Name: Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Messung der isometrischen Maximalkraft permeabilisierter Skelettmuskelfasern. Diese Methode ermöglicht die Analyse kontraktiler Eigenschaften einzelner Fasern ohne Komplexität ganzer Muskeln.

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Beurteilungen der kontraktilen Eigenschaften permeabilisierter einzelnen Skelettmuskelfasern werden verwendet, um die Muskelfunktion in einer Vielzahl von Kontexten zu untersuchen. Beispiele hierfür sind Studien, die die Auswirkungen der Alterung 12 ausgewertet haben, ausüben 10,13,14, Raumfahrt 15, Verletzungen 2,3,16, medikamentöse Behandlungen 17,18, 19 und Krankheit genetische Manipulation 20,21 auf Faserstruktur und Funktion. Aufgrund der Fähigkeit, direkt die kontraktilen Leistung Myofibrillen in ihrer Mutter Konfiguration, bietet diese Technik eine attraktive Plattform, um ein Verständnis der Funktion myofibrillären abwesend potenziell verwirrende Effekte, die vorhanden sind zu bilden, wenn die neuromuskuläre Signalübertragung und Anregung induzierte Calciumfreisetzung sind in der untersuchten Systems enthalten. Weiterhin kann die Funktionsprüfung der Einzelfasern verwendet werden, um kontraktilen Proteinidentifikationsergebnisse wie jene ergänzendurch Immunhistochemie oder Gelelektrophorese + Western-Blot-22 erhalten. Eine der primären Funktionen der Skelettmuskel ist, um eine Kraft zu erzeugen. Folglich sF o, ein Maß für die intrinsischen Krafterzeugungsfähigkeit eines kontraktilen Systems ist von großem Interesse, um die Muskel Physiologen. Zuverlässige Schätzungen der sF o erfordern genaue Maßnahmen beider Faser CSA und F o. Da Fasern sind in der Regel weder einen kreisförmigen Querschnitt, noch gleichmäßiger in CSA entlang ihrer Länge, große Sorgfalt sollte bei der Schätzung CSA genommen werden. Zu diesem Zweck werden die Messungen an mehreren Stellen entlang der Länge der Faser hergestellt und an jedem Ort, von zwei Seiten um 90 ° getrennt sind. Zuverlässige Maßnahmen der F o erfordern Aufmerksamkeit auf einige Details, einschließlich Buchhaltung für passive Kraft, die Anpassung Sarkomerlänge Überschneidungen von dicken und dünnen Fäden zu maximieren, unter Verwendung einer Aktivierungslösung mit einem Calciumkonzentration tKappe ergibt maximalen Aktivierung, die Aufrechterhaltung der gewünschten Versuchstemperatur und Aufrechterhaltung einer optimalen Lagerbedingungen (Temperatur und Dauer) der Fasern vor dem Tag des Experiments. Während die hier beschriebenen Schritte beschreiben das Verfahren zur Bewertung maximale isometrische Kraft, ist es häufig wünschenswert, andere wichtige funktionelle Eigenschaften der Skelettmuskelfasern bewerten. Dies kann durch Verstrecken des experimentellen Protokolls, um zusätzliche mechanische Manipulationen der Faser schließen erreicht werden. Zum Beispiel ermöglicht die Messung der Geschwindigkeit, mit der die Faser verkürzt gegen eine Reihe von unterschiedlichen Lasten Bestimmung des Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung, aus der Kraft-Kraft und Geschwindigkeitsleistungsverhältnisse berechnet 10,23,24 werden. Zusätzlich kann die Geschwindigkeit der entladenen Verkürzung durch Verwendung des &quot;slack-Test&quot; 25, die der Anwendung einer Reihe von Durchhang-induzierende Verkürzung Schritte und measuri bestehen bestimmt werdenng die Zeit von der Faser erforderlich den Durchhang zu entfernen. Eine weitere kinetische Parameter, die häufig berichtet wird, ist k tr, die Geschwindigkeitskonstante für Kraft Sanierung nach einer mechanischen Störung, die vorübergehend löst alle Querbrücken 26. Schließlich ist die Beziehung zwischen der Calciumkonzentration und der aktiven Krafterzeugung (der &quot;Kraft-PCA relationship&quot;) oft von Interesse 18 und kann durch Aussetzen der Faser einer Reihe von Lösungen mit Calciumkonzentrationen im Bereich von unterhalb der Schwelle für die Aktivierung des kontraktilen bestimmt werden System, um solche ausreichende maximale Aktivierung und damit maximale Kraft (F o) zu entlocken. Obwohl ein Großteil der genannten Gerätes ist für die Bewertung der einzelnen Faser Kontraktilität benötigt wird, ist anderen Geräten nicht unbedingt erforderlich. Das Längen-Controller, beispielsweise ist für jede experimentelle Protokoll, das eine schnelle und genaue Verlängerung oder Verkürzung der Faser erfordert,aber nicht für die Bewertung maximalen isometrischen Kraft (wenn auch ein Nullkraftniveau in der Kraft-Eintrag muss immer noch auf irgendeine Weise identifiziert werden kann) unbedingt erforderlich. Die Prismen, die Beobachtung der Faser von der Seite zu erlauben, während die für die Beurteilung Querschnittsfläche, sind nicht unbedingt notwendig, wenn die Positionierung der Faser in der Experimentierkammer. Weiterhin sind Mittel zum alternativen Freilegen der Fasern zu den verschiedenen