Name: Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Kapselung thermogener Präadipozyten mit Natriumalginat und Poly-L-Lysin für Stoffwechselforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Energieverbrauch und potenzielle Therapieansätze bei Adipositas.

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Wir möchten Jennifer Petrosino und David Disilvestro für redaktionelle Hilfe danken. Diese Arbeit wurde von Verleihungsnummer 20020728 von der American Egg Board und Verleihungsnummer 10040042 von Novo Nordisk Pharma als auch von der Food Innovation Center, Referat für Internationale Angelegenheiten, Center for Advanced Functional Foods Forschung und Entrepreneurship an OSU sowie die unterstützten National Science Foundation gewähren EWG-0914790 (LJL). Die beschriebene wurde von Preis Anzahl R21OD017244 (OZ) und UL1RR025755 (OSUCCC) unterstützt von der National Center for Research Resources Projekt, die das Amt des Direktors, des National Institutes of Health (OD) für medizinische Forschung und finanziert und von der NIH-Roadmap unterstützt NCI P30CA16058. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Center for Research Resources oder der National Institutes of Health.

Das Studienprotokoll wurde von der Ohio State University Ethikkommissionen genehmigt. Tierversuche wurden von IACUC Protokoll genehmigt. Alle Verfahren wurden unter der Ebene 2 Biosicherheitswerkbank mit laminaren Strömung durchgeführt. Wir folgten alle Standard-Sicherheitsanforderungen und Verfahren. Die Mikroverkapselung Technik zur Herstellung von Mikrokapseln wurde beschrieben als 17, 18 durchgeführt. 1. Vorbereitungen für Werkstoff <ol><li> Herstellung von 10 ml der 2% igen Natriumalginatlösung in autoklaviert physiologische Salzlösung (0,9% NaCl in Wasser). Vorzubereiten 0,05% PLL-Lösung in physiologischer Kochsalzlösung. Bereiten Sie diese Lösungen am Tag vor und über Nacht gerührt. Filtern Sie die Lösungen mit 0,22 um Filter vor dem Gebrauch. </li><li> Vorbereitung 50 mM Natriumcitrat und 100 mM CaCl 2 in 0,9% NaCl-Lösungen und autoklavieren. </li><li> Autoklaven alle Lösungen, Nadeln, Elektroden, und Becher. Gründlich reinigen Nadeln mit Drähten zu vermeiden Verstopfung. </li><li> Bestimmung der geeigneten Menge an Zellen für die Kapseln verwenden (102 Mikrokapseln werden für jeden cm 2 erforderlich, und auch gibt es ungefähr 500 Zellen pro Kapsel 18). Verwenden Sie 1 ml Natriumalginat pro zwei Millionen Zellen. </li><li> Vorbereitung eines &quot;Fibroblast Growth Medium&quot;, enthaltend 10% Kälberserum und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin in einer hohen Glucose (4.500 mg / l Glucose), Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM). <ol><li> Vorbereitung einer &quot;Differenzierung Medium I &#39;, das 10% fötales Rinderserum, 10 ug / ml Insulin, 1 &amp; mgr; M Dexamethason, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methyl xanthin und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin in DMEM. </li><li> Bereiten Sie eine &quot;Differenzierungsmedium II &#39;, das 10% fötales Rinderserum, 10 ug / ml Insulin und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin in DMEM. </li></ol></li><li> Vorbereitung Lysepuffer enthaltend ein Protease-Inhibitor-Tablette pro 10 ml Radioimmunfällung Assaypuffer (RIPA-Puffer). </li></ol> 2. Alginate Microbeads Vorbereitung (Abbildung 1A) <ol><li> Entfernen Sie alte Medium von Zellkulturflasche. Spülen Zellen mit 10 ml PBS. Bringen Zellen in Suspension mit 0,25% Trypsin-EDTA (2 ml pro einem konfluenten T175-Kolben). </li><li> Zählen von Zellen in der Zellsuspension unter Verwendung eines Hämozytometers. Verwenden Sie 10 ml Aliquot aus der Zellsuspension und zählen Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zentrifugieren der verbleibenden Zellen in Medium, Zentrifugation bei 480 × g bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Suspendiere das Zellpellet in Natriumalginat, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Übertragen die Natriumalginat-Zell-Lösung in einen 5 ml-Spritze. </li><li> Entfernen Sie Luftblasen in der Lösung, fügen Sie eine 23-Gauge-Nadel und drehen Sie die Spritze, um eine 1 ml Luftblase zu erstellen. