Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

In diesem Video wird eine Methode zur Aufzeichnung der Gewebehe­dynamik am Stereomikroskop mithilfe von Zeitrafferaufnahmen demonstriert. Dazu werden zunächst Zebrafischembryonen bis zu larvalen Entwicklungsstadien herangezogen, in denen die Schwanzflosse ausreichend entwickelt ist, um Amputationen problemlos durchführen zu können. Dies wird üblicherweise nach dem Schlüpfen erreicht.

Der zweite Schritt besteht darin, die Schwanzflosse mit einer Spritzennadel zu amputieren. Der dritte Schritt ist das Einbetten der Larven in eine Abbildungskammer und die Aufnahme eines Zeitrafferfilms an einem Stereomikroskop. Der letzte Schritt ist die Quantifizierung der Regeneration der Schwanzflosse mithilfe einer Bildanalyse-Software wie Bit Plains S oder der Open-Source-Software ImageJ. Hallo. Mein Labor untersucht die Wundheilung und Geweberegeneration unter Verwendung von Zebrafischen als Modellorganismus.

Heute werden wir eine Methode demonstrieren, die die Dynamik dieser Prozesse in Echtzeit mittels Hellfeld-Stereo-Mikroskopie erfasst. Wir werden eine Methode vorstellen, die die frühen Vorgänge der Geweberegeneration unter Verwendung der Zebrafisch-Larven-Schwanzflosse aufzeigt. Die dargestellte Bildgebungsmethode bietet die Möglichkeit, Verhaltensweisen auf Ganzgewebeebene in einer einfachen Mikroskopieanordnung zu beobachten und zu analysieren, die leicht an jedes Stereo-Mikroskop mit Zeitrafferkapazität angepasst werden kann.

Beginnen wir also. Zucht von Zebrabärblingen bis zu den Larvenstadien. Die Wundheilung in der Schwanzflosse lässt sich am besten nach den Schlüpfstadien beobachten, da die Schwanzflosse zu diesem Zeitpunkt ausreichend entwickelt ist und Amputationen leicht durchgeführt werden können, ohne das Rückenmark oder andere Gewebe zu beschädigen.

In unmittelbarer Nähe die Eier sammeln und über Nacht in einem Inkubator bei 28 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Morgen die toten Embryonen entfernen und mit Embryomedium, das 0,03 % Instant Ocean Aquariumsalzlösung enthält, spülen. Falls erforderlich, Embryomedium mit 0,003 % Pheno-Thyroid zur Schale hinzufügen, um die Pigmentierung der Larven zu verhindern.

Für diese Demonstration lassen wir die Embryonen bis zu zwei Tage nach der Befruchtung im Inkubator entwickeln, bis die Larven aus ihren Kons die Vorbereitung der Abbildungskammer geschlüpft sind. In diesem Schritt stellen wir zwei Methoden zur Konstruktion der Abbildungskammer vor. Methode eins besteht aus einer Abbildungskammer, die aus Trinkwasserqualität-PVC- oder Teflonrohr hergestellt ist und in jedem Baumarkt erhältlich sein kann.

Verwenden Sie Schläuche mit einem Außendurchmesser von 25 Millimetern und einem Innendurchmesser von 20 Millimetern, da diese die geeignete Größe für die Befestigung von Deckgläsern aufweisen. Schneiden Sie den Schlauch in möglichst gleichmäßige Ringe mit einer Dicke von 10 Millimetern. Glätten Sie die Kanten mit Schleifpapier und spülen Sie sie mit Wasser und Ethanol ab.

Lassen Sie die Kammer an der Luft trocknen. Methode zwei besteht entweder darin, eine vorgefertigte matte Tech-Glasboden-Glastopf-Bildgebungskammer zu verwenden oder eine Bildgebungskammer aus einer kleinen Petrischale herzustellen. Um eine eigene Bildgebungskammer herzustellen, verwenden Sie eine 35- oder 50-mm-Petrischale und bohren ein 10-mm-Loch in den Deckel.

