Name: 3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von medullären Thymusepithelzellen in einem 3D-organotypischen Kokultursystem mit Fibringel und Fibroblasten. Diese Methode ermöglicht überlegene Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung promiskuitiver Genexpression im Vergleich zu 2D-Systemen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Deutsche Krebsforschungszentrum (DKFZ), das EU-Konsortium "Tolerage", die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) und die Landesstiftung Baden-Württemberg.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Regierungspräsidium Karlsruhe zugelassen. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) untergebracht ist. Für alle Kulturexperimenten Maus Jungtieren, die von 1 bis 7 Tage alt verwendet. 1. Isolierung von mTEZ aus Thymus HINWEIS: Die folgenden Schritte Verdauung wurden wie zuvor 1 unter sterilen Bedingungen mit einigen Modifikationen wie folgt beschrieben durchgeführt. <ol><li> Enthaupten die Maus Welpen und nehmen Sie den Thymus. Setzen Sie den Thymi auf Eis in einer Petri Platte mit RPMI 1640-Medium (enthaltend 5% FCS). </li><li> Schneiden Sie die Thymi in feine, kleine Stücke schneiden und in einem Rundrohr mit ~ 5-30 ml RPMI-Medium und sanft umrühren mit einem Magneten für 10 min bei RT. </li><li> Danach dekantiert die überstehende, die hauptsächlich Thymozyten und verdauen die verbleibende Gewebe nacheinander mit einer Runde collagenaSE-Typ IV (0,2 mg / ml und 57 U / ml Endkonzentration concentartion) für 15 min bei 37 ° C, gefolgt von Collagenase / Dispase (0,2 mg / ml und 1,2 U / ml Endkonzentration) für jeweils 25 min bei 37 &amp; deg; C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren bis zum Thymi vollständig verdaut. Verwenden Sie 1 ml Enzym pro zwei vor drei Thymi. </li><li> Man schüttelt das Gewebe einmal alle 7-10 min mit einer Pasteurpipette. Bündeln die Kollagenase / Dispase Fraktionen und durch ein 70 &amp; mgr; m Gaze. </li><li> Bereichern die mTEZ durch magnetische Zellsortierung (MACS). Führen die Reinigung von mTEZ durch magnetische Zellsortierung wie zuvor 11 beschrieben und in Abbildung 1 dargestellt. HINWEIS: Bei Magnetsortierung mTEZ verwendeten wir die folgenden Antikörper: anti-CD80-PE (16-10A1, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) und Anti-EpCAM-bio (G8.8, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) 12. Unreifen und reifen mTEZ mit MACS wurden wie folgt definiert: CD45 - EpCAM + CD80 - und CD45 - CD80 + JEWEILIGENEly. </li><li> Nach Reinigung MACS (Reinheit von unreifen mTEZ = 83,1 ± 6,3% und reifen mTEZ = 79,23 ± 3,42%), die Samen mTEZ auf die organotypischen Kulturen, wie unten beschrieben (Abschnitt 2.3). </li><li> Alternativ Art mTEZ durch FACS (unter Verwendung von 100 &amp; mgr; m Düse) nach CD45 MACS Erschöpfung mit den folgenden Antikörpern: anti-CD45-PerCP (30-F11, Einsatz bei 1: 100 Verdünnung), Anti-Ly51-FITC (6C3, verwenden Sie bei 1 : 100-Verdünnung), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, Verwendung einer 1: 500 Verdünnung) und Anti-CD80-PE (16-10A1, Verwendung bei 1: 100 Verdünnung). Ausschließen toten Zellen mit Propidiumiodid (1: 5.000) (Tag 4). Unreifen und reifen mTEZ mit FACS wurden wie folgt definiert: - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - und PI - CD45 - Ly51 - PI EpCAM + CD80 + sind. </li></ol> 2. 