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Becher (180 ml) enthält 144 ml 100 mM CaCl 2 -Lösung unter der Nadel Auslauf des encapsulator. Bringen Sie die Elektrode an das encapsulator mit der Spitze approximLICH 2,5 cm über der Oberfläche des 100 mM CaCl 2 -Lösung. </li><li> Legen fest die Spritze mit dem Natriumalginat-Zell-Lösung in der Spritzenpumpe. Befestigen Sie den Gummischlauch an die Öffnung der Spritze. Drücken Sie den Kolben, bis der Natriumalginat-Zell-Lösung tritt auf halbem Weg durch das Rohr. Stellen Sie die Spannung bis 5,4 kV. Stellen Sie die 12,06 mm Durchmesser in der Spritzenpumpe. Passen Sie die Geschwindigkeit bis 3 ml / h. Starten Sie die Pumpe. Schalten Sie den encapsulator und Aufrechterhaltung der Spannung bei 5,4 kV. </li><li> Schließen Sie das Fenster der Haube und vermeiden unnötige Vibrationen bis zum Ende der Ausbildung der Alginat-Mikrokügelchen. Schließlich Lösung durch die Nadel spielt erstarren die Alginat kugelförmigen Mikroperlen in der 100 mM CaCl2-Lösung für weitere 20 min vor der Beschichtung mit PLL. </li></ol> 3. Beschichtungs Microbeads mit PLL (1B) <ol><li> Entfernen Sie das Becherglas mit der Natriumalginat-Zell kugelförmigen Mikroperlen und übertragen diese microbEADS in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Entfernen CaCl 2 -Lösung aus dem Mikrokügelchen Pellets. </li><li> Durch Zugabe von 30 ml 0,9% NaCl waschen die Alginat-Zell kugelförmigen Mikrokügelchen. Schütteln Sie das Röhrchen mit der Hand sanft. Entfernen Sie 0,9% NaCl mit 25 ml Pipette nach dem die Mikrokügelchen wurden durch die Schwerkraft ausgefällt. Wiederholen Sie zwei weitere Male für insgesamt 3 Waschschritten. </li><li> Verwenden von 10 ml 0,05% PLL-Lösung pro 1 ml Natriumalginatlösung. Fügen Sie die 0,05% PLL und Wirbel bei 1.000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten. Hinweis: In der Regel ist 10 Minuten ausreichend für PLL-Beschichtung. </li><li> Nach PLL Mantel gebildet wird, entfernen Sie die PLL-Lösung und waschen Sie die Kapseln 3 mal wie in 3.2 beschrieben. </li></ol> 4. Entfernung von Alginat Core (1C) <ol><li> 30 ml 50 mM Natriumcitrat-Lösung. Warte 5 Minuten oder bis das Natriumalginat aufgelöst ist. Waschkapseln dreimal wie in Schritt 3.1.1 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie die 0,9% NaCl, 20 ml Kulturmedium zu der 50 ml Tubeabtreten und Kapseln mit den Zellen bis zu einer Zellkulturflasche. Griff eingekapselten Zellen unter Standardzellkulturbedingungen 18. </li></ol> 5. In-vitro-Anwendungen zu Xenograft und Host-Zell-Interaktionen oder Kinetik der Metabolit Influx / Efflux zwischen Zellen zu untersuchen (Abbildung 2) <ol><li> Kultur von Wirtszellen auf Platte mit 24 Vertiefungen bis zur Konfluenz für Co-Kulturen. Verwenden Sie die &quot;Fibroblast Growth Medium &#39;für die Kultivierung Präadipozyten. </li><li> Transfer-Mikrokapseln in 24 Well-Platte mit konfluenten Wirtszellen. In Mikrokapseln, um eine Monoschicht zu erreichen (102 Mikrokapseln / cm 2 von gut). </li><li> Induzieren Pre-Adipozyten-Differenzierung mit Differenzierungsmedium I. Jede 48 Stunden, Wechselmedien, um die Differenzierung Medium II für sechs Tage. Lyse-Zellen in RIPA-Puffer. Verwenden Sie 50 ug Protein pro Zustand um die Proteinexpression mittels Western-Blot-Analyse. </li></ol> 6. In vivo-Anwendung für Treatment of Obesity (Abbildung 3) <ol><li> Mischen Sie 4% Isofluran mit Sauerstoff zur Einleitung der Narkose und 2% Isofluran mit Sauerstoff zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Bestätigen ausreichende Narkosetiefe von toe Prise. <ol><li> Bewerben Anti-Juckreiz Salbe auf die Augen, um die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen. </li></ol></li><li> Verwenden eingekapselten Zellen, die dauerhaft mit künstlichen fluoreszierendes Protein markiert sind, wie grün fluoreszierendes Protein (GFP). </li><li> Verwenden Sie ein 3-ml-Spritze und einer 20-Gauge-Nadel, um verkapselten Zellen injizieren. <ol><li> Injizieren 0,5 x 10 6 Zellen in 0,2 ml PBS in jede IAB Fettdepots, die im Bereich zwischen einem intraperitoneale Gonade und Niere angeordnet ist, wie in 3 gezeigt eingestellt. Mit diesem Volumen PBS und die Zellzahl für Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht von 40 g. Einzustellen Zellzahl und Volumen bei Mäusen, die unterschiedliche Gewichts oder zur Bestimmung der Dosis-abhängigen Wirkung. </li></ol></li></ol>

