Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Einschließung einer thermogenen katabolen Zelllinie sowie deren Anwendungen in vitro und potenziell in vivo zu demonstrieren. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine Natriumalginat-Zellsuspension herstellen und in eine 5-mL-Spritze überführen. Im nächsten Schritt verwenden Sie eine Einschließungsvorrichtung, um die Alginat-Mikroperlen herzustellen.

Die Mikroperlen werden anschließend mit einer polyionischen Poly-L-Lysin-Lösung beschichtet, und der Alginate-Kern wird danach entfernt, um eine semipermeable Membran um eine Zellsuspension zu bilden. Im letzten Schritt werden die eingeschlossenen Zellen entweder mit anderen Zelllinien koinkubiert oder in das Fettgewebe von Mäusen injiziert. Schließlich zeigt die immunologische Blutanalyse eine höhere lipolytische Aktivität in Adipozyten, die mit Aldehyddehydrogenase koinkubiert wurden, einer Mikrokapsel, die einen defizienten Adipozyten enthält.

Während die Immunhistochemie eine erfolgreiche Transplantation verkapselter Zellen in das Fettgewebe von Mäusen zeigt, kann diese Methode Einblicke in die Thermogenese und das apustische Gewebe gewähren. Sie kann außerdem auf andere bestehende Tiermodelle angewendet werden, um ein kostengünstiges experimentelles Modellsystem zur Untersuchung von Zellsubpopulationen in vivo bereitzustellen. Für biomedizinische Entdeckungen sollten alle Verfahren in einem Biosicherheitswerkbank der Sicherheitsstufe zwei mit laminarer Luftströmung durchgeführt werden.

Entfernen Sie zunächst das alte Medium aus dem Zellkulturgefäß und waschen Sie die Präadipozyten mit 10 Milliliter PBS ab. Entfernen Sie den PBS und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Milliliter 0,25 % Trispingelösung mit EDTA. Entnehmen Sie einen 10-Mikroliter-Aliquot aus der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers.

Gemäß den Herstelleranweisungen DMEM zu den verbleibenden Zellen hinzufügen, um die ideale Zellmenge zu erhalten, und fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 480 × g zentrifugieren. Nach Bestimmung der erforderlichen Zellmenge gemäß den Anweisungen im Protokolltext wird das Zellpellet in einem geeigneten Volumen einer 2 %igen Natriumalginat-Netzlösung suspendiert. Die Natriumalginat-Zelllösung in eine 5-Milliliter-Spritze überführen.

Entfernen Sie alle Luftblasen in der Lösung und drehen Sie die Spritze um, um eine ein Milliliter große Luftblase zu erzeugen. Stellen Sie zur Vorbereitung der Einschließung ein kleines Becherglas mit 144 Millilitern einer 100 Millimolar Calciumchloridlösung bereit. Befestigen Sie unter der Nadelöffnung der Einschließungsvorrichtung die Elektrode am Einschluss, wobei die Spitze etwa 2,5 Zentimeter über der Oberfläche der Calciumchloridlösung liegen sollte.

Platzieren Sie die Spritze mit der Natriumalginat-Zelllösung fest in der Spritzenpumpe. Befestigen Sie den Gummischlauch an der Öffnung der Spritze. Drücken Sie den Kolben, bis die Natriumalginat-Zelllösung bis zur Hälfte des Schlauchs eindringt.

Stellen Sie die Spannung auf 5,4 Kilovolt ein und setzen Sie den Durchmesser auf 12,06 Millimeter an der Spritzenpumpe. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf drei Milliliter pro Stunde ein. Starten Sie die Pumpe, schalten Sie das Encapsulat ein und halten Sie die Spannung bei 5,4 Kilovolt.

Schließen Sie das Fenster der Haube und vermeiden Sie unnötige Vibrationen, bis die Bildung der alginathaltigen Mikroperlen abgeschlossen ist. Nachdem die gesamte Lösung durch die Nadel gelaufen ist, härtet man die kugelförmigen Alginate-Mikroperlen weitere 20 Minuten in der Calciumchloridlösung aus, bevor sie mit polyanionischem Polylysin oder PLL beschichtet werden. Sobald die kugelförmigen Mikroperlen aus Natriumalginat ausgehärtet sind, nehmen Sie das Becherglas mit den Mikroperlen vom Einschlussgerät.

Überführen Sie die Mikroperlen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie die Calciumchloridlösung vom Mikroperlenpellet. Waschen Sie die Mikroperlen, indem Sie 30 Milliliter einer 0,9%igen Natriumchloridlösung hinzufügen und das Röhrchen vorsichtig von Hand schütteln.

