Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit der Zweiphotonen-Mikroskopie Kalzium oder Stickstoffmonoxid in einem frisch isolierten Gefäß zu messen. Dies wird zunächst durch die mechanische Isolation und Vorbereitung des Gefäßes erreicht. Anschließend wird das Gefäß in einem Kalzium-Markierungsfarbstoff oder einem O-Markierungsfarbstoff mit onischer Säure inkubiert.

Danach wird das Gefäß mit Hilfe einer mit Silikon beschichteten Schale mit Raster und Stiften fixiert, um eine stabile Ansicht während der Zweiphotonen-Bildgebung zu gewährleisten. Abschließend wird die Zweiphotonen-Bildgebung durchgeführt und die Ergebnisse quantifiziert. Dieses Video zeigt die Erhöhung der intrazellulären Kalziumsignalisierung in endothelialen Zellen isolierter Blutgefäße als Reaktion auf Änderungen der extrazellulären Kalziumkonzentration.

Mithilfe dieser Methode können Forscher letztendlich Kalzium- oder Stickstoffmonoxid-Änderungen in endothelialen Zellen oder glatten Muskelzellen eines frisch isolierten Blutgefäßes verfolgen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie eine bessere Signalauflösung und präzisere Messungen intrazellulärer Prozesse in vaskulären Geweben ermöglicht. Hier wurde diese Technologie in Kombination mit klassischen, nicht geometrischen Würfeln angewandt, um Kalziumtransienten und die Stickstoffmonoxid-Produktion in einzelnen Zellen an einer isolierten hohlen Pfeifentangwal-Art zu messen.

Wir sind der Ansicht, dass diese Technik dazu beitragen wird, unser Wissen über den Mechanismus regulierter intrazellulärer Kalzium- und Oxidgehalte in den verschiedenen vaskulären Zelltypen voranzubringen. Die Mikroskopie-Bildgebung lebender Zellen mittels Zwei-Photonen-Anregung, insbesondere in intakten Geweben wie Blutgefäßen, bietet die Vorteile eines hochauflösenden Signals und einer geringen Hintergrundfluoreszenz außerhalb der Fokusebene. Die enge Lokalisierung der Zwei-Photonen-Anregung beleuchtet ein einzelnes Fokalvolumen im Gewebe, verringert die Absorption außerhalb des Fokus erheblich und reduziert die Lichtstreuung, wodurch wir Fluoro-Vier-Dynamiken in stark autofluoreszierenden Geweben mit Kollagen- und Elastinfasern abbilden können.

Nach der Isolierung einer Rattenaorta gemäß dem Textprotokoll unter einem Stereomikroskop das Fett- und Bindegewebe mit feinen Pinzetten und Mikroscheren von der Aorta ablösen. Sobald die Aorta gereinigt ist, das Organ longitudinal einschneiden und in physiologische Salzlösung überführen, um es später zu verwenden. Um das Beladungs-Cocktail vorzubereiten, sieben Mikroliter einer fertigen einmillimolaren Fluoh-4:00-AM-Farbstoff- und DMSO-Lösung zu 450 Mikrolitern PSS ohne Calcium geben.

Fügen Sie anschließend 40 µL einer nicht auf DMSO basierenden 10%igen Säurelösung zum Lade-Cocktail hinzu, um die Dispersion der Acetmethyllester und die Beladung mit dem Kalziumfarbstoff zu verbessern. Geben Sie die präparierten Aorten in 500-µL-Röhrchen, die den Lade-Cocktail enthalten. Bedecken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler.

Nachdem Sie den Textprotokoll befolgt haben, um das Aortengewebe auf der Oberfläche einer silikonbeschichteten Schale zu befestigen, stellen Sie die Schale unter das Okular eines aufrechten Zwei-Photonen-Mikroskops und installieren sowie positionieren ein 25×-Wasserimmersions-Objektiv oberhalb der Probe. Bringen Sie einen entsprechenden Emissionsfilter in die Mikroskop-Öffnung ein. Aktivieren Sie über die Software den Infrarotlaser für die Zwei-Photonen-Anregung und stellen Sie die Laseranregung unter Durchlicht auf 820 Nanometer ein. Suchen Sie mithilfe der groben Objektiveinstellung die Aorta und fokussieren Sie das Objektiv auf die endotheliale Oberfläche.