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um Zellen, einschließlich Trocknen, Extrudieren und Emulsion 19 einzukapseln. In diesem Verfahren werden die Alginatkapseln durch eine Nadel extrudiert, dann mit PLL beschichtet und das Alginat Kern aufgelöst wird, um die Verkapselung zu vervollständigen. Obwohl dieses Verfahren seit Jahren verwendet worden ist, ist die Bildung der Kügelchen mit der gewünschten Grße und Kugelform immer noch eine Herausforderung. Die Größe der Kapseln ist stark abhängig von der Viskosit...

Zunehmende Häufigkeit von chronischen Krankheiten 1 hat Studien über die Transplantation von therapeutischen Zellpopulationen 2 stimuliert. Syngenen oder allogenen Stammzellen sind die am häufigsten verwendeten Zelltypen für diese Anwendungen 2. Jedoch sind diese Behandlungen nicht erlauben Steuerung Differenzierung und Migration von Stammzellen nach der Implantation und sind nicht kosteneffizient. Die Transplantation von genetisch modifizierten Zellen mit nützlichen Funktionen rechnet die Verbesserung der Behandlung vieler Krankheiten. Allerdings sind genetische Zell Änderungen durch den Host-Immunsystem erkannt, deshalb diese Behandlungen benötigen Immunsuppression 3. Verkapselung von Zellen, die Insulin wurde von Dr. Chang 4 entwickelt. Die Technik basiert auf Verkapselung der Zellen im Alginat-Tröpfchen, die in einer Calciumchloridlösung eingetaucht sind, beruht. Alginat Moleküle aus Mannuronsäure (M) und Guluronsäure (G) und können durch Ca 2+ verbunden werden. Nach der Gelierung werden die Perlen ein Poly-L-Lysin (PLL) suspendiert. Während dieser Stufe bindet PLL bis G und M in der Alginat-Moleküle, die die Kapselmembran herstellt. Die Porosität der Kapselmembran kann durch Variation der M und PLL-Konzentrationen, die Inkubationszeit und der Temperatur moduliert werden. Die Bindung von PLL hängt auch von der Art und Konzentration des Alginats. Alginat Matrizen mit Ca 2+ -Ionen vernetzt, sind instabil in der physiologischen Umgebung oder in gemeinsamen Pufferlösungen mit einer hohen Konzentration an Phosphat und Citrationen. Diese Puffer können Ca 2+ aus dem Alginat zu extrahieren und zu verflüssigen den Kern. Verflüssigung des Alginats Kern schafft Platz in den Kapseln für die zelluläre Bewegung und Wachstum. Zellen in polyanionischen Alginats mit polykationische Poly-L-Lysin (APL) eingekapselt sind undurchlässig für Immunglobuline aber Zustrom von Nährstoffen und Ausstrom von Toxinen. Objekte Das APL ermöglichen die langfristige survival von verkapselten Zellen nach Transplantation in genetisch verschiedenen Hosts. Elliott et al. Berichteten über die Überlebensrate von funktionierenden eingekapselt Schweinepankreaszellen in einem menschlichen Patienten neun Jahre nach der Implantation 5. Verkapselungstechniken können in Mikroverkapselung (3-800 &amp; mgr; m) und Makroverkapselung (größer als 1000 &amp; mgr; m) klassifiziert werden. Mikrokapseln sind