Versuchslösungen verwendet werden könnten, einschließlich der Konzipierung einer manuell betriebenen System von Kammern oder einer Kammer, die für ein schnelles Füllen gestattet und Entleeren von Lösungen. Schließlich, während subphysiologischen experimentellen Temperaturen wie 15 ° C werden häufig verwendet, um die Reproduzierbarkeit der mechanischen Messungen 1,2,3,5,8,12,17,27 verbessern, ist es möglich, gültige Daten bei anderen Temperaturen 23 erzeugen , 28, solange die Wirkungen der Temperatur auf die Lösungseigenschaften (Calciumkonzentration, pH, etc.) berücksichtigt werden. </p&gt; Die Zusammensetzung der Testlösungen zu den kritischsten Aspekte der hier beschriebenen Techniken permeabilisierten Faser. Überlegungen zu Lösungszusammensetzung sind komplex und würde den Rahmen dieses Artikels sprengen. Das in Schritt 5 des Protokolls beschrieben Lösungen werden mit Betonung auf eine schnelle Aktivierung des permeabilisierten Faser bei der Übertragung vom voraktiviert, um Aktivierungslösungen, während eine konstante Ionenstärke, kationische Zusammensetzung und Osmolarität 6,29 ausgelegt. Andere Ansätze zur Lösungszusammensetzung wurden mit großem Erfolg von anderen Forschungsgruppen tätig und nutzen veröffentlicht Bindungskonstanten und Computational Tools 27,30,31 Regel. Die Konzentrationen von Calciumionen in den verschiedenen Aktivierungslösungen ist insbesondere in Studien mit submaximale Aktivierung wie Kraft-PCA Auswertungen. Für Experimente, in denen die Fasern vollständig aktiviert werden, wie jene, beschriebend hier die Calciumkonzentration in der Aktivierungslösung übersteigt typischerweise mit einem komfortablen Vorsprung, die maximale Kraft zu erzielen, was seine genaue Kenntnis weniger kritisch notwendig. Zusatz von Kreatinphosphat ist für die Pufferung der intramyofibrillar ATP und ADP Schwankungen, die sonst mit kontraktile Aktivität verbunden wäre. Kreatinkinase erforderlich ist, um den Phosphattransfer von Kreatinphosphat zu ADP katalysieren. Unter Versuchsbedingungen, die in hoher ATP Umsatzraten, einschließlich der Arbeit bei hohen Temperaturen oder Messen von Hochgeschwindigkeits-Backfett in die schnellen Fasern 32 führen kann, müssen Kreatinkinase zu der Lösung gegeben werden, um die endogenen Creatin-Kinase, die gebunden an die Faser bleibt zu ergänzen. Für weniger anspruchsvolle experimentellen Bedingungen ist der ATP-Regenerationssystem 27 weniger kritisch. Einschränkungen der permeabilisierten Einzelfaser-Technik sind die folgenden. Die von diesen Tests generierten Daten bestimmen diekontraktilen Eigenschaften des spezifischen myofibrillaren Einheit, die mit der experimentellen Vorrichtung befestigt war. Folglich fängt diese nur einen kleinen Teil des gesamten mehrkernige Faser aus dem das Segment wurde erhalten, der wiederum nur einen kleinen Teil der Gesamtzahl von Fasern in den Muskel. Die Ermittler sollten daher sorgfältig überlegen, die erforderlich ist, um irgendwelche Schlüsse aus den Versuchen ausge unterstützt Sampling. Zusätzlich Bewertung der Auswirkungen der Übung Trainingsintervention auf Faser-Funktion setzt voraus, dass die ausgewerteten Fasern wurden in der Tat während der Ausbildung rekrutiert. Obwohl das Protokoll versucht, den natürlichen intrazellulären Milieu der Faser imitieren, ist die sarcolemma Permeabilisierung Verfahren unspezifisch und notwendigerweise ermöglicht lösliche intrazelluläre Bestandteile frei in den Badelösungen diffundieren. Eine weitere Folge der Membranpermeabilität einer Änderung des osmotischen Gleichgewichts durch eine Schwellung des Faservolumens 33 sichtbar. DieFaserquellung erhöht den Abstand zwischen Aktin und Myosin-Filamente was zu einer verringerten Calciumempfindlichkeit des myofilament System 34,35, kann aber durch die Einführung von großen, osmotisch wirksame Verbindungen 34 umgekehrt werden. Eine letzte Einschränkung zu betrachten ist die Folge der Technik verwendet, um Fasern zu der experimentellen Vorrichtung zu befestigen. Dies erfordert unweigerlich eine Verzerrung der räumlichen Beziehung innerhalb des Fadensystem an und nahe den Befestigungspunkten, mit Teilnahme an Funktionsdefizite. Insbesondere werden die Bereiche der Faser an und benachbart zu den Befestigungspunkten funktional beeinträchtigt und dadurch artifactual Serie Elastizität mit dem Messsystem bei. Zusammenfassend haben wir ein Mittel, mit dem die Krafterzeugungskapazität des chemisch permeabilisiert Skelettmuskelfasern in vitro zu beurteilen, beschrieben. Obwohl der Schwerpunkt dieses Artikels hat sich auf die Bewertung der maximalen isometrischen Kraft generatin geweseng Kapazität des menschlichen Skelettmuskelfasern kann der experimentelle Ansatz modifiziert und erweitert, um eine Vielzahl von kinetischen Parameter und Beziehungen in einer Reihe von Arten, von Säugetieren oder anderweitig zu bestimmen.