3D Organotypische Co-Kulturen (OTCs) HINWEIS: Die 3D-Hautkonstrukte für organotypischen Kultivierung keratinocytes wurden wie zuvor beschrieben hergestellt, 9,13. Bei allen Schritten wurden die Zellen bei 37 ° C inkubiert und 5% CO 2. Die OTCs Verwendung mTEZ wurden mit leichten Modifikationen, wie folgt hergestellt. <ol><li> Herstellung von menschlichen Fibroblasten HINWEIS: Die humanen Hautfibroblasten wurden aus Explantatkulturen von de-epidermised Dermis wie zuvor 9 beschrieben, erhalten. <ol><li> Kurz gesagt, geschnittenen Streifen der menschlichen Haut (~ 5 cm Länge) und behandle mit Thermo (0,5 mg / ml in Kochsalzlösung mit 10 mM Hepes pH 7,4) O / N bei 4 ° C. </li><li> Danach trennen Sie die Epidermis von der Dermis mit einer Pinzette. </li><li> Fein in einer 10 cm Petrischale schneiden die Lederhaut in kleine Stücke, Ort und lassen Sie sie für 1-2 Stunden unter einem sterilen Luftstrom trocknen. Ergänzen die Explantate regelmäßig mit DMEM, das 20% FBS. </li><li> Teilen Sie die aus wachsenden Fibroblasten bei konfluenten (in der Regel etwa 3 Wochen) mit 0,1% Trypsin, sicherzustellen, dass die Explantate weiterhin auf die Platte für weitere con haftenaufeinander folgenden Runden der Auswuchs. </li><li> Erweitern Sie die Fibroblasten aus dem gleichen Explantate für bis zu 3-mal in DMEM mit 10% FBS und Kryo-bewahren 14. Verwenden Sie die gleiche Charge von Fibroblasten für jede Versuchsreihe. HINWEIS: Die Fibroblasten wurden nicht für den Aufbau der Hautäquivalente bestrahlt. </li></ol></li><li> Vorbereitung des Scaffold <ol><li> Schneiden Sie die 0,4-0,6 mm dicken Viskose, Vliesfasermaterial (Produktdetails bei der Unterstützung der Excel-Tabelle) in gut abgegrenzten Kreise mit einem scharfen 11 mm Durchmesser Metall Puncher genau in 12-Well-Filtereinsätze passen. Dann legen Sie sie in den 12-Well-Filtereinsatz (Polyester kapillare Porenmembran, 3 &amp; mgr; m Porengröße) als Gerüst. Setzen Sie den kompletten Filter-Setup in eine sterile 12-Well-Platte. </li><li> Vorbereiten des Fibringels Verwendung eines Fibrinkleber-Kit für die Chirurgie bestehend aus einer Kombination von Fibrinogen und Thrombin. Pre-Verdünnung des Fibrinogen- sowie die Thrombin-Komponente des Kits bis 8 mg / ml und 10Einheiten / ml. Für eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte wie folgt vorgehen. <ol><li> 100 ul verdünnte Fibrinogen (8 mg / ml) mit 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ und Mg 2+, pH 7,0. Verdünnter 100 ul Thrombin (10 Einheiten / ml) mit 100 ul FCS enthaltenden 270.000 Fibroblasten. </li><li> Verzichtet werden 200 ul Thrombin Fibroblasten enthaltende zell mischen auf das Stützgerüst, wozu 200 &amp; mgr; l Fibrinogen hinzuzufügen (1: 1-Mischung), was zu einer Endkonzentration von Fibrinogen von 2 mg / ml und Thrombin von 2,5 Einheiten / ml. Gut mischen und gleichmäßig zu verteilen über die gesamte Fläche des Gerüsts durch vorsichtiges Pipettieren (Tag 1). HINWEIS: Nach 30 Minuten bei 37 ° C ein Gerinnsel umschließt den Fibroblasten gebildet haben, Füllen vollständig die Innenräume des Gerüsts und eine glatte obere Oberfläche. </li></ol></li></ol></li><li> Co-Kultur mit mTEZ <ol><li> Für Vorkultur, Tauchen Sie das Organkulturen inDMEM mit 10% FBS, 50 &amp; mgr; g / ml L-Ascorbinsäure und 1 ng / ml TGF-β1 mit einem Mediumwechsel alle zwei Tage für 4-5 Tage. </li><li> Am Tag der Aussaat mTEC Ersetzen des Mediums durch RFAD Medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) mit 10% FBS, 10 -10 M Choleratoxin, 0,4 mg / ml Hydrocortison, 50 &amp; mgr; g / ml L-Ascorbinsäure, RANK-Ligand (0,1 ug / ml) und 500 Einheiten / ml Aprotinin, wodurch frühreifen Fibrinolyse von Serinproteasen durch Fibroblasten sezerniert. </li><li> 7-8 Stunden später, die Co-Kulturen Set-up durch Impfen 250.000 mTEZ (entweder komplett mTEZ oder CD80 lo und CD80 hallo Untergruppen) in einem Volumen von 100 ul pro Vertiefung auf der Oberseite des Fibroblasten-Gerüst. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Neubauer Kammer (Tag 4). HINWEIS: Zu allen Zeiten der Thymus 3D organotypischen Kulturen werden in den Medien im Gegensatz zu Haut OTCs, die Klima aufgehoben sind untergetaucht. </li><li> Nach 24 Stunden Inkubation, liefern die Kulturen mit Medium (insgesamt Trägeraustausch) wie oben (Schritt 2.3.2) genannte jetzt haltendeng reduzierten Mengen Aprotinin, 250 Einheiten / ml (Tag 5). </li><li> Um die proliferative Aktivität von mTEZ beurteilen, fügen EdU (6,7 &amp; mgr; M / ml, das heißt 10 &amp; mgr; / Vertiefung) zu OTCs für 4 Stunden vor der Beendigung der Kultur. Führen Sie die Färbung von OTC Kryo-Abschnitte, wie in der EdU Imaging Kit in Kombination mit Co-Färbung von Keratin 14 in zwei Abschnitte einer jeden Kultur Probe oder durch Strömungs beschrieben Bestimmen Sie die proliferative Indizes mTEZ, entweder durch Zählen der K14 + EdU + Zellen Durchflusszytometrie (EDU Durchflusszytometrie, Abschnitt 1.7, aber statt Ly51-FITC verwendet CDR1-PB 15 bei einer 1: 100 Verdünnung und 2.3.6.4). </li><li> Nach 4-7 Tagen der Co-Kultur, kündigen die OTCs und Verfahren zur RNA-Isolierung, Kryo-Schnitte oder FACS-Analyse (Tag 8-11). <ol><li> Beenden der Kulturen mit einer Pinzette, Abtrennen der Gerüst / dermales Äquivalent vom Filter des Bohrlochs Einfügen. </li><li> Für Kryo-Schnitte, betten die gesamte OTC in OCT-Verbindung und frieren in liquid Stickstoffdampf vor dem Kryo-Schnitte. Bereiten Sie 5-7 um dicke OTC Abschnitte mit einem Kryostaten und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Für Immuno-Histochemie von Kryo-geschnitten OTCs ein anti Keratin 14 (AF64, Verwendung einer 1: 1000 Verdünnung) und anti-Vimentin (GP53, die Verwendung einer 1: 100 Verdünnung) Antikörper. Führen Sie die indirekte Immunhistochemie Färbung mit entsprechenden Sekundärantikörper. </li><li> Für die RNA-Isolierung, 1 ml Denaturierungslösung (enthält Phenol und Guanidiniumthiocyanat) in einer Schraubkappe eines 2 ml RNase frei Rohr. Schneiden Sie die gesamte OTC in Stücke mit einem Skalpell und fügen Sie in das Röhrchen mit Denaturierungslösung. Mechanisch zerkleinern das OTCs mit FastPrep Instrument zweimal für 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 6,0, legen Sie in zwischen auf Eis für 2 min (die Probe bei -80 ° C nach diesem Punkt gespeichert werden). Wenn bei -80 ° C eingefroren, aufgetaut auf Eis. Zentrifugieren der Rohre an 11,500-13,000 Upm 10 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein frisches Röhrchen, Inkubation für 5 min bei RT und follow RNA Isolation Protokolle unter Verwendung von sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, wie vom Hersteller beschrieben. </li><li> Für die FACS-Analyse, entfernen Sie das Gerüst und trennen Sie die Membran aus dem Fibrin / Fibroblasten / mTEC Gel. Feinschnitt das Gel mit einem Skalpell und verdauen in einem FACS-Röhrchen für ~ 20 min oder bis vollständig mit 2 ml Collagenase / Dispase bei 37 ° C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren verdaut. Rühren der Enzymlösung mit einer Pasteurpipette einmal alle 5 min. Nach der vollständigen Verdauung, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 &amp; mgr; m-Filter; Flecken auf der Einzelzellsuspension mit den Antikörpern, wie in 1.7 beschrieben, und mittels Durchflusszytometrie analysiert. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, keine finanzielle oder kommerzielle Interessenkonflikt.