Schalten Sie das Mikroskop in den Zweiphotonen-Laserscanning-Modus und stellen Sie sicher, dass der Anregungslaser im Modusgesperrt-Zustand ist. Die nicht DS-gescannten Detektoren werden mit etwa fünf bis 10 % Laserleistung aktiviert. Beginnen Sie mit dem Live-Scanning.

Und schließlich justieren Sie das Objektiv, um die Endothel- oder glatten Muskelzellen scharfzustellen. Erfassen Sie sequenzielle Bilder gemäß dem experimentellen Protokolltext. Speichern Sie die Bilder in einem Format, das die Metadaten enthält, um die Bildverarbeitung und Berechnung durchzuführen. Laden Sie das Bildverarbeitungspaket Fiji herunter und installieren Sie es, das unter der General Public License veröffentlicht wird.

Öffnen Sie mithilfe der Software eine Bilddatei. Teilen Sie anschließend, wenn dazu aufgefordert, das durchgelassene Licht und die fluoreszierenden Kanäle, um innerhalb des Fiji-Programms nur die fluoreszierenden Kanäle für die Datenanalyse zu verwenden. Klicken Sie auf den Reiter „Analysieren“ und scrollen Sie bis zum Menüpunkt „Werkzeuge“.

Klicken Sie dann auf den Reiter „ROI-Manager“, und ein neues Fenster wird angezeigt. Als Nächstes klicken Sie unter dem Reiter „Analysieren“ auf „Messungen festlegen“ und wählen die spezifischen gewünschten Messungen aus. Für die Kalziumtransienten-Messungen.

Verwenden Sie die Option „Mittlerer Grauwert“. Verwenden Sie dann mit dem kreisförmigen Spurwerkzeug die Bereiche von Interesse und klicken Sie im ROI-Manager für jede ausgewählte ROI auf „Hinzufügen“. Sobald alle Zellen von Interesse unter der Registerkarte „Mehr“ im ROI-Manager erfasst wurden, wählen Sie „Mehrfachmessung“.

Speichern Sie abschließend die Messungen entweder direkt oder kopieren und fügen Sie sie in eine Tabellenkalkulation ein und führen Sie die Berechnungen gemäß dem Textprotokoll durch. Mithilfe des in diesem Video beschriebenen Protokolls lassen sich die endothelialen Zellen der Aorta aufgrund ihrer Form und ihres starken Fluoreszenzsignals leicht lokalisieren. Auch glatte Muskelzellen sind im selben Bildfeld wie die endothelialen Zellen sichtbar, was zu einem besseren Verständnis darüber führt, wie beide Zelltypen gemeinsam, aber unabhängig voneinander auf verschiedene Agonisten und Reize reagieren, und somit die Nützlichkeit dieser Methode verdeutlicht.

Die Messungen der Reaktion auf Acetylcholin oder einen CHA-vermittelten, stark calciumabhängigen vasodilatatorischen Effekt des Endothels wurden wie hier gezeigt bestimmt, nachdem nach Zugabe von CH eine erhöhte Fluoreszenz in Endothelzellen beobachtet wurde im Vergleich zu Zellen in PSS allein, was auf einen schnellen Anstieg des intrazellulären Calciumgehalts hinweist, der langsam auf den Ausgangswert zurückkehrt. Dieses Protokoll eignet sich ebenfalls zum Nachweis der endothelialen Stickstoffmonoxid-Produktion. In diesem Experiment wurden aortale Endothelzellen mit DAF FM D-Acetat beladen.

Die Produktion von Farbstoff-ENO stieg in Abhängigkeit von Calcium als Reaktion auf eine CH-Stimulation an, und diese Reaktion wurde durch den endothelialen OCH-Synthase-Inhibitor L-Name blockiert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der kardiovaskulären Physiologie zu beantworten. Die Anwendung des hier beschriebenen experimentellen Verfahrens zusammen mit mehreren verfügbaren genetisch modifizierten Tiermodellen eröffnet neue Perspektiven für den Einsatz der Zwei-Photonen-Mikroskopie in der Grundlagen- und translationsorientierten Forschung.

Die Anwendung dieses Ansatzes könnte Ihnen ein detailliertes Verständnis und einen mechanistischen Einblick in spezifische intrazelluläre Signalwege innerhalb der Blutgefäßzellen vermitteln. Nach dem Anschauen dieses Videos werden Sie gelernt haben, wie Sie diese Technik zur Echtzeitüberwachung der Kalzium- und Stickstoffmonoxidkonzentrationen in einzelnen Zellen frisch isolierter Blutgefäße anwenden.