Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erfassung der Dynamik der Gewebereparatur an einem Stereomikroskop mit Hilfe von Zeitraffer-Bildgebung. Dies wird erreicht, indem die Zebrafischembryonen zunächst in das Larvenstadium aufgezogen werden, wenn die Schwanzflosse ausreichend zu einer Größe entwickelt ist, bei der Amputationen problemlos durchgeführt werden können. Dies wird in der Regel nach dem Schlüpfen erreicht.

Der zweite Schritt besteht darin, die Schwanzflosse mit einer Spritzennadel zu amputieren. Der dritte Schritt besteht darin, die Larven in eine Bildgebungskammer zu setzen und einen Zeitrafferfilm mit einem Stereomikroskop aufzunehmen. Der letzte Schritt besteht darin, die Regeneration der Schwanzflosse unter Verwendung von bildgebender Analysesoftware wie Bit Plains S oder der Open-Source-Software Image J.Hi.My Laborstudien, Wundreparatur und Geweberegeneration am Modell des Zebrafisches zu quantifizieren.

Heute demonstrieren wir eine Methode, die die Dynamik dieser Prozesse mit Hilfe der Hellfeld-Stereomikroskopie in Echtzeit erfasst. Heute stellen wir eine Methode vor, die die frühen Prozesse der Geweberegeneration anhand der Schwanzflosse der Zebrafischlarve erfasst. Das vorgestellte bildgebende Verfahren bietet die Möglichkeit, das Verhalten der gesamten Gewebewaage in einer einfachen Mikroskopumgebung zu beobachten und zu analysieren, die leicht an jedes Stereomikroskop angepasst werden kann, das mit Zeitrafferfunktionen ausgestattet ist.

Also lasst uns loslegen. Aufzucht des Zebrafisches in das Larvenstadium. Die Wundheilung in der Schwanzflosse kann am besten nach dem Schlüpfen beobachtet werden, da sich die Schwanzflosse zu diesem Zeitpunkt ausreichend entwickelt hat und Amputationen problemlos durchgeführt werden können, ohne das Rückenmark oder andere Gewebe zu beschädigen.

Sammeln Sie in unmittelbarer Nähe die Eier und brüten Sie sie über Nacht in einem 28 Grad Celsius heißen Brutkasten aus. Am nächsten Morgen die toten Embryonen entfernen und mit Embryomedium spülen, das 0,03%ige Instant-Meeraquariensalzlösung enthält. Falls erforderlich, geben Sie Embryomedium mit 0,003 % Phäno-Schilddrüse in die Schale, um eine Pigmentierung der Larven zu verhindern.

Für diese Demonstration lassen wir die Embryonen bis zwei Tage nach der Befruchtung im Inkubator entwickeln, wenn die Larven aus ihrer Vorbereitung der Bildgebungskammer geschlüpft sind. In diesem Schritt stellen wir zwei Methoden zum Aufbau der Bildgebungskammer vor. Methode eins besteht aus einer Bildgebungskammer aus PVC- oder Teflonschläuchen in Trinkwasserqualität, die in jedem Baumarkt erhältlich sind.

Verwenden Sie Schläuche mit einem Außendurchmesser von 25 Millimetern und einem Innendurchmesser von 20 Millimetern, da diese die geeignete Größe für die Befestigung von Deckgläsern haben. Schneiden Sie den Schlauch so zu, dass 10 Millimeter dicke Ringe so gleichmäßig wie möglich werden. Verwenden Sie Schleifpapier, um die Ränder zu glätten, und spülen Sie sie mit Wasser und Ethanol ab.

Lassen Sie die Kammer an der Luft trocknen. Methode zwei besteht entweder darin, einen vorgefertigten matten Tech-Glasboden und eine Glasober-Bildgebungskammer zu verwenden oder eine Bildgebungskammer aus einer kleinen Petrischale herzustellen. Um Ihre eigene Bildgebungskammer herzustellen, verwenden Sie eine 35- oder 50-Millimeter-Petrischale und bohren Sie ein 10-Millimeter-Loch in den Deckel.