Tragen Sie anschließend Silikonfett auf die Außenseite der Deckglasplatte auf und befestigen Sie mit einer sauberen Pipettenspitze ein 25 mal 25 Millimeter großes quadratisches oder rundes Deckglas von außen, um sicherzustellen, dass das Montagemedium fest haftet. Befestigen Sie während des Abbildungsverfahrens ein feines Kunststoffnetz an der Innenseite des Deckglases. Dies kann erreicht werden, indem das Netz auf den Durchmesser des inneren Rings zugeschnitten und anschließend in die Mitte des Netzes ein kleines Rechteck etwa dreimal so groß wie die Larven geschnitten wird.

Einbetten und Abbilden der Larven vor der Verletzung. Dieser Schritt eignet sich für die spätere Quantifizierung der Flossenregeneration. Bereiten Sie zunächst eine 0,5 %ige Low-Melt-Agarose-Lösung in Embryomedium zur Immobilisierung der Probe vor, indem Sie die anästhesierte Larve in die Agarose-Lösung überführen, die bei 42 Grad Celsius gehalten wurde.

Übertragen Sie die Larven in einem Heizblock mit einem Tropfen Agarose in eine kleine Petrischale und positionieren Sie die Larven auf die Seite. Lassen Sie mit einer abgedeckten Mikrolader-Spitze die Agarose erstarren und fügen Sie Trica-Lösung hinzu. Fahren Sie mit dem Stereomikroskop fort, das später verwendet wird.

Für die Zeitrafferaufnahmen verwenden wir ein Stereomikroskop vom Typ ZES Discovery V 12 und die Software Axio Vision zur Demonstration. Zunächst stellen Sie die Mikroskopeinstellungen ein, indem Sie das geeignete Objektiv und die erforderliche Vergrößerung für die Aufnahme auswählen. Danach wählen Sie im Alvis-Softwaremodul den Kameradetektionsmodus am Mikroskop aus.

Wählen Sie den Live-Modus, um die Larve auf dem Bildschirm zu betrachten. Öffnen Sie das Eigenschaftenfenster, um die Helligkeit automatisch zu erfassen, und stellen Sie den Kontrast manuell an der Durchlichtbasis des Mikroskops ein. Bewegen Sie die Larven außerhalb des Sichtfeldes und wählen Sie die Schattierungskorrekturfunktion aus.

Um das Hintergrundrauschen zu minimieren, positionieren Sie die Larven erneut im Sichtfeld und machen Sie eine Momentaufnahme. Speichern Sie das Bild, um die Verletzung vorzubereiten. Entfernen Sie die Larven aus dem Aros, indem Sie zuerst die Aeros vom Kopf abschaben.

Dadurch können die Larven aus dem Agar herausschlüpfen, indem man vorsichtig den Kopf vom verbleibenden Agar wegzogen. Bereiten Sie eine 1,5 %ige Agarplatte unter Verwendung einer Instant-Ocean-Salzlösung vor. Unter einem Stereomikroskop platzieren Sie die Larven seitlich auf den erhärteten Agar und amputieren den distalen Teil der Schwanzflosse mit einer 23-Gauge-Spritzennadel.

Montage der Larven für die Zeitrafferaufnahme. Wir stellen zwei Methoden für die Zeitrafferaufnahme vor. Bei der ersten Methode zeigen wir, wie die Larven nach der Montage im Kammer-Ring abgebildet werden.

Entfernen Sie vorsichtig das verfestigte Agaros um die distale Schwanzflosse mit der abgedeckten Spitze einer Mikrolader-Pipette. Dies ermöglicht eine ordnungsgemäße Wundheilung oder Geweberegeneration. Versuchen Sie, das Gewebe nicht mehrfach zu verletzen, ohne es zu fixieren. Entfernen Sie während dieses Vorgangs unerwünschte Ablagerungen, die die Bildgebung beeinträchtigen, aus der Kammer, indem Sie die alte Lösung ersetzen.

Mit frischer Trica-Lösung Silikonfett auf die Oberseite der Kammer auftragen und den Kammerreifen mit frischer Trica-Lösung füllen. Eine Glasplatte darauflegen, um die Kammer abzudichten – Methode zwei. Bei dieser Methode zeigen wir Ihnen, wie man die Larven in einer Petrischale mit Glasboden abbildet.

Befestigen Sie die Larven auf dem Deckel, Deckglas und füllen Sie den Deckel mit Trica-Lösung. Kratzen Sie das Agarose vom Schwanzflossensaum ab.