haltbarer als Makrokapseln 6. Seit seiner Entdeckung durch Dr. Chang und seine Kollegen im Jahr 1964, Mikroverkapselung wurde in großem Umfang für die Verkapselung von anabolen Zellen Insulin produzieren, andere Hormone, und bioaktive Moleküle 7 verwendet. Diese Behandlungen konfrontiert mehrere Herausforderungen in das Wirtsgewebe einschließlich Fibrose und Immunantwort 8. Anfänglich sind die Nebenwirkungen auf die Qualität des Biopolymeren bezogen wurden gelöst. Jedoch Transplantation von anabolen Zellen noch initiiert Nebenwirkungen, wie Fibrose infolge der Hormon overproduktion außerhalb eines spezialisierten Drüse. In den letzten Jahrzehnten, Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes hat epidemische Ausmaße erreicht 9. Mehr als 30% der erwachsenen Menschen weltweit sind übergewichtig und fettleibig 10. Vermehrtem intraabdominellen (IAB) Fettbildung erhöht die Inzidenz der chronischen Entzündung und fördert die Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf- Erkrankungen, bestimmte Krebsarten und andere Begleiterkrankungen 11-13. Mehrere Beweis vorgeschlagen, dass Pathogenese mit IAB Fett verbunden sind, können durch spezifische Fettzellen verhindert werden. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Transplantation von subkutanen Fettzellen in IAB-Region kann den Stoffwechsel zu verbessern und die Adipositas und Insulinresistenz bei Nagern in vivo 14 gezeigt. Senkung von Adipositas und Insulinresistenz mit thermogenic Adipozyten Energie aufnehmend in Form von Wärme 15,16 in Verbindung gebracht. Thermogenic Änderung der Fettzellen kann durch eine stabile Transfektion erreicht werdenvon Genen, die an der mitochondrialen Protonenentkopplungs wie Abkoppeln Protein 1 (UCP1) oder von Genen regulieren die Expression von UCP1 und andere thermogene Gene 15,16. Unsere bisherigen Studien zeigten, dass Mängel in der Aldehyddehydrogenase 1 a1 (Aldh1a1) führt zum thermogene Remodellierung von Iab Fett, Fettsucht und Insulinresistenz bei diesen Mäusen 17,18 verringert. Bemerkenswert ist, Verkapselung von thermogenic Aldh1a1 mangel (Aldh1a1 - / -) Präadipozyten vermittelt gleiche therapeutische Wirkung im IAB Fett bei übergewichtigen Wildtyp-Mäusen, was darauf hindeutet, neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung der IAB-Fett 18. In experimentellen Einstellungen verkapselten Zellen können die Forscher die Auswirkungen spezifischer Zellpopulationen in einer kosteneffektiven Weise 19 zu studieren. Hier diskutieren wir die Methode der Verkapselung eines thermogene katabolen Zelllinie und ihre Labor und therapeutische Anwendung in einem Mausmodell für Fettleibigkeit. Das Protokoll beschreibt three Phasen für die Mikrokapselherstellung (Abbildung 1): die Bildung von Alginat-Mikrokugeln (Figur 1A), die Bildung der polykationische Poly-L-Lysin (PLL) Membranen, die auf der Oberfläche der Mikrokügelchen, (1B), und das Entfernen des Alginat-Kerne (1C).