Neben RTOCs, haben die 3D-OTCs weit überlegen in Bezug auf die TEC Differenzierung und PGE Wartung / Induktion (Tabelle 1) im Vergleich zu anderen (i) &quot;vereinfachte 3D-Kulturen&quot; mit Hilfe gewesen - Fibroblasten allein, ohne das Gerüst; (Ii) 2D-Systeme mit - Fibroblasten / Feeder-Zellen co-kultiviert mit TECs 10, (iii) 3T3-J2-Zellen bei TEC Klone zu entwickeln, aber pGE verloren geht, (iv) Matrigel oder (v) ECM-Komponenten (unveröffentlichte Daten). PGE wurde für bis zu 7 Tage in der...

Entwicklung von Thymozyten machen etwa 98% des Thymus, die restlichen 2% bestehen aus einer Vielzahl von Zellen, die zusammen bilden den Thymus-Stroma (dh Epithelzellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen). Die äußeren kortikalen Epithelzellen (CTEC) beschaffen Einwanderung von Pro-T-Zellen aus dem Knochenmark, T-Zell-Linie Induktion in multi pre-T-Zellen und positive Selektion von selbst MHC beschränkt unreifen Thymozyten. Die inneren Mark Thymusepithelzellen (mTEZ) in Toleranzinduktion dieser Thymozyten mit einer hochaffinen TCR Selbst Peptid / MHC-Komplexen durch entweder induzierende negative Selektion oder deren Abweichung in den regulatorischen T-Zelllinie beteiligt. Im Zusammenhang mit der zentralen Toleranzinduktion sind mTEZ, daß sie ein breites Spektrum von gewebe beschränkt Selbst-Antigene (TAA), die so Spiegeln des peripheren selbst exprimieren einzigartig. Dieses Phänomen wird als Promiscuous Genexpression (pGE)1,2. Die meisten aktuellen Studien zu diesem faszinierenden Zelltyp verlassen sich auf ex vivo isolierten Zellen, wie verschiedene kurzfristige 2D-Kultursystemen unweigerlich zum Verlust von PGE und Schlüsselregulator Moleküle wie MHC-Klasse II, FOXN1 und Aire in den ersten 2 Tagen 3-6 geführt . Es blieb jedoch unklar, welche bestimmte Komponenten und Funktionen des intakten 3D Geflecht des Thymus in 2D-Modelle fehlt. Die Reaggregation Thymus-Organkultur (RTOC) bisher das einzige 3D-System, das die Untersuchung der T-Zell-Entwicklung ermöglicht, einerseits und stromal cell biology, auf der anderen Seite war, in einer intakten Thymus Mikro 7. Dennoch haben RTOCs bestimmte Beschränkungen, das heißt sie enthalten bereits eine komplexe Mischung von Zellen, erfordern die Eingabe von fötalen Stromazellen und ertragen einer maximalen Kultivierungsdauer von 5 bis 10 Tagen. Der Mangel an reduktionistischen in vitro Kultursystemen hat das Studium behindertmehrere Aspekte der T-Zell-Entwicklung und Thymus Organogenese nicht zuletzt die molekulare Regulation von PGE und seiner Beziehung zu der Entwicklungsbiologie mTEZ. Durch die enge Bezogenheit der strukturierten Organisation der Epithelzellen der Haut und der Thymus, entschieden wir uns für ein 3D organotypische Kultur (OTC) System, das ursprünglich entwickelt worden war, um die Differenzierung von Keratinozyten in vitro nachzuahmen und so eine dermale Äquivalent. Die OTC-System besteht aus einem inerten Gerüstmatrix mit dermalen Fibroblasten, die in einem Fibrin-Gel, auf die Keratinozyten ausgesät 8,9 gefangen sind überlagert. Hier ersetzt wir Keratinozyten mit gereinigtem mTEZ. Und dabei die grundlegenden Merkmale dieses Modells optimierten wir bestimmte Parameter. In der angenommenen OTC Modell mTEZ vermehrt unterzog terminalen Differenzierung und gepflegt mTEC Identität und PGE, somit eng in vivo mTEZ Entwicklung nachahmt <sup&gt; 10 ist. Dieses Datenblatt ein detailliertes Protokoll, das die schrittweise Einrichtung von Thymus OTCs.