Lassen Sie die Mikroperlen durch Schwerkraft ausfallen. Entfernen Sie dann mithilfe einer 25-Milliliter-Pipette auf diese Weise die Natriumchloridlösung. Waschen Sie die Mikroperlen insgesamt dreimal.

Fügen Sie als Nächstes die 0,05 %ige PLL-Lösung zu den Mikroperlen hinzu. Verwenden Sie 10 Milliliter PLL-Lösung pro einen Milliliter Natriumalginatlösung. Vortexen Sie 10 Minuten lang mit 1000 Umdrehungen pro Minute, was gewöhnlich ausreichend für die PLL-Beschichtung ist.

Nach Bestätigung der Bildung der PLL-Beschichtung die PLL-Lösung entfernen und die Kapseln dreimal mit einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung waschen, wie zuvor gezeigt. Um zunächst den alternativen Kern aus den mit PLL beschichteten Mikroperlen zu entfernen, 30 Milliliter einer 50 Millimolar-Natriumcitrat-Lösung in das 50-Milliliter-Gefäß geben. Fünf Minuten warten oder bis das gesamte Natriumalginat aufgelöst ist. Die Kapseln anschließend dreimal mit einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung waschen, wie zuvor beschrieben.

Nach der dritten Wäsche übertragen Sie 20 Milliliter Kulturmedium in das Röhrchen und alle Kapseln, die die Zellen enthalten, in einen Zellkulturkolben. Behandeln Sie die eingeschlossenen Zellen unter standardmäßigen Zellkulturbedingungen. Die Wirtszellen für dieses Verfahren sollten bis zur Konfluenz in 24-Well-Platten kultiviert werden. Verwenden Sie Fibroblasten-Wachstumsmedium, das wie im begleitenden Protokoll beschrieben hergestellt wurde.

Text zum Kultivieren von Präadipozyten. Überführen Sie die Mikrokapseln in die 24-Well-Platte mit konfluenten Wirtszellen, fügen Sie Mikrokapseln hinzu, um eine Monoschicht in jedem Well zu erzeugen, und induzieren Sie die Differenzierung der Präadipozyten mit Differenzierungsmedium. Inkubieren Sie für 48 Stunden.

Nach 48 Stunden wechseln Sie das Medium zu Differenzierungsmedium. Zwei, ersetzen Sie das Medium durch frisches Differenzierungsmedium. Zwei. Alle 48 Stunden werden Proteine aus den Zellen mittels Western Blot analysiert.

Jeder Schritt der Herstellung von Mikroperlen kann unter dem Mikroskop beobachtet werden. Eine Alginate-Mikroperle ist bei 20-facher Vergrößerung dargestellt. Vor der PLL-Beschichtung, nach der Codierung mit PLL und nach dem Auflösen des Ginnet-Kerns wurde in einer quantitativen Studie die Expression von adipösem Triglycerid-Lipase oder A TGL unter drei T drei L ein Adipozyten verglichen, die zusammen mit akzellulären, wildtypischen oder Aldehyd-Dehydrogenase-eins-A-eins-defizienten Adipozyten enthaltenden Mikrokapseln kultiviert wurden.

Der höhere Expressiongrad von A TGL in Adipozyten, die zusammen mit einem L DH one A one-defizienten Dipcyten in mikroenkapselten Zellen kultiviert wurden, weist auf eine höhere lipolytische Aktivität hin. In einer In-vivo-Studie wurden GFP-markierte, eingeschlossene Zellen in das intraabdominelle Fettdepot von Mäusen injiziert. 80 Tage später wiesen die injizierten Fettgewebebereiche verfärbte Cluster der eingeschlossenen Zellen auf.

Ein in Paraffin eingebetteter Schnitt des intraabdominalen Fettdepots, der mit Hämat, Eosin und Toin gefärbt wurde, zeigt Cluster implantierten Mikrokapseln mit eingeschlossenen Zellen sowie Wirtsadipozyten. Derselbe Schnitt, unter fluoreszierendem Licht analysiert, zeigt GFP-markierte transplantierte Zellen im Inneren runder, intakter Kapseln. Die Expression von GFP ist zudem ein Indikator für die Zellviabilität nach ihrer Entwicklung.

Diese Verkapselungstechnik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Stoffwechselerkrankungen den Weg, um mögliche Behandlungen für Adipositas, Insulinresistenz bei Typ-2-Diabetes, Entzündungen, Krebs und Modellorganismen zu erforschen.