<table><tbody><tr><td>Verkapselungsvorrichtung (VAR V1)</td><td>Nisco</td><td>LIN-0042</td><td>Keine</td></tr><tr><td>KD wissenschaftliche Spritzenpumpe</td><td>KD wissenschaftlich</td><td>780100Y</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Olympus Mikroskop&nbsp;</td><td>Olympus Optical</td><td>IX70-S8F2</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Natriumalginat</td><td>Sigma</td><td>MKBP8122V</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinhydrobromid (PLL)</td><td>Sigma</td><td>020M5006V</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>SLBJ2662V</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Natriumcitrat dreibasisches Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>030M0200</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>SLBD2595V</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gele</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1093</td><td>Keine</td></tr><tr><td>ATGL Primärantikörper (von Kaninchen)</td><td>Cell Signaling</td><td>2138S</td><td>Keine Sekundärer</td></tr><tr><td>Antikörper (Anti Kaninchen)</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Puffer für Radio-Immunpräzipitation Assay (RIPA)</td><td>Boston BioProducts</td><td>D25Y6Z</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>RNBD2893</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Cortizon 10 Anti-Juckreiz-Salbe</td><td>Cortizon 10</td><td>C4029138</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Serum für neugeborene Kälber (CS)</td><td>Sigma</td><td>N4762</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Keine</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Insulin (Rinder)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Keine</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktailtabletten</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>Keine</td></tr></tbody></table>

encapsulation thermogenic präadipozyten für die transplantation in fettgewebe depots

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Verkapselung von Zellen entwickelt worden, um lebensfähige Zellen in semipermeable Membranen einschließen. Die transplantierten Zellen können eingekapselt Gewicht niedermolekularen Metaboliten in Gewebe des behandelten Wirts austauschen, um langfristiges Überleben zu erreichen. Die semipermeable Membran ermöglicht engrafted eingekapselten Zellen um die Abstoßung durch das Immunsystem zu vermeiden. Die Verkapselung Verfahren wurde entwickelt, um eine kontrollierte Freisetzung von bioaktiven Verbindungen, wie Insulin, andere Hormone und Cytokine aktivieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verkapselung von Abbauzellen, die Lipide für die Wärmeerzeugung und Energieverlust (Thermogenese) im intra-abdominale Fettgewebe von fettleibigen Mäusen verbrauchen. Verkapselung von thermogenic katabolen Zellen können potentiell für die Prävention und Behandlung von Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes. Eine weitere mögliche Anwendung der katabolen Zellen können Entgiftung von Alkoholen oder anderen toxischen Metaboliten und Umweltschadstoffe sind.

