Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die maximale isometrische Krafterzeugungskapazität einzelner Fasern aus chemisch perme-Skelettmuskelproben zu messen. Dies wird erreicht, indem die Muskelfasermembranen zunächst einem chemischen Detergens ausgesetzt werden, wodurch die Barriere zwischen extrazellulärem und intrazellulärem Inhalt entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, aus einem kleinen Faserbündel eine einzelne Faser zu extrahieren und an der Versuchsapparatur zu befestigen.

Als nächstes werden Laserinterferenzmuster verwendet, um die optimale Sarkomerlänge für die einzelne Faser einzustellen. Schließlich wird Kalzium verabreicht, um die maximale isometrische Kontraktionskraft hervorzurufen. Letztendlich bietet die Perme-Einzelfasertechnik eine Bewertung der kontraktilen Eigenschaften der Skelettmuskulatur ohne die Komplexität, die mit der gesamten Muskelarchitektur verbunden ist.

visuelle Demonstration dieser Methode ist nützlich, da die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Durchführung des Protokolls schwer zu erlernen sein können. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Präparier-, Lagerungs- und Testlösungen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um Nahtschlaufen aus Strängen aus USP 10 Zero Monofilament Nylon-Naht vorzubereiten.

Bereiten Sie mit der doppelten Überhandknotentechnik vier Schlaufen für jede zu testende Faser vor. Sobald er gebildet ist, legen Sie den Knoten unter ein Mikroskop und reduzieren Sie seine Größe auf einen Durchmesser von etwa 750 Mikrometern. Orientieren Sie sich an den IPS GTI-Markierungen.

Schneiden Sie dann überschüssige Naht ab und lassen Sie nur die Schlaufe und kleine 500-Mikrometer-Schwänze auf beiden Seiten übrig. Übertragen Sie eine kleine Masse Muskelgewebe, die durch offene Biopsie oder Nadelbiopsie gewonnen wurde, in eine Schale mit gekühlter Dissektionslösung und fügen Sie mehr Dissektionslösung hinzu, um sicherzustellen, dass das Gewebe untergetaucht bleibt. Untersuchen Sie die Probe unter dem Mikroskop und manipulieren Sie sie, um die Längsachse der Fasern in Richtung der rechten Schulter des Untersuchers auszurichten.

Verankern Sie dann die Probe an der Schale, indem Sie sie mit der Pinzette in der linken Hand und der Mikropräparierschere in der rechten Hand an den Ecken feststecken. Beginnen Sie, ein Bündel entlang der Längsränder zwischen den Fasern vorsichtig zu präparieren. Entfernen und entsorgen Sie jegliches Gewebe, das durch die Pinzetten oder Stifte beschädigt wurde.

Als Ergebnis des Präpariervorgangs werden die Bündel aus der Präparierlösung in ein Drei-Milliliter-Fläschchen mit 2,5 Millilitern frischer, gekühlter Präparierlösung mit einem nichtionischen Reinigungsmittel überführt. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis unter gelegentlichem leichtem Rühren und stellen Sie sicher, dass die Bündel während der gesamten Inkubation unter Wasser bleiben. Füllen Sie dann die Bündel in ein Fläschchen mit frischer Präparierlösung und rühren Sie vorsichtig und kurz um, um alle Reinigungsmittelreste zu entfernen.

Nach dem Spülen werden die Bündel in ein Fläschchen mit gekühlter Aufbewahrungslösung umgefüllt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Nehmen Sie das Fläschchen am nächsten Tag bei vier Grad Celsius aus dem Lager und geben Sie alle Bündel in einen Medizinbecher oder eine Präparierschale. Füllen Sie die Bündel zur Vorbereitung für die Lagerung in einzeln beschriftete Kryo-Fläschchen um, die mit 200 bis 400 Mikrolitern frischer Aufbewahrungslösung gefüllt sind, und stellen Sie sicher, dass das Bündel nicht an der Seite des Röhrchens klebt oder auf der Oberfläche schwimmt.

Verschließen Sie dann das Röhrchen und lagern Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius. Richten Sie eine Versuchsapparatur ein, wie sie hier gezeigt und im begleitenden Textprotokoll zugeschrieben wird. Füllen Sie dann die erste Versuchskammer mit entspannender Lösung, die zweite Kammer mit der vorreaktivierenden Lösung und die dritte mit der aktivierenden Lösung.

Stellen Sie die Temperatur in der Kammer so ein, dass sie konstant bei 15 Grad Celsius liegt, während sich das Gerät in der entspannenden Lösung befindet. Fädeln Sie zwei der vorbereiteten Nahtschlaufen auf die Befestigungsflächen aus Edelstahl, die sowohl vom Kraftaufnehmer als auch vom Längenregler ausgehen. Tauen Sie dann ein Faserbündel von Interesse etwa 15 Minuten lang auf Eis auf und geben Sie es dann in eine mit Silikonelastomer überzogene Petrischale, die mit frischer, gekühlter Entspannungslösung gefüllt ist.

Befestigen Sie das Bündel mit Stiften an beiden Enden und stellen Sie sicher, dass es mit der Pinzette untergetaucht ist. Fassen Sie eine Faser an einem Ende und beginnen Sie, sie gleichmäßig entlang ihrer Längsachse herauszuziehen. Bei der Extraktion von Fasern aus dem Bündel ist Vorsicht geboten, da Adhäsionen zwischen den Fasern und der extrazellulären Matrix zu übermäßiger Spannung führen können, was letztendlich zu dehnungsinduzierten Schäden führt.