Die primäre Funktion der Skelettmuskel ist, um eine Kraft zu erzeugen. Muskelkraft wird in vivo durch eine komplexe Abfolge von Ereignissen, die motorischen Nervenaktionspotentiale, die neuromuskuläre Übertragung, Muskelfaseraktionspotentiale, die Freisetzung von intrazellulärem Calcium, und die Aktivierung des Systems der Regulierung und kontraktilen Proteine ​​enthält ausgelöst. Da Krafterzeugung ist das ultimative Ergebnis dieser Sequenz könnte ein Defizit in Kraft, die durch Ausfall eines oder mehrerer der einzelnen Stufen verursacht werden. Ein Schlüsselattribut der permeabilisierten Faservorbereitung ist, dass es beseitigt die meisten der für die Krafterzeugung in vivo erforderlichen Schritte, mit nur den regulatorischen und kontraktilen Funktionen mit der myofibrillären Gerät restlichen verbunden. Der Prüfer übernimmt die Kontrolle über die Lieferung der Aktivierung Calcium und Energie (ATP), und ist mit einem vereinfachten System, die Beurteilung der isolierten regulatorischen und kontraktilen Strukturen können in ihrer Mutter co belohntnfiguration. Messungen der Stärke mit permeabilisierten Skelettmuskelfasern sind somit wertvolle bei der Beurteilung Veränderungen in vivo beobachtet Muskelfunktion. Zum Beispiel haben wir diese Technik verwendet, um die Krafterzeugungskapazität von Fasern von Myostatin-defizienten Mäusen 1 zu charakterisieren und um die Ursache der anhaltenden Muskelschwäche folgende chronische Rotatorenmanschette 2,3 ausgestellt zu bewerten. Moderne permeabilisiert Faser Methodik kann früh einflussStudien 4,5 verfolgt werden und ist derzeit in Gebrauch von einer Reihe von Forschungsgruppen. Obwohl die Techniken in der Literatur beschrieben worden sind, haben sie noch nicht im Videoformat präsentiert. Das Ziel dieses Artikels ist es, um eine aktualisierte, gültige und zuverlässige Technik für die Messung der maximalen Krafterzeugungskapazität von einzelnen Fasern aus chemisch permeabilisiert Skelettmuskel-Proben zu veranschaulichen. Dazu ist eine individuelle Fasersegment (nachfolgend als ein voll ̶0; Faser &quot;) aus einem vorge permeabilisiert Faserbündel herausgezogen und in einer Versuchskammer, die eine entspannende Lösung eingebracht, von denen das bestimmende Merkmal eine Calciumkonzentration, &lt;10 nM. Die Faser wird dann an einem Ende mit einer Kraft-Wandler und mit dem anderen Ende an einem längen Controller angeschlossen sind. Mit der Faser in einer optimalen Sarkomerlänge gehalten wird, wird es einer aktivierenden Lösung, die eine Calcium-Konzentration, die ausreicht, um eine maximale Aktivierung und damit eine maximale isometrische Kontraktionskraft hervorrufen übertragen hat. Kraftdaten werden erfasst, gespeichert und mit einem Computer analysiert.