Tragen Sie anschließend Silikonfett auf die Außenseite des Deckglases auf und befestigen Sie mit einer sauberen Pipettenspitze ein 25 x 25 Millimeter großes quadratisches oder rundes Deckglas an der Außenseite, um sicherzustellen, dass das Montageglas fest sitzt. Befestigen Sie während des bildgebenden Verfahrens ein feines Kunststoffnetz an der Innenseite des Deckglases. Dies kann erreicht werden, indem das Netz in die Größe des inneren Ringdurchmessers geschnitten wird und dann ein kleines Rechteck, etwa dreimal so groß wie die Larven, in die Mitte des Netzes geschnitten wird.

Montage und Bildgebung der Larven vor der Verletzung. Dieser Schritt eignet sich für die spätere Quantifizierung der Flossenregeneration. Bereiten Sie zunächst eine 0,5%ige Agro-Lösung mit niedrigem Schmelzgehalt in Embryomedium für die Immobilisierung der Probe vor, indem Sie die anästhesierende Larve in die Aro-Lösung überführen, die bei 42 Grad Celsius gehalten wurde.

In einem Heizblock die Larven mit einem Tropfen Agros in eine kleine Petrischale geben und die Larven auf die Seite legen. Lassen Sie die Aros mit einer verschlossenen Mikroladerspitze erstarren und fügen Sie Trica-Lösung hinzu. Fahren Sie mit dem Stereomikroskop fort, das später verwendet wird.

Für die Zeitraffer-Bildgebung verwenden wir ein Stereomikroskop zes discovery V 12 und die Axio Vision Software zur Demonstration. Passen Sie zunächst die Mikroskopeinstellungen an, indem Sie das geeignete Objektiv und die Vergrößerung für die Bildgebung auswählen. Wählen Sie dann in der alvis Software den Kameraerkennungsmodus am Mikroskop aus.

Wählen Sie den Live-Modus, um die Larve auf dem Bildschirm zu sehen. Öffnen Sie das Eigenschaftenfenster, um die Helligkeit automatisch zu erkennen, und passen Sie den Kontrast an der Mikroskop-Durchleuchtungsbasis manuell an. Bewegen Sie die Larven aus dem Sichtfeld und wählen Sie die Funktion zur Schattierungskorrektur.

Um Hintergrundgeräusche zu minimieren, positionieren Sie die Larven wieder im Sichtfeld und machen Sie einen Schnappschuss. Speichern Sie das Bild, um sich auf die Verwundung vorzubereiten. Entferne die Larven von den Aros, indem du zuerst die Aeros vom Kopf abkratzst.

Dies ermöglicht es den Larven, aus den Aeros zu schlüpfen, indem der Kopf vorsichtig vom verbleibenden Aeros-Amputationsassay weggezogen wird. Bereiten Sie eine 1,5%ige Aeros-Platte mit Instant-Meersalzlösung zu. Legen Sie die Larven unter einem Stereomikroskop seitlich auf den erstarrten Aros und amputieren Sie den distalen Teil der Schwanzflosse mit einer 23-Gauge-Spritzennadel

Montage der Larven für die Zeitrafferaufnahme. Wir stellen zwei bildgebende Verfahren im Zeitraffer vor. In der ersten Methode zeigen wir, wie die Larven im Kammerring nach dem Aufstellen der Larven abgebildet werden können.

Kratzen Sie die erstarrte Agros, die die distale Schwanzflosse umgibt, vorsichtig mit einer verdeckelten Mikrolader-Pipettenspitze ab. Dies ermöglicht eine ordnungsgemäße Wundheilung oder Geweberegeneration. Versuchen Sie, die Flosse nicht wiederholt zu verletzen, ohne das Gewebe zurückzuhalten. Entfernen Sie während dieses Vorgangs unerwünschte Ablagerungen aus der Kammer, die das bildgebende Verfahren beeinträchtigen, indem Sie die alte Lösung ersetzen.

Tragen Sie mit frischer Trica-Lösung Silikonfett auf die Oberseite der Kammer auf und füllen Sie den Kammerring mit frischer Trica-Lösung. Bringen Sie einen Objektträger auf die Oberseite an, um die zweite Methode der Kammer zu versiegeln. Bei dieser Methode zeigen wir Ihnen, wie Sie die Larven in einer Petrischale mit Glasdeckel abbilden können.