<table><tbody><tr><td>Trächtige C57BL/6 Mäuse&nbsp;</td><td>Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Mikrokügelchen, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 und -biotin)</td><td>Ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD80-PE Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PerCP Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC Antikörper</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific Blue</td><td>Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin 14 Antikörper</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antikörper</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-konjugiertes AffiniPure Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-konjugiertes AffiniPure F(ab')2 Fragment Ziege Anti-Meerschweinchen IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Konjugat</td><td>Molekulare Sonden (Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Durchflusszytometrie Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Filtereinsätze (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td>657631</tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Italien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin (Trasylol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Choleratoxin</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&szlig; 1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R& D systems</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (aka. Denaturierungslösung - Saure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0,2 mg/ml und 57U/ml Endkonz.</td></tr><tr><td>Neutrale Protease (Dispase)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0,2 mg/ml und 1,2 U/ml Endkonz.</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 & Mikro; g/ml Endkonz.</td></tr></tbody></table>

3d organotypische cokulturmodell unterstützung mark thymusepithel zellproliferation, differenzierung und genexpression promiscuous

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-Thymus-T-Zell-Entwicklung erfordert ein kompliziertes dreidimensionales Maschenwerk aus verschiedenen Stromazellen, dh Nicht-T-Zellen. Thymocyten durchqueren dieses Gerüst in einem hoch koordinierten zeitliche und räumliche Ordnung, während sequentiell vorbei obligatorischen Kontrollpunkte, dh T-Zelllinie Engagement, gefolgt von T-Zell-Rezeptor-Repertoire und Auswahl vor der Ausfuhr in die Peripherie. Die beiden wichtigsten ansässigen Zelltypen bilden dieses Gerüst sind kortikalen (CTEC) und Mark Thymusepithelzellen (mTEZ). Ein Schlüsselmerkmal der mTEZ ist die sogenannte Promiscuous Expression zahlreicher gewebe beschränkten Antigenen. Diese gewebe beschränkten Antigenen präsentiert werden, um Thymozyten direkt oder indirekt durch unreife mTEZ oder Thymus-dendritische Zellen, die jeweils resultierenden Selbsttoleranz. Geeignete in vitro Modelle emuliert die Entwicklungswege und Funktionen der CTEC und mTEZ liegen noch lacKönig. Dieser Mangel an angemessenen experimentellen Modellen hat zum Beispiel beeinträchtigt die Analyse der Promiscuous Genexpression, die immer noch schlecht auf zellulärer und molekularer Ebene verstanden wird. Wir angepasst 3D organotypischen Co-Kultur-Modell zur Kultur ex vivo isolierten mTEZ. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um Keratinozyten derart zu kultivieren, um eine Hautäquivalents in vitro zu erzeugen. Das 3D-Modell beibehalten wichtigsten Funktionsmerkmale mTEC Biologie: (i) die Proliferation und terminale Differenzierung von CD80 lo, Aire-negative in CD80 hallo, Aire-positive mTEZ, (ii) Reaktionsfähigkeit auf RANKL, und (iii) nachhaltige Ausdruck FOXN1, Aire und gewebe eingeschränkt Gene in CD80 hallo mTEZ.

Wir nahm eine 3D organotypischen Co-Kultur-Modell (3D OTC), die ursprünglich für die in-vitro-Langzeitkultur von Keratinozyten 9 entwickelt hatte. MACS-angereicherten mTEZ (siehe MACS Anreicherung Schema Abbildung 1) wurden auf ein Gerüst aus einer Fibrin-Gel und eingeschlossene Fibroblasten ausgesät. Die Fibroblasten stellen die wesentlichen extrazellulären Matrix (ECM), welche mTEZ in vitro. MTEZ wurden in OTCs für 4-14 Tage in Gegenwart von RANKL in Submerskulturen Gegens...