<table><tbody><tr><td>Reagenzglas aus Polystyrolkultur mit Kappe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Mikrozentrifuge mit Schraubverschluss</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Mikrozentrifugenkappen mit O-Ring</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>Kryobox für Mikrozentrifuge</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Unsteriles-Nahtmaterial 10-0 monofile</td><td>Ashaway Line Twine</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>Insektenstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette - Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodisparierschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometer treibt</td><td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad-Zirkulator an&nbsp;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Serie 800</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW-Software</td><td>National</td> <td>Instruments-Computer</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Varied-Chamber-System</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>Längenregler</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>Kraftaufnehmer</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagenzien</td></tr><tr><td>K-Proprionat</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (säure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&bull; 0.56H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Säure)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (Säure)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 Standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>pH 7 Standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

die messung der isometrischen maximalkraft von permeabilisierten skelettmuskelfasern generiert

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Die Analyse der kontraktilen Eigenschaften von chemisch gehäuteten oder permeabilisierten Skelettmuskelfasern bietet ein leistungsfähiges Mittel, um die Muskelfunktion auf der Ebene der einzelnen Muskelzelle zu beurteilen. Studien zu einzelnen Muskelfasern sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in klinischen Studien nützlich. Für Grundlagenstudien ermöglichen Messungen der Kontraktilität einzelner Muskelfasern die Untersuchung grundlegender Mechanismen der Kraftproduktion und die Analyse der Muskelfunktion im Rahmen genetischer Manipulationen. Klinisch bieten Studien zu einzelnen Muskelfasern nützliche Einblicke in die Auswirkungen von Verletzungen und Krankheiten auf die Muskelfunktion und können zum Verständnis von Muskelpathologien verwendet werden. In diesem Videoartikel skizzieren wir die Schritte, die erforderlich sind, um ein einzelnes Skelettmuskelfasersegment vorzubereiten und zu isolieren, es an ein Kraftmessgerät anzuschließen, es zu aktivieren, um eine maximale isometrische Kraft zu erzeugen, und seine Querschnittsfläche zu schätzen, um die erzeugte Kraft zu normalisieren.

