden Virusstämmen. Ein Prototyp und drei HIV-Mutanten-Viren wurden konstruiert, und ihr Wachstum in PBMCs wurde charakterisiert. Die TCID50-Werte lagen zwischen 10 hoch 4 und 10 hoch 5 IU pro Milliliter. Alle Viren wuchsen zwischen Tag zwei und Tag vier exponentiell.In der exponentiellen Wachstumsphase wiesen alle drei Mutanten eine langsamere Wachstumsrate als das Prototypvirus auf. Jede Mutante wurde in Wachstumskonkurrenz-Assays gegen das Prototypvirus bei einem Gesamt-MOI von 0,005 konkurrieren lassen; die virale Wachstumsdynamik in doppelt infizierten Kulturen war derjenigen einer Mono-Infektion ähnlich. Die exponentielle Wachstumsphase der Viren lag zwischen Tag zwei und vier, und das virale Wachstum erreichte um Tag fünf eine Plateauphase.Unterschiede in der Virusvermehrungsrate ergaben sich aus der Veränderung des Virusverhältnisses über die Zeit. Das Virusverhältnis wurde basierend auf der cDNA-Kopienzahl der Referenz- und der Mutanten-Viren mittels RT-qPCR berechnet und durch Vergleich der Peakhöhen in Sequenzchromatogrammen an Nukleotidpositionen, die die beiden Viren unterscheiden, wobei der T242-N-Mutant mit dem Prototyp verglichen wurde. In diesem Beispiel ergaben die mit den beiden Methoden bestimmten Wachstumsratenunterschiede ähnliche Ergebnisse.Alle drei Mutanten wiesen eine geringere Replikationsfitness auf als das Prototyp-Virus, wobei die I256-V-Mutante die niedrigste Fitness hatte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man paarweise Wachstumswettbewerbsversuche durchführt, um die relative Replikationsfitness von HIV-1 zu bestimmen.

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Krone Region unterschiedliche V3-Loop-Sequenzen von der Oberfläche Hüllglycoprotein (gp120) des HIV-1 kann strukturell in vielen Fällen gekennzeichnet durch in silico Faltung von Positionen 10 bis 22 der Schleife mit einer...

Bewertung von immunologisch relevanten dynamischen tertiären strukturellen Merkmale der HIV-1 V3-Loop Crown R2 Sequence durch Ab initio Folding

Wir beschreiben ein Protokoll zu den wichtigsten Aufgaben der Host Signalmoleküle in lytische Replikation eines Modells Herpesvirus, gamma Herpesvirus 68 (γHV68) zu identifizieren. Mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien und embryonale Fibroblasten zur γHV68 lytische Replikation, erlaubt das Protokoll sowohl phänotypische Charakterisierung und molekulare Vernehmung von Virus-Wirt-Interaktionen in lytischen Replikation.

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Die Pathogenese von HIV-1 wird sowohl durch virale Eigenschaften als auch durch genetische Faktoren des Wirts definiert. Hier beschreiben wir eine robuste Methode, die reproduzierbare Messungen ermöglicht, um den Einfluss der Variation der Gag-Gensequenz auf die in vitro Replikationskapazität des Virus zu bewerten.

Einem Restriktionsenzym basierte Klonen Methode, um das Beurteilen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Replikation Kapazität von HIV-1 Subtyp C-Gag MJ4 chimären Viren

Methoden zur Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNA-Molekülen, die auf Postintegrationsschritte des HIV-1-Replikationszyklus abzielen, werden beschrieben. Diese Methoden sind nützlich, um neue Moleküle zu screenen und das Format bestehender Moleküle zu optimieren.

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) ex Vivo bietet eine wertvolle 3D-Modell des Virus Pathogenese. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu verarbeiten und infizieren Gewebeproben aus menschlichen Tonsillen und weiblichen genitalen Schleimhäute mit HIV-1 und in der Kultur an der Air liquide-Schnittstelle zu erhalten.

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.

Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion

Dieses Protokoll stellt eine Methode zum humanisierten Mäuse (Hu-NSG) schaffen über intrahepatischen Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen in Strahlung bedingt neonatale NSG Mäuse. Die Hu-NSG-Maus ist anfällig für HIV-Infektion und kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und dient als ein geeignetes pathophysiologischen Modell für HIV-Replikation und Latenz-Untersuchungen.

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

In diesem Artikel beschreiben wir einige etablierte Methoden zur Bestimmung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums (ER) und der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort (UPR), mit besonderem Schwerpunkt auf HIV-1-Infektionen. In diesem Artikel wird auch eine Reihe von Protokollen beschrieben, um die Auswirkungen von ER-Stress/UPR auf die HIV-1-Replikation und die Infektiosität der Virionen zu untersuchen.

Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation

Lernen Sie den paarweisen Wachstumswettbewerb-Assay zur Bestimmung der Replikationsfitness von HIV-1-Stämmen. Diese Methode nutzt quantitative Echtzeit-PCR und Sanger-Sequenzierung für präzise virale Fitnessmessungen.

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

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