Nach der Extraktion wird die Faser zusammen mit einer kleinen Menge Entspannungslösung in eine modifizierte Pipettenspitze eingeführt und in die Experimentierkammer überführt, in der sich die Entspannungslösung befindet, die sanft mit der Pinzette geführt wird. Entfernen Sie die Faser von der Pipettenspitze und verankern Sie sie am Längenregler. Manipulieren Sie mit der ersten Nahtschlaufe das andere Ende der Faser in Richtung des Kraftaufnehmers und sichern Sie die Faser auf die gleiche Weise.

Entfernen Sie überschüssige Naht mit der Mikropräparierschere. Fädeln Sie dann die zweite Schlaufe über die erste und verankern Sie die Faser an einem Punkt innerhalb von 0,2 Millimetern vom Ende der Befestigungsfläche des Längencontrollers. Wiederholen Sie den Vorgang mit der zweiten Schlaufe am Ende des Kraftaufnehmers der Faser.

Passen Sie die Position des Längenreglers in Richtung der Y-Achse an, um die Faser parallel zu den Seitenwänden der Experimentierkammer auszurichten. Vermessen Sie dann die Faser mit der Prismenseitenansicht und passen Sie die Position des Längenreglers in Richtung der Z-Achse an, bis die Faser parallel zum Boden der Kammer ist. Wenn die Faser in irgendeiner Weise beschädigt wird, sollte die Faser verworfen und eine neue Faser angebracht werden.

Schalten Sie den Laser ein und stellen Sie die Position des Tisches so ein, dass der Laser durch die Mitte der Faser geht. Stellen Sie dann die Sarkomerlänge ein, indem Sie die Spannung auf der Faser mit dem Längenregler X-Achsen-Mikrometertreiber erhöhen oder verringern, bis der gewünschte Abstand des gebeugten Lichts auf dem Zielbildschirm beobachtet wird. Nachdem die optimale Sarkomerlänge eingestellt wurde, messen Sie den Abstand zwischen den beiden innersten Nähten.

Positionieren Sie die Kammer so, dass das vertikale Fadenkreuz des Okulars auf dem innersten Rand einer Innennaht und Null ausgerichtet ist. Die digitale Anzeige auf dem Mikrometerantrieb verschiebt den Tisch entlang der x-Achse relativ zum Mikroskop, bis das vertikale Fadenkreuz des Okulars mit der innersten Naht ausgerichtet ist. Die Digitalanzeige zeigt die Länge der Faser an, hält die Faser auf der gemessenen Länge und verwendet die am Mikroskop montierte Kamera, um ein Bild mit hoher Vergrößerung des zentralen Teils der Faser sowohl aus der Draufsicht als auch aus der Seitenansicht aufzunehmen.

Verwenden Sie diese Bilder, um die Querschnittsfläche der Faser zu berechnen. Verwenden Sie die Kammersteuerungssoftware, um die Faser in die Kammer mit der Vorreaktivierungslösung zu bewegen und dort drei Minuten lang zu inkubieren. Während die Faser die Lösung inaktiviert, messen Sie ihre passive Spannung, bewegen Sie die Faser dann in die Kammer, die die aktivierende Lösung enthält, und lassen Sie die maximale isometrische Kraft entstehen, was durch ein Kraftplateau belegt wird, dem ein schneller Anstieg vorausgeht.

Verwenden Sie als Nächstes den Längenregler, um den Abstand zwischen den Faserbefestigungspunkten schnell und kurz zu reduzieren, gefolgt von einer schnellen Rückkehr zur ursprünglichen Länge, um den Kraftaufnehmerausgang zu identifizieren, der Null entspricht. Die hier gezeigte Kraft ist sowohl die obere als auch die seitliche Ansicht einer elliptisch geformten Faser aus diesen Ansichten. Die Querschnittsfläche wurde bestimmt, indem die Durchmesser an fünf Punkten entlang der Länge der Faser gemessen und dann der Durchschnitt der fünf resultierenden Bereiche berechnet wurde.

Kraftspuren von menschlichen, langsamen und schnellen Muskelfasern verdeutlichen, dass schnelle Fasern mit der in diesem Video gezeigten Technik eine höhere Kraftrate erzeugen als langsame Fasern. Die typischen Merkmale von Muskelfasern von menschlichen Mäusen und Ratten wurden gemessen und werden hier vorgestellt. Der gezeigte Bereich zeigt das 25. bis 75. Quartil an, und das N ist die Anzahl der getesteten Fasern.

Beachten Sie die große Variation der spezifischen Kraft zwischen den verschiedenen Arten. Die hier skizzierten Verfahren führen zur Beurteilung der maximalen intrinsischen Krafterzeugungsfähigkeit einer einzelnen Skelettmuskelfaser durch Hinzufügen zusätzlicher Eingriffe, wichtiger Aspekte der Skelettmuskelphysiologie, einschließlich unter anderem Längenkraft, Kraftgeschwindigkeit und Kraft. Calcium-Zusammenhänge können aufgedeckt werden.