Gesund, chemisch permeabilisiert Einzelfasern sollten einheitlich in der Form erscheinen und konsistente Streifenabstand unter hoher Vergrößerung betrachtet. Fasern, die unflexibel sind, wenn sie mit der Zange oder manipuliert haben offensichtliche strukturelle Schäden zu verwerfen. Hohe Vergrößerung digitaler Bilder im Schritt 15 aufgenommen werden 5 gepaart Durchmessermessungen entlang der Mittelteil der Faser analysiert. Faser CSA wird unter Annahme eines elliptischen Querschnitt aufweist und durchschnittlich 5 einzelnen CSA-Messungen, wie in 7A dargestellt. 7B dient auch dazu, zu veranschaulichen, wie Faserabmessungen in einer Ansicht kann signifikant verschieden im Vergleich zu Partner Abmessungen in der anderen Ansicht (dh grenz Abschnitte nicht im allgemeinen rund). Vergleichskraft Spuren aus menschlichen langsamen und schnellen Fasern werden in den 8A und 8B gezeigt. Voltage Ausgabe der Kraft-Wandler während eines Tests erfasst und umgewandelt zu zwingen (MN) mit Datenerfassungs- und Analysesoftware (LabVIEW). 9 veranschaulicht die Vorgehensweise verwendet, um maximale Wirkkraft (F o) zu bewerten, die durch Subtraktion berechnet wird die erforderlich ist, um die Faser zu optimalen Sarkomerlänge pflegen Kraft, während in einem entspannten Zustand (passive Kraft F P), von der größten isometrische Kraft während maximal Faseraktivierung entwickelt (Gesamtkraft F T). Da der Ausgang der Kraftwandler, der auf Null Kraft entspricht, ist in der Regel für jede der verschiedenen Badekammern wir kurz zu entspannen die Faser sowohl in der Pre-aktivierenden und Aktivierungslösungen, um die Null-Kraftniveau in der Capture- experimentellen Datensatz. Normalisierung der maximalen Wirkkraft, die durch Faser CSA dient dazu, die mehr Aussagekraft bestimmten Kraft (SF o) zu erzeugen. Denn es berücksichtigt die CSA der Faser, SF o </sub&gt; liefert ein Maß für die intrinsische Krafterzeugungskapazität des kontraktilen Apparates der Faser, wodurch eine funktionale Vergleiche zwischen Fasern von unterschiedlichen Größen. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass CSA-Messungen sind nicht möglich, den Anteil der Faser durch kontraktile Filamente gegenüber dem Anteil von anderen subzellulären Strukturen besetzte unterscheiden. Typische Eigenschaften von gesunden, erwachsenen Fasern von Claflin et al. 2011 10 Menschen, Mendias et al. 2011 1 für Maus und Gumucio et al. 2012 2 für Ratten sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die Daten in Tabelle 3 wurden unter Verwendung der erzeugten Techniken, die in diesem Artikel beschrieben. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Mensch (Vastus lateralis) </strong&gt; </td><td> Maus (EDS) </td><td nowrap="nowrap"> Ratte (Infraspinatus) </td></tr><tr><td colspan="2"> Männlich </td><td colspan="2"> Weiblich </td><td> Männlich </td><td> Männlich </td></tr><tr><td> Typ-1- </td><td> Typ 2a </td><td> Typ-1- </td><td> Typ 2a </td><td> (Nicht eingegeben) </td><td> (Nicht eingegeben) </td></tr><tr><td> CSA (&amp; mgr; m 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F o (MN) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64-0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14-0,25 </td><td> 0,55-0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Typische Merkmale von gesunden, erwachsenen Fasern aus menschlichem vastus lateralis 10, Maus extensor digitorum longus 1 und Ratte infraspinatus 2 Muskeln. Optimal Sarkomer Längen wurden mit 2,7 &amp; mgr; m für die menschliche Fasern 7,8 und 2,5 &amp; mgr; m sowohl für Maus (36 gesetzt, 37) und Ratten-Fasern (38). Experimental L f Bereiche (25. und 75. Quartile) waren 1,39 bis 1,73 mm, 1,17 bis 1,53 mm und 1,32 bis 1,59 mm für Mensch, Maus und Ratte sind. Bereiche gezeigt zeigen die 25. und 75. Quartile und n die Anzahl der getesteten Fasern. Die häufigsten Probleme während der Prüfung umfassen eine Fadenschleife Schlupf, der in einem Kraft respons Ergebnissee mit einem &quot;fangen&quot;, wie es in 10A dargestellt ist, und eine teilweise oder vollständige Dicke Reiß der Faser, die in einer Reaktion, die Kraft schlagartig in Richtung oder, um (Pause) gibt Ergebnisse Null, während die Faser noch im Aktivierungslösung eingetaucht (10B). Wenn während eines Experiments ein Schlupf, Riss oder Bruch auftritt, sollte die Faser verworfen werden und die Daten ausgeschlossen, obwohl die Aufrechterhaltung einer Aufzeichnung der Faserausfälle können auch informative 11 sein. Ein weiteres negatives Ergebnis, die angetroffen werden kann, ist die vorzeitige Aktivierung der Faser, während in der Pre-aktivierende Lösung (Abbildung 10C). Teilaktivierung in der Pre-Aktivierungslösung schlägt erhebliche grenzüber gut Kontamination (dh eine unbeabsichtigte Erhöhung der Kalziumkonzentration in der Pre-Aktivierung auch). In diesem Fall sollten alle Bäder abgesaugt und gut mit deionisiertem Wasser gespült werden. Trocknen der Teilungsoberflächen zwischen den Kammern ist auch Empded wie Feuchtigkeit oder Kondensation in diesen Bereichen können zu Feuchtigkeitsregulierung der Lösung zwischen den Bädern führen. Die Entscheidung über die ein- oder ausgeschlossen werden Daten hängt letztlich von der experimentellen Fokus und sollte daher bei der Auslegung der Studie werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Abbildung 1: Nähfadenschlaufe (10-0 Monofilament-Nylonnaht). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Abb. 2: Bundle Dissektion Zange sind in der linken Hand, sind Mikrodissektion Schere in die rechte Hand. Rote Linie gibt die günstige Orientierung des Handgelenks und der Schere, wobei die Längsachsen der Fasern. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Abbildung 3: </strong&gt; (A) Prüfgerät mit markierten Komponenten. (A) Versuchskammern mit transparenten Böden. (B) Length-Controller. (C) Kraft-Wandler. (D) Lichtquelle. (E) Length-Controller xyz Mikrometerschraube mit digitaler Anzeige. (F) Bühnenmikrometerschraube mit digitaler Anzeige. (G) Kraft-Wandler xyz Mikrometerschraube. (H) Plattform für kalibrierten Laserbeugungszielbildschirm. (I) Schwingungsisolierung Tisch. (B) Close-up Blick auf die Versuchskammern. (J) Edelstahl-Befestigungsfläche, die sich von der Länge-Controller. (K) Edelstahl-Befestigungsfläche, die sich von dem Kraftwandler. (L) Side-View-Prisma. (M) Gehäuse für thermoelektrische Kühlmodulen. (N) Thermoelement für die Berichterstattung Kammer temperatur. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Abbildung 4: Modifizierte 100 ul Pipettenspitze verwendet werden, um Fasern aus Dissektion Gericht zu Versuchskammer übertragen. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Abb. 5: Montage einzelnen Faser auf Versuchsvorrichtung (A) Nahtschlaufen auf Edelstahl-Befestigungsflächen eingefädelt. (B) Fiber übertragen Experimentierkammer. (C) Fiber to Edelstahlbefestigungsflächen durch das erste Paar von Nahtschleifen mit überschüssigen Faden entfernt verankert. (D) zweites Paar Nahtschlaufen über die Oberseite des ersten Nahtschleifen Gewinde und gebunden an Ort und Stelle. <img alt="Figur 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Abbildung 6: Sarkomerlänge wird durch die Projektion eines Laserinterferenzmuster auf einer kalibrierten Zielbild beurteilt (a) Laser-Quelle.. (B) Spiegel. (C) Zielbild. (D) Laserinterferenzmuster. <img alt="7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Abbildung 7: (A) Bestimmung der Faserquerschnittsfläche zu optimalen Sarkomerlänge (human = 2,7 um). Unter der Annahme eines elliptischen Querschnitts wird CSA für jede der fünf Positionen entlang der Fasermittelteil und dem Mittelwert der fünf Einzelmessungen als Faser CSA berichtet berechnet. 2a für Aufsicht und Durchmesser ist<html> einer Achse der Ellipse, 2b darstellt Seitenansicht Durchmesser und die andere Achse der Ellipse. (B) Repräsentative Faserabbildungen zur Darstellung jeder der fünf entsprechenden Durchmessermessungen sowohl in der Aufsicht und Seitenansicht genommen. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Abbildung 8: Repräsentative Kraft Spuren von gesunden menschlichen M. vastus lateralis Fasern (A) Typ 1 Faser (CSA: 5710 &amp; mgr; m 2, F o: 0,89 mN und SF o: 156 kPa).. (B) Typ 2a Faser (CSA: 9510 &amp; mgr; m 2, F o: 1,66 mN und SF o: 174 kPa). Faser-Myosin schwere Kette-Typ wurde durch die Verwendung von elektrophoretischen Trennung und Silber-Färbetechniken 22 bestimmt. oad / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Abbildung 9: Berechnung der maximalen Wirkkraft (F o) (a) erweiterte Ansicht des Faserkraftantwort bei slack-induzierende Bewegung des Länge-Controller in der Vor-Aktivierungslösung eingeleitet.. F P die erforderlich ist, um eine Sarkomerlänge von 2,7 um mit der Faser in Ruhe zu halten Kraft. (B) vergrößerte Ansicht Länge-Controller slack-induzierende Bewegung. Beachten Sie, dass F o = F T - F P. <img alt="10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Abbildung 10: (A) Fadenschleife Schlupf, durch ein &quot;Fang&quot; in Kraft Spur während des Anstiegs von Gewalt zeigt. Überprüfen Sie, ob Schleifen sind vor der Aktivierung der Faser sicher. (B) Faserbruch während der Aktivierung. Kann während der Fadenschleife Ort aufgrund der schlechten Faserintegrität oder aggressive Faserbehandlung seinment. (C) Eine vorzeitige Teilfaseraktivierung durch Verschmutzung von Pre-Aktivierungskammer mit Ca 2+.