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, thymische, medulläre epitheliale Zellen oder mTEC in einem dreidimensionalen organotypischen Kultur- oder OTC-System zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das faserige Gerüstmaterial in einen 12-Loch-Filtereinsatz gegeben wird, gefolgt von der Schichtung eines frisch hergestellten Fibrin-Gels, das humane Hautfibroblasten enthält. Nach vier bis fünf Tagen Vorkultur werden die MTS auf das Gerüst aufgebracht und unter untergetauchten Kulturbedingungen kultiviert.Schließlich können Immunhistochemie, RNA-Isolierung und Fakten an den Co-Kulturen durchgeführt werden, um die Entwicklung des CED Mtech zu bewerten. Der Hauptvorteil der 3D-organotypischen Co-Kultursysteme im Vergleich zu den bestehenden 2D-Kultursystemen liegt darin, dass sie deutlich überlegen sind, was die Rekapitulation der Mtech-Differenzierung, -Proliferation und die Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression betrifft. Heute wird Iris Martin, eine Technikerin aus unserem Kooperationslabor, diese Technik demonstrieren.Wenn die humanen dermalen Fibroblasten Konfluenz erreicht haben, bereiten Sie die Gerüstfasern vor, indem Sie 0,4 bis 0,6 Millimeter dicke Stücke aus viskoelastischem Vliesfasermaterial erhitzen, trocknen und bügeln. Schneiden Sie diese mit einem Metalllochstecher in 11 Millimeter große Kreise. Legen Sie das zugeschnittene Fasermaterial zwischen zwei Objektträger, umwickeln Sie die Objektträger mit Folie und sterilisieren Sie sie im Autoklaven.Wenn die Inserts sterilisiert sind, geben Sie diese in die Vertiefungen einer sterilen 12-Loch-Platte und dann jeden Scaffolder in ein entsprechendes Insert. Anschließend mischen Sie 2,7 × 10⁵ Fibroblasten in 100 µL Fötales Rinderserum mit 100 µL frisch verdünntem Thrombin pro Scaffold. Geben Sie die Thrombin-Fibroblasten-Mischung auf jeden der Scaffold, gefolgt von 200 µL frisch verdünntem Fibrinogen.Anschließend die Zellmischung in jedem Brunnen durch vorsichtiges Pipettieren gleichmäßig über das gesamte Gerüst verteilen. Das Bild zeigt das Wachstum der humanen dermalen Fibroblasten mit dem Fibrin-Gel am ersten und vierten Tag der Kultur. Bereiten Sie ein Testgel in einem Kontrollbrunnen ohne Gerüst vor, um die Zeit und die Bildung der Gerinnsel zu diesem Zeitpunkt zu verfolgen.Beurteilen Sie die Gerinnselbildung mithilfe einer Pipettenspitze oder durch Umkehren der Platte, nachdem die Fibroblasten geronnen sind; tauchen Sie die Organkulturen in Medium ein, das mit Sorbinsäure und TGF-beta-1 für vier bis fünf Tage ergänzt wurde. Am Tag der MT-E-Sämanlage ersetzen Sie dieses Medium durch RFAD-Medium, das 500 Einheiten pro Milliliter Aprotinin enthält, um eine vorzeitige Fibrinolyse zu verhindern. Sieben bis acht Stunden später säen Sie 2,5 × 10⁵ MT-E, suspendiert in 100 Mikrolitern RFAD, auf die Oberseite jedes Scaffolds aus und inkubieren die Kokulturen für 24 Stunden. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das 250 Einheiten pro Milliliter Aprotinin enthält, und kultivieren weitere vier bis sieben Tage. Um die Entwicklung der mTexs am Ende der Kultur mittels Immunhistochemie zu beurteilen, trennen Sie mit einer Pinzette das Scaffold-Derivat von jedem Filter. Setzen Sie die OTCs in OCT-Compound ein und frieren Sie die OTCs in der gasförmigen Phase über flüssigem Stickstoff ein, um die O-T-C-R-N-A zu isolieren.Nachdem das Gerüstgewebe von den Filtern getrennt wurde, schneiden Sie die OTCs mit einem Skalpell in Stücke und überführen Sie diese in ein zwei Milliliter fassendes, RNA-freies Röhrchen, das ein Milliliter Denaturierungslösung enthält. Zerkleinern Sie die OTCs anschließend zweimal mit einem Schnellpräparationsgerät mechanisch jeweils 30 Sekunden lang bei einer Geschwindigkeit von 6,0, wobei zwischen den beiden Zerkleinerungsschritten eine zweiminütige Ruhephase auf Eis eingehalten wird. Anschließend isolieren Sie die RNA mittels saurer Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion gemäß den Herstellerangaben.Um die OTCs mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, entfernen Sie die Membran und trennen Sie das Gerüst vom Fibrin-Fibroblast-mtech-Gel. Schneiden Sie das Gel anschließend wie eben gezeigt mit einem Skalpell durch. Überführen Sie das Gewebe in ein FACS-Röhrchen.Fortsetzen mit zwei Millilitern Kollagenase-Dispaste. Anschließend das Gefäß bei 37 Grad Celsius in ein Wasserbad mit magnetischem Rührer für 20 Minuten stellen. Alle fünf Minuten das Gewebe durch Pipettieren verwirbeln, sobald es vollständig verdaut ist.Filtrieren Sie die resultierende Zellsuspension durch einen 70-Mikrometer-Filter und färben Sie die Zellen mit den geeigneten Antikörpern, wie veranschaulicht. Die MTS können anhand ihres Keratin-14-Ausdrucks identifiziert werden, wodurch sie sich leicht von den Menton-positiven Fibroblasten unterscheiden lassen. Interessanterweise weisen die unreifen und reifen M Texs unterschiedliche, jedoch äußerst reproduzierbare Wachstumsmuster in der Kultur auf.Die unreifen CD80Dlow MTexs bilden beispielsweise typischerweise Doppelschichten in engem Kontakt mit den Fibroblasten. Während die CD80Dhigh MTS kompakte Zellaggregate bilden, die von den Fibroblasten begrenzt werden, überleben die mTec-Subpopulationen unter den dargestellten 3D-OTC-Bedingungen nicht nur, sondern proliferieren auch, wie durch ihre EDU-Inkorporation belegt ist. Interessanterweise proliferieren die CD80low MTecs in Gegenwart von RANKL mit einer höheren Rate.Während das Gegenteil für CD80-hohe MT-Techs gilt, sollten Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie man MT.Techs unter Verwendung von 3D-OTCs kultiviert. Diese Methode ist hinsichtlich der Tech-Differenzierung und der PGE-Erhaltung sowie -Induktion den 2D-Kultursystemen weit überlegen und bietet das Potenzial, mehrere Take-Parameter zu untersuchen oder zu manipulieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video die Herstellung von 2-dGuo behandelten reaggregieren Thymus Kulturen demonstriert.

