3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Kultivierung von Thymus-, Mark-, Epithelzellen oder mtech in einer dreidimensionalen organotypischen Kultur oder einem OTC-System. Dies wird erreicht, indem zuerst das faserige Gerüstmaterial in einen 12-Well-Filtereinsatz eingebracht wird, gefolgt von der Schichtung eines frisch zubereiteten Fibringels, das menschliche Hautfibroblasten enthält. Nach vier bis fünf Tagen Vorkultur werden die MTS auf das Gerüst gesetzt und unter submersen Kulturbedingungen kultiviert.

Letztendlich können Immunhistochemie, RNA-Isolierung und Fakten an den Co-Kulturen durchgeführt werden, um die Entwicklung des CED Mtech zu beurteilen. Der Hauptvorteil der 3D-Organotypischen Co-Kultursysteme gegenüber den bestehenden 2D-Kultursystemen besteht darin, dass sie bei der Rekapitulation der mtech-Differenzierung, der Proliferation und der Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression weit überlegen sind. Heute wird diese Technik von Iris Martin, einer Technikerin aus unserem Kollaborationslabor, demonstriert.

Wenn die menschlichen dermalen Fibroblasten die Kofluenz erreichen, bereiten Sie die Gerüstfasern vor, indem Sie die 0,4 bis 0,6 Millimeter dicken Stücke aus Visco-Vliesfaser kochen, trocknen und bügeln. Schneide sie mit einem Locher aus Metall in 11 Millimeter große Kreise. Legen Sie das geschnittene Fasermaterial zwischen zwei Objektträger, wickeln Sie die Objektträger in Folie ein und autoklavieren Sie sie.

Legen Sie nach der Sterilisation die Einsätze in die Vertiefungen einer sterilen 12-Well-Platte und dann jedes Gerüst in einen entsprechenden Einsatz. Als nächstes mischen Sie 2,7 mal 10 bis das fünfte Fibroblasten in 100 Mikroliter fötales Kälberserum in 100 Mikroliter frisch verdünntes Thrombin pro Gerüst. Geben Sie die Thrombin-Fibroblasten-Mischung auf jedes Gerüst, gefolgt von 200 Mikrolitern frisch verdünntem Fibrinogen.

Mischen Sie dann die Zellmischung in jeder Vertiefung und verteilen Sie die Lösung gleichmäßig über das gesamte Gerüst mit vorsichtigem Pipettieren. Das Bild zeigt das Wachstum der humanen dermalen Fibroblasten mit dem Fibringel am ersten und vierten Tag der Kultur. Bereiten Sie ein Testgel in einer Kontrollwanne ohne Gerüst vor, um den Zeitpunkt und die Bildung der Gerinnsel auch zu diesem Zeitpunkt zu verfolgen.

Beurteilen Sie die Gerinnselbildung mit einer Pipettenspitze oder durch Umdrehen der Platte nach den Fibroblasten, lassen Sie die Organkulturen geronnen, tauchen Sie die Organkulturen in Medium, ergänzt mit la Sorbinsäure und TGF beta eins für vier bis fünf Tage am Tag der mtech-Aussaat, ersetzen Sie dieses Medium durch RFAD-Medium, das 500 Einheiten pro Milliliter Protein enthält, um eine vorzeitige Fibrinolyse zu verhindern. Sieben bis acht Stunden später säen 2,5 mal 10 bis das fünfte MT E in 100 Mikrolitern RFAD auf der Oberseite jedes Gerüsts suspendiert und die Co-Kulturen 24 Stunden lang inkubieren. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch ein frisches Medium mit 250 Einheiten pro Milliliter eines Proins für weitere vier bis sieben Kulturtage.

Um die Entwicklung der m Texs durch Immunhistochemie am Ende der Kultur zu beurteilen, verwenden Sie eine Pinzette, um das Gerüst dermales Äquivalent vom Filter jedes Filters zu trennen. Setzen Sie die OTCs gut ein und betten Sie sie in die OCT-Verbindung ein. Frieren Sie die OTCs in der gasförmigen Phase über flüssigem Stickstoff ein, um das O-T-C-R-N-A zu isolieren.

Nachdem Sie das Gerüstgewebe von den Filtern getrennt haben, schneiden Sie die OTCs mit einem Skalpell in Stücke und geben Sie die Stücke in ein zwei Milliliter RNA-freies Röhrchen, das einen Milliliter Denaturierungslösung enthält. Mit einem Schnellvorbereitungsgerät werden die OTCs zweimal mechanisch mit einer Geschwindigkeit von 6,0 für jeweils 30 Sekunden zerkleinert, mit einer zweiminütigen Pause auf Eis zwischen den einzelnen Zerkleinerungen. Isolieren Sie dann die RNA mit Säureguad Diumthiocyanat-Phenylchloroform-Extraktion, wie vom Hersteller beschrieben.

Um die OTCs mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, entfernen Sie die Membran und trennen Sie das Gerüst vom Fibrin-Fibroblasten-Mtech-Gel. Und dann schließlich das Gel mit einem Skalpell schneiden, wie gerade gezeigt. Übertragen Sie das Taschentuch in einen Faxschlauch.

Weiter zwei Milliliter Kollagenase dis paste. Legen Sie die Tube dann bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten in ein Wasserbad unter magnetischem Rühren. Rühren Bypass Ihre Pipette einmal alle fünf Minuten, wenn das Gewebe vollständig verdaut ist.

Die resultierende Zellsuspension wird durch ein 70-Mikrometer-Sieb filtriert und die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern wie abgebildet gefärbt. Die MTS sind an ihrer Keratin-14-Expression zu erkennen, wodurch sie leicht von den Menton-positiven Fibroblasten unterschieden werden können. Interessanterweise weisen die unreifen und reifen M Texs in Kultur unterschiedliche, aber hochgradig reproduzierbare Wachstumsmuster auf.

Die unreifen CD 80 D low M Texs bilden beispielsweise typischerweise Doppelschichten in engem Kontakt mit den Fibroblasten. Während die CD 80 D hohen MTS dazu neigen, kompakte Zellaggregate zu bilden, die durch die Fibroblasten begrenzt werden, überleben die mtech-Untergruppen nicht nur, sondern vermehren sich unter den demonstrierten 3D-OTC-Bedingungen, wie ihre EDU-Inkorporation zeigt. Interessanterweise vermehren sich die CD 80 Low MT Techs in Gegenwart von Rankl mit einer höheren Rate.

Während das Gegenteil für CD 80 High-MT-Techniker gilt, sollten Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie man MT kultiviert. Techniker, die 3D-OTCs verwenden. Dies ist eine Methode, die der Verwendung von 2D-Kultursystemen in Bezug auf die technische Differenzierung und die PGE-Wartung und -Induktion weit überlegen ist und das Potenzial hat, mehrere Take-Parameter zu untersuchen oder zu manipulieren.