Die Analyse der Kontraktionseigenschaften von chemisch gehäutet oder durchlässig gemacht, Skelettmuskelfasern bietet ein leistungsfähiges Mittel, um die Muskelfunktion auf der Ebene der einzelnen Muskelzelle zu bewerten. In diesem Artikel beschreiben wir eine valide und zuverlässige Technik für die Vorbereitung und Prüfung durchlässig gemacht Skelettmuskelfasern in vitro.

Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die maximale isometrische Kraftentwicklungskapazität einzelner Fasern aus chemisch permeabilisierten Muskelproben zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Muskelzellmembranen einer chemischen Behandlung mit einem Detergens ausgesetzt werden, wodurch die Barriere zwischen extrazellulärem und intrazellulärem Kompartiment aufgehoben wird. Im zweiten Schritt wird eine einzelne Faser aus einem kleinen Faserbündel isoliert und an die Versuchsapparatur angebracht.Anschließend werden Laserinterferenzmuster verwendet, um die optimale Sarkomerlänge für die einzelne Faser einzustellen. Schließlich wird Calcium zugegeben, um die maximale isometrische Kontraktionskraft hervorzurufen. Letztendlich ermöglicht die permeabilisierte Einzelfasertechnik eine Beurteilung der kontraktilen Eigenschaften der Skelettmuskulatur, ohne die mit der gesamten Muskelarchitektur verbundenen Komplexitäten berücksichtigen zu müssen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da die Schlüsselschritte zur erfolgreichen Durchführung des Protokolls schwer zu erlernen sein können. Bereiten Sie zunächst die Dissektions-, Lagerungs- und Testlösungen gemäß dem begleitenden textlichen Protokoll vor. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um aus Fäden der USP 10-Null-Monofil-Nylonnaht Nahtschlingen herzustellen.Stellen Sie mit der Doppelschlaubenschnür-Technik vier Schlaufen für jede zu prüfende Faser her. Bringen Sie den Knoten nach der Bildung unter ein Mikroskop und verkleinern Sie ihn auf einen Durchmesser von etwa 750 Mikrometer, wobei Sie sich an den Markierungen der IPS GTI orientieren.Danach überschüssigen Faden abschneiden, sodass nur die Schleife und kleine 500-Mikrometer-Schwänze auf beiden Seiten verbleiben. Eine kleine Menge Muskelgewebe, die mittels offener Biopsie oder Nadelspitzenbiopsie gewonnen wurde, in eine Schale mit gekühlter Dissektionslösung überführen und weitere Dissektionslösung hinzufügen, um sicherzustellen, dass das Gewebe untergetaucht bleibt. Die Probe unter dem Mikroskop untersuchen und so manipulieren, dass die Längsachse der Fasern in Richtung der rechten Schulter des Untersuchers ausgerichtet ist.Befestigen Sie die Probe dann an der Petrischale, indem Sie sie mit der Pinzette in der linken Hand und der mikrochirurgischen Schere in der rechten Hand an den Ecken fixieren. Beginnen Sie vorsichtig, ein Bündel entlang der Längsränder zwischen den Fasern zu dissezieren. Entfernen und verwerfen Sie jegliches Gewebe, das durch die Pinzette oder Nadeln beschädigt wurde.Überführen Sie die Bündel im Anschluss an den Dissektionsprozess aus der Dissektionslösung in ein dreimilliliterfassendes Gefäß, das 2,5 Milliliter frische, gekühlte Dissektionslösung mit zugesetztem nichtionischem Detergens enthält. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis unter gelegentlicher, sanfter Bewegung und stellen Sie sicher, dass die Bündel während der gesamten Inkubation vollständig untergetaucht bleiben. Anschließend überführen Sie die Bündel in ein Gefäß mit frischer Dissektionslösung und schwenken sie sanft und kurz, um verbleibendes Detergens zu entfernen.Nach dem Spülen die Bündel in ein Gefäß mit gekühlter Lagerungslösung überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag das Gefäß aus der Lagerung bei vier Grad Celsius entnehmen und alle Bündel in einen Medizinbecher oder eine Petrischale überführen. Zur Vorbereitung der Lagerung die Bündel in einzeln beschriftete Kryoröhrchen überführen, die mit 200 bis 400 Mikrolitern frischer Lagerungslösung gefüllt sind, und sicherstellen, dass das Bündel nicht an der Röhrenwand klebt oder auf der Oberfläche schwimmt.Dann verschließen Sie das Röhrchen und lagern die Probe bei minus 80 Grad Celsius. Richten Sie eine Versuchsapparatur ein, wie sie hier gezeigt und im begleitenden textlichen Protokoll beschrieben ist. Füllen Sie dann die erste Versuchskammer mit Relaxationslösung, die zweite Kammer mit Vorreaktivierungslösung und die dritte mit Aktivierungslösung.Stellen Sie die Temperatur in der Kammer so ein, bis sie bei 15 Grad Celsius stabil ist, wobei sich die Apparatur in der Relaxierungslösung befindet. Fädeln Sie zwei der vorbereiteten Nahtschleifen auf die aus Edelstahl bestehenden Befestigungsflächen, die sich sowohl vom Kraftaufnehmer als auch vom Längenregler erstrecken. Tauen Sie danach ein gewünschtes Faserbündel etwa 15 Minuten lang auf Eis auf und überführen Sie es anschließend in eine mit frischer, gekühlter Relaxierungslösung gefüllte Petrischale