Setzen Sie die Larven auf den Deckel, decken Sie den Deckel ab und füllen Sie den Deckel. Mit Trica-Lösung. Den Agros von der Schwanzflosse abkratzen.

Tragen Sie anschließend Silikonfett auf den oberen Rand der unteren Kammer auf und füllen Sie die Kammer mit Trica-Lösung. Dekantieren Sie die Trica-Lösung vorsichtig vom Deckel und drehen Sie den Deckel um, um die Larve in die Trica-Lösung der unteren Kammer zu tauchen, was in einem leichten Winkel erfolgen kann. Um Lufteinschlüsse zu vermeiden, wird die Kammer mit dem Silikonfett-Zeitrafferbild versiegelt, um sicherzustellen, dass eine angemessene Temperatur von 28 Grad Celsius aufrechterhalten wird.

Montieren Sie eine beheizte Inkubationskammer aus Luftpolsterfolie aus Pappe zur Isolierung und eine verdrahtete Kuppel, wie sie für die Inkubation von Hühnereiern als Wärmequelle verwendet wird. Platzieren Sie die Inkubationskammer um das Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 28 Grad Celsius ein. Öffnen Sie für etwa 10 bis 20 Minuten oder bis sich die Temperatur stabilisiert hat, die Vorderseite der beheizten Inkubationskammer und setzen Sie die Bildgebungskammer auf das Mikroskop.

Stellen Sie sich mit dem Deckglas nach oben in Richtung Objektiv. Positionieren Sie die Larvenflosse so, dass zwei Drittel des Gesichtsfeldes unbesetzt bleiben, um sicherzustellen, dass das Wachstum und die Regeneration der Flosse im Verlauf des bildgebenden Verfahrens erfasst werden können. Ohne die Larven im 60-dimensionalen Aufnahmefenster der Software neu positionieren zu müssen, wählen Sie die Option Z-Stapel und Zeitraffer auf der Registerkarte Zack und im Slice-Modus.

Wählen Sie die Schichtdicke und dann den Start-Stopp-Modus aus. Definieren Sie die obere und untere Position des Stapels in der Zeitraffertabelle. Wählen Sie das Intervall und die Dauer des Films aus und drücken Sie dann die Starttaste, um die Aufnahme zu starten.

Überprüfen Sie innerhalb der ersten Stunde die und Zack-Grenzen der Larven. Gegebenenfalls die Larven im Laufe der Zeit neu positionieren, da sie sich aufgrund des Wachstums oder der unterschiedlichen Zusammensetzung des Agros verschoben haben können. Speichern Sie die Datei am Ende der Zeitrafferaufnahme und fahren Sie mit der Datenanalyse im Nachbearbeitungs- und Quantifizierungsschritt fort.

In diesem Abschnitt besprechen wir verschiedene Möglichkeiten, die generierten Daten der Methode one imas zu analysieren. Zunächst werden wir besprechen, wie man mit der imas-Software das Lamellenwachstum ermitteln kann. Öffnen Sie den Zeitrafferfilm in der Arais-Software und speichern Sie die Dateien im MRS-Dateiformat.

Um die Leistung der Software zu verbessern, wählen Sie die orthogonale Ansicht aus, um den Film als Projektion anzuzeigen. Um die Lamellenlänge zu messen, wählen Sie die Option Neue Messpunkte hinzufügen in der oberen linken Symbolleiste. Wählen Sie unter Liste der sichtbaren Statistikwerte konfigurieren die Statistikwerte aus, die im Zeilenmodus angezeigt werden sollen.

Wählen Sie auf der Registerkarte "Einstellungen" in den Beschriftungseigenschaften Paare aus, wählen Sie "Name" und "Abstand" aus, um den Abstand zwischen den Punkten A und B neben der Messlinie anzuzeigen, wechseln Sie in den Bearbeitungsmodus und halten Sie die Umschalttaste gedrückt, um den ersten Punkt an der distalen Flosse auszuwählen. Verwenden Sie dann die gleiche Konfiguration, um den zweiten Punkt am distalen Ende des No-Accords auszuwählen. Die Distanz wird im Bild angezeigt und kann unter dem Reiter Statistik exportiert werden.