Figur 1 zeigt, daß jeder Schritt der Mikroproduktion könnte unter dem Mikroskop kontrolliert werden. 2A zeigt, wie man mit einer Monoschicht von eingekapselten Zellen Kokultur Adipozyten. 2B ist ein repräsentatives Beispiel für eine quantitative Untersuchung mit Adipozyten / Mikrokapseln Kokulturen dass wurden in Abschnitt 5 beschriebenen Lysate von Adipozyten wurden mittels Western-Blot analysiert. Eingekapselten Zellen wurden in diesem Experiment untersucht. 1.000 Ver...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Verkapselung von katabolen Zellen, die Lipide für die Wärmeerzeugung im intraabdominalen Fettgewebe verbrauchen und die Energiedissipation bei adipösen Mäusen erhöhen.

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Einschließung einer thermogenen katabolen Zelllinie sowie deren Anwendungen in vitro und potenziell in vivo zu demonstrieren. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine Natriumalginat-Zellsuspension herstellen und in eine 5-mL-Spritze überführen. Im nächsten Schritt verwenden Sie eine Einschließungsvorrichtung, um die Alginat-Mikroperlen herzustellen. Die Mikroperlen werden anschließend mit einer polyionischen Poly-L-Lysin-Lösung beschichtet, und der Alginate-Kern wird danach entfernt, um eine semipermeable Membran um eine Zellsuspension zu bilden. Im letzten Schritt werden die eingeschlossenen Zellen entweder mit anderen Zelllinien koinkubiert oder in das Fettgewebe von Mäusen injiziert. Schließlich zeigt die immunologische Blutanalyse eine höhere lipolytische Aktivität in Adipozyten, die mit Aldehyddehydrogenase koinkubiert wurden, einer Mikrokapsel, die einen defizienten Adipozyten enthält.Während die Immunhistochemie eine erfolgreiche Transplantation verkapselter Zellen in das Fettgewebe von Mäusen zeigt, kann diese Methode Einblicke in die Thermogenese und das apustische Gewebe gewähren. Sie kann außerdem auf andere bestehende Tiermodelle angewendet werden, um ein kostengünstiges experimentelles Modellsystem zur Untersuchung von Zellsubpopulationen in vivo bereitzustellen. Für biomedizinische Entdeckungen sollten alle Verfahren in einem Biosicherheitswerkbank der Sicherheitsstufe zwei mit laminarer Luftströmung durchgeführt werden.Entfernen Sie zunächst das alte Medium aus dem Zellkulturgefäß und waschen Sie die Präadipozyten mit 10 Milliliter PBS ab. Entfernen Sie den PBS und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Milliliter 0,25 % Trispingelösung mit EDTA. Entnehmen Sie einen 10-Mikroliter-Aliquot aus der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers.Gemäß den Herstelleranweisungen DMEM zu den verbleibenden Zellen hinzufügen, um die ideale Zellmenge zu erhalten, und fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 480 × g zentrifugieren. Nach Bestimmung der erforderlichen Zellmenge gemäß den Anweisungen im Protokolltext wird das Zellpellet in einem geeigneten Volumen einer 2 %igen Natriumalginat-Netzlösung suspendiert. Die Natriumalginat-Zelllösung in eine 5-Milliliter-Spritze überführen.Entfernen Sie alle Luftblasen in der Lösung und drehen Sie die Spritze um, um eine ein Milliliter große Luftblase zu erzeugen. Stellen Sie zur Vorbereitung der Einschließung ein kleines Becherglas mit 144 Millilitern einer 100 Millimolar Calciumchloridlösung bereit. Befestigen Sie unter der Nadelöffnung der Einschließungsvorrichtung die Elektrode am Einschluss, wobei die Spitze etwa 2,5 Zentimeter über der Oberfläche der Calciumchloridlösung liegen sollte.Platzieren Sie die Spritze mit der Natriumalginat-Zelllösung fest in der Spritzenpumpe. Befestigen Sie den Gummischlauch an der Öffnung der Spritze. Drücken Sie den Kolben, bis die Natriumalginat-Zelllösung bis zur Hälfte des Schlauchs eindringt.Stellen Sie die Spannung auf 5,4 Kilovolt ein und setzen Sie den Durchmesser auf 12,06 Millimeter an der Spritzenpumpe. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf drei Milliliter pro Stunde ein. Starten Sie die Pumpe, schalten Sie das Encapsulat ein und halten Sie die Spannung bei 5,4 Kilovolt.Schließen Sie das Fenster der Haube und vermeiden Sie unnötige Vibrationen, bis die Bildung der alginathaltigen Mikroperlen abgeschlossen ist. Nachdem die gesamte Lösung durch die Nadel gelaufen ist, härtet man die kugelförmigen Alginate-Mikroperlen weitere 20 Minuten in der Calciumchloridlösung aus, bevor sie mit polyanionischem Polylysin oder PLL beschichtet werden. Sobald die kugelförmigen Mikroperlen aus Natriumalginat ausgehärtet sind, nehmen Sie das Becherglas mit den Mikroperlen vom Einschlussgerät. Überführen Sie die Mikroperlen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie die Calciumchloridlösung vom Mikroperlenpellet. Waschen Sie die Mikroperlen, indem Sie 30 Milliliter einer 0,9%igen Natriumchloridlösung hinzufügen und das Röhrchen vorsichtig von Hand schütteln.Lassen Sie die Mikroperlen durch Schwerkraft ausfallen. Entfernen Sie dann mithilfe einer 25-Milliliter-Pipette auf diese Weise die Natriumchloridlösung. Waschen Sie die Mikroperlen insgesamt dreimal.Fügen Sie als Nächstes die 0,05 %ige PLL-Lösung zu den Mikroperlen hinzu. Verwenden Sie 10 Milliliter PLL-Lösung pro einen Milliliter Natriumalginatlösung. Vortexen Sie 10 Minuten lang mit 1000 Umdrehungen pro Minute, was gewöhnlich ausreichend für die PLL-Beschichtung ist.Nach Bestätigung der Bildung der PLL-Beschichtung die PLL-Lösung entfernen und die Kapseln dreimal mit einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung waschen, wie zuvor gezeigt. Um zunächst den alternativen Kern aus den mit PLL beschichteten Mikroperlen zu entfernen, 30 Milliliter einer 50 Millimolar-Natriumcitrat-Lösung in das 50-Milliliter-Gefäß geben. Fünf Minuten warten oder bis das gesamte Natriumalginat aufgelöst ist. Die Kapseln anschließend dreimal mit einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung waschen, wie zuvor beschrieben.Nach der dritten Wäsche übertragen Sie 20 Milliliter Kulturmedium in das Röhrchen und alle Kapseln, die die Zellen enthalten, in einen Zellkulturkolben. Behandeln Sie die eingeschlossenen Zellen unter standardmäßigen Zellkulturbedingungen. Die Wirtszellen für dieses Verfahren sollten bis zur Konfluenz in 24-Well-Platten kultiviert werden. Verwenden Sie Fibroblasten-Wachstumsmedium, das wie im begleitenden Protokoll beschrieben hergestellt wurde.Text zum Kultivieren von Präadipozyten. Überführen Sie die Mikrokapseln in die 24-Well-Platte mit konfluenten Wirtszellen, fügen Sie Mikrokapseln hinzu, um eine Monoschicht in jedem Well zu erzeugen, und induzieren Sie die Differenzierung der Präadipozyten mit Differenzierungsmedium. Inkubieren Sie für 48 Stunden.Nach 48 Stunden wechseln Sie das Medium zu Differenzierungsmedium. Zwei, ersetzen Sie das Medium durch frisches Differenzierungsmedium. Zwei. Alle 48 Stunden werden Proteine aus den Zellen mittels Western Blot analysiert.Jeder Schritt der Herstellung von Mikroperlen kann unter dem Mikroskop beobachtet werden. Eine Alginate-Mikroperle ist bei 20-facher Vergrößerung dargestellt. Vor der PLL-Beschichtung, nach der Codierung mit PLL und nach dem Auflösen des Ginnet-Kerns wurde in einer quantitativen Studie die Expression von adipösem Triglycerid-Lipase oder A TGL unter drei T drei L ein Adipozyten verglichen, die zusammen mit akzellulären, wildtypischen oder Aldehyd-Dehydrogenase-eins-A-eins-defizienten Adipozyten enthaltenden Mikrokapseln kultiviert wurden.Der höhere Expressiongrad von A TGL in Adipozyten, die zusammen mit einem L DH one A one-defizienten Dipcyten in mikroenkapselten Zellen kultiviert wurden, weist auf eine höhere lipolytische Aktivität hin. In einer In-vivo-Studie wurden GFP-markierte, eingeschlossene Zellen in das intraabdominelle Fettdepot von Mäusen injiziert. 80 Tage später wiesen die injizierten Fettgewebebereiche verfärbte Cluster der eingeschlossenen Zellen auf.Ein in Paraffin eingebetteter Schnitt des intraabdominalen Fettdepots, der mit Hämat, Eosin und Toin gefärbt wurde, zeigt Cluster implantierten Mikrokapseln mit eingeschlossenen Zellen sowie Wirtsadipozyten. Derselbe Schnitt, unter fluoreszierendem Licht analysiert, zeigt GFP-markierte transplantierte Zellen im Inneren runder, intakter Kapseln. Die Expression von GFP ist zudem ein Indikator für die Zellviabilität nach ihrer Entwicklung.Diese Verkapselungstechnik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Stoffwechselerkrankungen den Weg, um mögliche Behandlungen für Adipositas, Insulinresistenz bei Typ-2-Diabetes, Entzündungen, Krebs und Modellorganismen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Primäre weißen Präadipozyten aus weißem Fettgewebe von Mäusen isoliert werden in beige / brite Zellen unterschieden werden. Präsentiert hier ist ein zuverlässiger zellulären Modellsystem, um die molekulare Regulation von "Bräunung" der weiße Fett zu studieren.