Als Nächstes Silikonfett auf den oberen Rand der unteren Kammer auftragen und die Kammer mit Trica-Lösung füllen. Die Trica-Lösung vorsichtig vom Deckel abgießen und den Deckel umdrehen, um die Larve in die Trica-Lösung der unteren Kammer einzutauchen, wobei ein leichter Winkel gewählt werden kann. Um Luftblasen zu vermeiden, wird die Kammer mit Silikonfett abgedichtet, und die Zeitrafferaufnahme erfolgt unter Gewährleistung einer konstanten Temperatur von 28 Grad Celsius.

Bauen Sie eine beheizte Inkubationskammer aus Pappe, umhüllt mit Luftpolsterfolie zur Isolierung, und einer angeschlossenen Wärmekuppel, wie sie zur Brut von Hühnereiern verwendet wird, als Wärmequelle. Stellen Sie die Inkubationskammer um das Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 28 Grad Celsius ein. Öffnen Sie für etwa 10 bis 20 Minuten oder bis die Temperatur stabilisiert ist die Vorderseite der beheizten Inkubationskammer und platzieren Sie die Bildgebungskammer auf dem Mikroskop.

Platzieren Sie die Deckglasabdeckung mit der nach oben zeigenden Seite in Richtung Objektiv. Positionieren Sie die Larvenflosse so, dass zwei Drittel des Sichtfelds frei bleiben, um das Wachstum und die Regeneration der Flosse während des Bildaufnahmeverfahrens erfassen zu können. Ohne die Notwendigkeit, die Larven im 60-stelligen mehrdimensionalen Erfassungsfenster der Software neu zu positionieren, wählen Sie im Reiter Zack den Z-Stack und die Zeitrafferoption sowie den Schichtmodus aus.

Wählen Sie die Schichtdicke und anschließend den Start-Stopp-Modus aus. Definieren Sie die obere und untere Position des Stapels in der Zeitraffertabelle. Wählen Sie das Intervall und die Dauer des Films aus, und drücken Sie dann die Start-Taste, um die Aufnahme zu beginnen.

Überprüfen Sie innerhalb der ersten Stunde die Ränder der Larven. Falls erforderlich, positionieren Sie die Larven im Verlauf der Zeit erneut, da sie sich aufgrund des Wachstums oder Unterschiede in der Agarosezusammensetzung verschoben haben könnten. Speichern Sie die Datei am Ende der Zeitrafferaufnahme und fahren Sie mit der Nachbearbeitung und der quantitativen Datenauswertung fort.

In diesem Abschnitt erläutern wir verschiedene Methoden zur Analyse der mit Methode eins generierten Daten mittels imas. Zunächst wird erläutert, wie das Flossenwachstum mit der imas-Software bestimmt wird. Öffnen Sie den Zeitrafferfilm in der Amaris-Software und speichern Sie die Dateien im MRS-Dateiformat.

Um die Softwareleistung zu verbessern, wählen Sie die orthogonale Ansicht, um den Film als Projektion anzuzeigen. Um die Flossenlänge zu messen, wählen Sie die Option „Neue Messpunkte hinzufügen“ in der oberen linken Symbolleiste. Unter „Liste der sichtbaren Statistikwerte konfigurieren“ wählen Sie die Statistikwerte aus, die im Linienmodus angezeigt werden sollen.

Wählen Sie unter der Registerkarte „Einstellungen“ in den Beschriftungseigenschaften Paare aus, und aktivieren Sie Name und Abstand, um die Distanz zwischen den Punkten A und B neben der Messlinie anzuzeigen. Wechseln Sie in den Bearbeitungsmodus und halten Sie die Umschalttaste gedrückt, um den ersten Punkt am distalen Flossenende auszuwählen. Verwenden Sie dann dieselbe Konfiguration, um den zweiten Punkt am distalen Ende des No-Accord auszuwählen. Der Abstand wird im Bild angezeigt und kann unter der Registerkarte „Statistik“ exportiert werden.