mit Silikonelastomer-Beschichtung.Befestigen Sie das Bündel an beiden Enden mit Nadeln und stellen Sie sicher, dass es mit der Pinzette untergetaucht bleibt. Greifen Sie eine Faser an einem Ende an und ziehen Sie sie gleichmäßig entlang ihrer Längsachse heraus. Bei der Entnahme der Fasern aus dem Bündel ist Vorsicht geboten, da Adhäsionen zwischen den Fasern und der extrazellulären Matrix zu übermäßiger Spannung führen können, was letztlich zu dehnungsbedingten Schäden führen kann.Nach der Extraktion die Faser zusammen mit einer kleinen Menge Relaxationslösung in eine modifizierte Pipettenspitze einführen und vorsichtig mit der Pinzette in die Versuchskammer überführen, die die Relaxationslösung enthält. Die Faser aus der Pipettenspitze entfernen und am Längenregler befestigen. Mit der ersten Nahtschleife das andere Ende der Faser zur Kraftmesssonde hin positionieren und die Faser mit dem gleichen Verfahren befestigen.Entfernen Sie überschüssige Nahtmaterialien mit der mikrochirurgischen Schere. Fädeln Sie anschließend die zweite Schleife über die erste und befestigen Sie die Faser an einem Punkt innerhalb von 0,2 Millimetern vom Ende der Befestigungsfläche des Längenreglers. Wiederholen Sie den Vorgang mit der zweiten Schleife am Ende der Faser, das am Kraftaufnehmer befestigt ist.Stellen Sie die Position des Längenreglers entlang der Y-Achse so ein, dass die Faser parallel zu den Seitenwänden der Versuchskammer ausgerichtet ist. Überprüfen Sie anschließend die Faser mithilfe der Seitenansicht durch das Prisma und justieren Sie die Position des Längenreglers entlang der Z-Achse, bis die Faser parallel zum Boden der Kammer verläuft. Falls die Faser irgendwie beschädigt ist, sollte sie entsorgt und eine neue Faser befestigt werden.Schalten Sie den Laser ein und justieren Sie die Position des Stages, sodass der Laser durch die Mitte der Faser verläuft. Stellen Sie dann die Sarkomerlänge ein, indem Sie die Spannung an der Faser mithilfe des Mikrometerschiebers der Längenregelung entlang der X-Achse erhöhen oder verringern, bis der gewünschte Abstand des gebeugten Lichts auf dem Zielbildschirm beobachtet wird. Nachdem die optimale Sarkomerlänge eingestellt wurde, messen Sie den Abstand zwischen den beiden innersten Nähten.Positionieren Sie die Kammer so, dass das vertikale Fadenkreuz des Okulars mit dem innersten Rand einer inneren Naht übereinstimmt und auf Null steht. Die digitale Anzeige am Mikrometertreibwerk bewegt die Probe entlang der x-Achse relativ zum Mikroskop, bis das vertikale Fadenkreuz des Okulars mit der innersten Naht ausgerichtet ist. Die digitale Anzeige zeigt die Länge der Faser an, hält die Faser auf der gemessenen Länge und verwendet die am Mikroskop montierte Kamera, um ein Bild des zentralen Bereichs der Faser mit hoher Vergrößerung aus der Draufsicht und aus der Seitenansicht aufzunehmen.Verwenden Sie diese Bilder, um die Querschnittsfläche der Faser zu berechnen. Benutzen Sie die Kammersoftware, um die Faser in die Kammer mit der vorbereitenden Lösung zu bewegen, und inkubieren Sie sie dort drei Minuten lang. Während sich die Faser in der Inaktivierungslösung befindet, messen Sie ihre passive Spannung, dann bewegen Sie die Faser in die Kammer mit der Aktivierungslösung und lassen die maximale isometrische Kraft entstehen, wie sie durch ein Kraftplateau nach einem schnellen Anstieg angezeigt wird.Als Nächstes verwenden Sie den Längenregler, um eine starke, schnelle und kurze Verringerung des Abstands zwischen den Faserbefestigungspunkten durchzuführen, gefolgt von einer schnellen Rückkehr zur ursprünglichen Länge, um die dem Nullwert entsprechende Ausgabe des Kraftmesswandlers zu identifizieren. Die hier gezeigten Kräfte stammen sowohl aus der Draufsicht als auch aus der Seitenansicht einer elliptisch geformten Faser aus diesen Blickwinkeln. Die Querschnittsfläche wurde bestimmt, indem die Durchmesser an fünf Stellen entlang der Faserlänge gemessen und anschließend der Mittelwert der fünf resultierenden Flächen berechnet wurde.Kraftkurven von menschlichen langsamen und schnellen Muskel­fasern veranschaulichen, dass schnelle Fasern mit der in diesem Video gezeigten Technik eine höhere Kraftentwicklungs­rate aufweisen als langsame Fasern. Die typischen Eigenschaften von Muskel­fasern des Menschen, der Maus und der Ratte wurden gemessen und sind hier dargestellt. Der angegebene Bereich zeigt die 25. bis 75. Perzentile an, und N steht für die Anzahl der getesteten Fasern.Beachten Sie die große Variabilität der spezifischen Kraft zwischen den verschiedenen Arten. Die hier beschriebenen Verfahren ermöglichen die Beurteilung der maximalen intrinsischen kraftgenerierenden Fähigkeit einer einzelnen skelettmuskulären Faser, wobei durch zusätzliche Interventionen wichtige Aspekte der Skelettmuskelphysiologie untersucht werden können, darunter unter anderem Längenkraft, Kraftgeschwindigkeit und Kraft-Kalzium-Beziehungen.