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Hier präsentieren wir menschliche Fettgewebe enzymfreie Mikrofragmentierung mit einem geschlossenen Systemgerät. Diese neue Methode ermöglicht die Gewinnung von Submillimeter-Clustern von Fettgewebe, die für In-vivo-Transplantationen, In-vitro-Kulturen und weitere Zellisolation und -charakterisierung geeignet sind.

Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von primären braunen und weißen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen. Isolierte Zellen können in Kultur gezüchtet und dazu gebracht werden, sich in voll ausgereifte weiße und braune Adipozyten zu differenzieren. Die Methode ermöglicht die genetische, molekulare und funktionelle Charakterisierung primärer Fettzellen in Kultur.

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

Diese fettbedeckte Inseltransplantationsmethode eignet sich für den Nachweis von eingepfropften Inseln in der intraperitonealen Höhle. Insbesondere erfordert es nicht die Verwendung von Biobindemitteln oder Naht.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Phänotypisierung von mikrovaskulären Endothelzellen aus humanem subkutanem Fettgewebe (hSATMVECs). Zusätzlich beschreiben wir ein experimentelles Modell des hSATMVEC-Adipozyten-Cross-Talks.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Die Größe und Zerbrechlichkeit reifer Adipozyten haben die Techniken und Werkzeuge, die für ihre Untersuchung und Isolierung zur Verfügung stehen, eingeschränkt. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung reifer muriner Adipozyten beschrieben, das leicht an verschiedene Fettdepots und Mausdiäten angepasst werden kann.

Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen

Erfahren Sie die Kapselung thermogener Präadipozyten mit Natriumalginat und Poly-L-Lysin für Stoffwechselforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Energieverbrauch und potenzielle Therapieansätze bei Adipositas.

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

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