Durch Auswahl der Scheibentaste „Alles exportieren“ unten rechts. Alternativ zur Option „Messpunkte“ kann der Schnittbetrachter verwendet werden, um Abstände im Schnittansichtsmodus zu messen. Scrollen Sie zu einer gewünschten Position und klicken Sie mit der linken Maustaste auf die erste und zweite Position; der Abstand wird angezeigt.

Diese Option erlaubt jedoch keinen Datenaustausch. Im Folgenden erläutern wir kurz, wie man die Flossefläche mithilfe der Open-Source-Software ImageJ bestimmt. Öffnen Sie den Zeitrafferfilm in ImageJ mit einem Plugin, das das Dateiformat der Zeiss Axio Vision erkennt.

Laden Sie alternativ eine unkomprimierte TIFF-Sequenz. Dadurch wird sichergestellt, dass die Dateiinformationen unter „Analyze“ – „Set Scale“ gespeichert werden, um die Distanz in Pixeln und die bekannte Distanz festzulegen, falls diese nicht in der Datei erhalten ist. Legen Sie außerdem die Längeneinheit auf Mikrometer fest.

Wählen Sie in der Symbolleiste das Freihand-Auswahlwerkzeug aus und umreißen Sie die Wunde, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten. Ziehen Sie dabei entlang der Wundränder.

Klicken Sie auf die Messoption unter „Analyze“, um die Fläche der wundrepräsentativen Ergebnisse anzuzeigen. Die Amputation der Flosse führt im Verlauf von 36 Stunden nach der Amputation zu einer teilweisen Regeneration. Die Flächenmessungen der Flosse zeigen, dass die Flossenamputation eine Abnahme des Flossengewebes bis etwa 14 Stunden nach der Amputation auslöst, vermutlich aufgrund von Zelltod, gefolgt von einer dünnen Regenerationslänge.

Der Vergleich der amputierten und regenerierten Flosse zeigt eine 2,48-fache Zunahme der Flossenlänge innerhalb von 36 Stunden. Die Amputation löst zunächst einen Schnürsenkeleffekt aus, der durch Kontraktionen mittels Aktin-Myosin-Kabeln gekennzeichnet ist, die in den Flossenfaltzellen vorhanden sind; diese Zellen treten aus der Amputationswunde hervor und werden anschließend abgebaut. Die Körperlänge nimmt anfangs zu, doch die Flosse regeneriert nicht.

In den frühen Phasen. Etwa 14 Stunden nach der Amputation beginnt die Flosse, sich von proximalen zu distalen Positionen hin auszubilden. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Amputation eine Wundkontraktion auslöst, die möglicherweise entscheidend dafür ist, die Zellausscheidung zu fördern.

Wenn der Prozess abgeschlossen ist, beginnt die Flosse sich zu regenerieren. Es scheint ein entwicklungsbedingtes Wachstum der Flosse stattzufinden. Unabhängig von diesem Prozess haben wir eine Methode vorgestellt, die die Beobachtung der dynamischen Vorgänge der Gewebereparatur unter Verwendung lebender Zebrafisch-Larven ermöglicht.

Dieses Verfahren erfordert bestimmte Aspekte, die wir getestet haben, um das Ergebnis zu optimieren. Ein klarer Vorteil der vorgestellten Abbildungsmethode besteht darin, dass sie leicht an jedes Stereomikroskop mit einer CCD-Kamera und TimeLapse-Software angepasst werden kann. Außerdem bietet sie eine kostengünstige Alternative zum teureren konfokalen Abbildungssystem.

Obwohl diese Methode keine Fluoreszenz oder Zelldetektion verwendet, kann sie für derartige Anwendungen erweitert werden, indem ein automatisiertes System zur Splitterkontrolle und eine Software zur Deconvolution nach der Bildaufnahme genutzt werden, um die Prozesse der Wundheilung und Regeneration mit subzellulärer Auflösung weiter zu untersuchen. Diese Methode kann Studierenden ein besseres Verständnis der grundlegenden biologischen Vorgänge vermitteln, die der Gewebeheilung und -regeneration zugrunde liegen. Die optische Transparenz sowie die einfache Handhabung von embryonalen und larvalen Zebrafischen und die Anpassungsfähigkeit des Systems an jedes Stereomikroskop machen es für den Unterricht in grundlegender Wirbeltierbiologie im Klassenzimmer geeignet.