Reaggregieren Thymus Kulturen

Dieses Video zeigt die Zerlegung und Entfernung der fetalen Thymus sowie die Vorbereitung der ex vivo Kulturen von 2-dGuo behandelten Thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Erzeugung funktioneller antigenspezifischer T-Zellen aus iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen unter Verwendung eines dreidimensionalen Thymuskultursystems. Die Co-Kultivierung der iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen mit endogenen lymphozytendepletierten Mäusen aus fetalen Thymuslappen führte zu einer erfolgreichen Reifung der T-Zellen zur Bildung von CD8αβ+ MHC-Klasse I+ iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten (iTEs).

Dreidimensionales Thymuskultursystem zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Thymus-Emigranten

Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Wir beschreiben die Herstellung von Thymus-Scheiben, die in Kombination mit Durchflusszytometrie verwendet werden können positive und negative Selektion der Entwicklung T-Zellen zu modellieren. Thymus Scheiben können auch für die in situ - Analyse von Thymozyten Migration, Lokalisierung angepasst werden und Signalisierung über Immunofluoreszenz und Zwei-Photonen - Mikroskopie.

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von doppelt negativen Thymozyten aus dem Thymus der Maus, gefolgt von retroviraler Transduktion und Co-Kultur auf dem delta-like 4-exprimierenden Knochenmark-Stroma-Zelllinien-Co-Kultursystem (OP9-DL4) zur weiteren funktionellen Analyse.

Kokultur und Transduktion von murinen Thymozyten auf Delta-ähnlichen 4-exprimierenden Stromazellen zur Untersuchung von Onkogenen bei T-Zell-Leukämie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Bildung von humanen iPSC-abgeleiteten Thymus-Organoiden, die in 3D-Fibrin-Hydrogelen gezüchtet werden, um die Reifung der Thymusepithelzellen (TEC) und deren verlängerte Erhaltung sowie die Thymopoese in vitro zu unterstützen.

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Um die Differenzierung und Funktion der CD8-T-Zellen in vitro zu untersuchen, können CD8-T-Zellen aus der Maus isoliert werden, um langfristig mit vorgefertigten infizierten vaginalen Epithelorganoiden der Maus kultiviert zu werden. Hier beschreiben wir diesen Prozess und bewerten den Erwerb von Markern der ansässigen Gedächtnis-T-Zellen bei Kokultur.

In vitro Resident Memory CD8 T-Zell-Differenzierung mit dem epithelialen Organoid-T-Zell-Kokultursystem

Erfahren Sie die Kultivierung von medullären Thymusepithelzellen in einem 3D-organotypischen Kokultursystem mit Fibringel und Fibroblasten. Diese Methode ermöglicht überlegene Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung promiskuitiver Genexpression im Vergleich zu 2D-Systemen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous (Video) | JoVE Journal

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

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