Durch Auswahl der Disc-Schaltfläche Alles exportieren unten rechts. Alternativ zur Option "Messpunkte" kann der Schichtenbetrachter verwendet werden, um Entfernungen im Schichtansichtsmodus zu messen. Scrollen Sie zu einer gewünschten Position und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die erste und zweite Position, die Entfernung wird angezeigt.

Diese Option erlaubt jedoch keinen Datenexport. Nun gehen wir kurz darauf ein, wie man den Finnenbereich mit Hilfe der Open-Source-Software bestimmen kann. Bild J.Öffnen Sie den Zeitrafferfilm in Bild J mit einem Plugin, das das Zeiss Axio Vision-Dateiformat erkennt.

Alternativ können Sie eine unkomprimierte TIFF-Sequenz laden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Dateiinformationen unter analyze select set scale gespeichert werden, um die Entfernung, die Pixel und die bekannte Entfernung zu definieren, wenn sie nicht in der Datei beibehalten werden. Stellen Sie außerdem die Länge der Einheit auf Mikrometer ein.

In der Symbolleiste. Wählen Sie das Auswahlwerkzeug für die freie Hand aus und umreißen Sie die Wunde, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Während Sie entlang der gewickelten Ränder zeichnen.

Klicken Sie unter Analysieren auf die Option Messen, um den Bereich der repräsentativen Wundergebnisse anzuzeigen. Die Amputation der Flosse führt zu einer teilweisen Regeneration im Laufe von 36 Stunden nach der Amputation. Die Flächenmessungen der Flosse zeigen, dass die Flossenamputation bis etwa 14 Stunden nach der Amputation eine Abnahme des Flossengewebes auslöst, vermutlich aufgrund des Zelltods, auf den eine dünne Regenerationslänge folgt.

Der Vergleich der amputierten und regenerierten Flosse zeigt eine 2,48-fache Zunahme der Flossenlänge innerhalb von 36 Stunden. Die Amputation löst zunächst einen Purse-String-Effekt aus, der durch Kontraktionen über Aktin-Myosin-Kabel gekennzeichnet ist, die in den Flossenfaltenzellen vorhanden sind, aus der Amputationswunde austreten und anschließend gereinigt werden. Die Körperlänge nimmt zunächst zu, aber die Flosse regeneriert sich nicht.

In den Anfangsphasen. Etwa 14 Stunden nach der Amputation beginnt die Flosse von der proximalen in die distale Position zu wachsen. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Amputation die Wundkontraktion auslöst, die für die Förderung der Zellextrusion unerlässlich sein kann.

Sobald der Prozess abgeschlossen ist, beginnt sich die Flosse zu regenerieren. Das Wachstum der Entwicklungsflosse scheint zu erfolgen. Unabhängig von diesem Prozess haben wir eine Methode vorgestellt, die es ermöglicht, die dynamischen Prozesse der Gewebereparatur an lebenden Zebrafischlarven zu beobachten.

Dieses Vorgehen erfordert bestimmte Aspekte, die wir getestet haben, um das Ergebnis zu optimieren. Ein klarer Vorteil des vorgestellten bildgebenden Verfahrens besteht darin, dass es problemlos an jedes Stereomikroskop angepasst werden kann, das mit einer CCD-Kamera und einer TimeLapse-Software ausgestattet ist. Es bietet auch eine kostengünstige Alternative zum teureren konfokalen Bildgebungssystem.

Obwohl bei dieser Methode keine Fluoreszenz- oder Zelldetektion verwendet wird, kann sie für solche Anwendungen erweitert werden, indem ein automatisiertes System zur Zertrümmerungskontrolle und eine Dekonvolutionssoftware nach der Bildgebung verwendet werden, um die Prozesse der Wundreparatur und -regeneration mit subzellulärer Auflösung weiter zu beobachten. Diese Methode kann den Studierenden ein besseres Verständnis der grundlegenden biologischen Prozesse, der zugrundeliegenden Gewebereparatur und -regeneration vermitteln. Die optische Klarheit und die Leichtigkeit, mit der embryonale und larvale Zebrafische verwendet werden können, sowie die Anpassungsfähigkeit des Systems an jedes Stereomikroskop machen es geeignet für den Unterricht grundlegender Wirbelbiologie im Klassenzimmer.