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Eine funktionale Bewertung der neuromuskulären Synapse (NMJ) kann wesentliche Informationen über die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die NMJ und Muskel Funktionalität mit zwei verschiedenen Muskel-Nerv-Präparate, d.h. Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus umfassend zu bewerten.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Die Bewertung der motorischen Erholung bleibt das Benchmark-Ergebnismaß in experimentellen peripheren Nervenstudien. Die isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei der Ratte ist ein unschätzbares Werkzeug, um funktionelle Ergebnisse nach der Rekonstruktion von Ischiasnervendefekten zu beurteilen. Die Methoden und Nuancen werden in diesem Artikel ausführlich beschrieben.

Maximale isometrische tetanische Kraftmessung des Tibialis-Vordermuskels bei ratten

Das vorliegende Protokoll beschreibt prägnante experimentelle Details zur Auswertung und Interpretation von In-vivo-Drehmomentdaten , die durch elektrische Stimulation des gemeinsamen Peronealnervs bei betäubten Schweinen gewonnen werden.

Im lebenden Organismus Messung des isometrischen Drehmoments des Dorsiflexors der Hintergliedmaßen vom Schwein

Erfahren Sie die Messung der isometrischen Maximalkraft permeabilisierter Skelettmuskelfasern. Diese Methode ermöglicht die Analyse kontraktiler Eigenschaften einzelner Fasern ohne Komplexität ganzer Muskeln.

Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert

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