Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität einzelner Kanäle zu registrieren und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration in frisch aus Nagetiermodellen der polyzystischen Nierenerkrankung isolierten zystischen Monolagen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die PCK rec-Nieren über die Aorta abdominalis gespült werden, um Blut aus dem Nierengewebe zu entfernen. Der zweite Schritt besteht darin, das epitheliale Monolayer der Zysten zu isolieren.

Anschließend kann die isolierte Einzelschicht für herkömmliche Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Ionenkanälen in den apikalen Membranen epithelialer Zellen verwendet werden. Das isolierte Gewebe kann außerdem zum Beladen mit Kalziumfarbstoffen genutzt werden, um Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration in den epithelialen Zellen zu quantifizieren.

Diese in der nativen Umgebung von Zysten gemessenen Parameter können mit gesunden Tubuli verglichen werden, um den Prozess der Zystenagenese zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Chi-Kanalaktivität und des Kalziumflusses in den Nierenzysten ermöglicht. Diese Analyse liefert physiologisch irrelevante Daten, die aus frisch isolierten Geweben gewonnen wurden.

Mithilfe dieses Ansatzes können wir die Aktivität einzelner Kanäle in frisch isolierten Epithelien überwachen. Es handelt sich um eine einzigartige Methode, da sie zur genauen Charakterisierung des Verhaltens von Eisenkanälen unter Verwendung verschiedener Modifikationen der Patch-Technik eingesetzt werden kann. Wir sind in der Lage, die Reaktion der Kanäle auf verschiedene Wirkstoffe in zystischen und gesunden Tubuli zu testen.

Die frisch isolierte Zysten-Monolayer kann für die intrazelluläre Kalzium-Bildgebung verwendet werden. Diese Technik ermöglicht die pharmakologische Untersuchung und funktionelle Analysen der intrazellulären Kalziumhomöostase in zystischen Zellen, die wichtige Ansatzpunkte zur Entdeckung neuer Therapien zur Verhinderung der polyzystischen Nierenerkrankung darstellen. Blutleerungssorgfalt zeigt den chirurgischen Zugangsweg, der verwendet wird, um die Nieren von Blut zu befreien.

Die Isolationsverfahren für die Niere und Zysten werden zuerst gezeigt. Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer Laparotomie und spülen Sie die Nieren über die Aorta abdominalis einer anesthetisierten Ratte mit PBS aus. Verbinden Sie hierzu einen Katheter aus Polyethylenschlauch mit einer Spritzenpumpe, die mit PBS gefüllt ist.

Schneiden Sie die Haut und die Bauchdecke entlang der Bauchmittel­linie auf und schieben Sie die Bauchorgane mit Wattestäbchen beiseite, um Zugang zur absteigenden Aorta mit ihren abzweigenden mesenterischen und zöliakalen Arterien zu erhalten. Bringen Sie anschließend die erste Ligatur um die mesenterischen und zöliakalen Arterien und die zweite Ligatur um die Aorta unterhalb des Zwerchfells an.

Trennen Sie die Aorta ADOS vorsichtig durch stumpfe Präparation der umgebenden Bindegewebsstrukturen mit einer Pinzette. Bringen Sie dann die dritte Ligatur etwa drei Millimeter unterhalb der linken Nierenarterie und die vierte Ligatur oberhalb der Bifurkation der Beckenarterien an. Knoten Sie die vierte Ligatur und befestigen Sie eine Gefäßklemme um die Aorta zwischen der linken Nierenarterie und der dritten Ligatur.

Schneiden Sie zwischen der Klemme und der vierten Ligatur ein, um die Aorta zu katheterisieren. Befestigen Sie dann den Katheter mithilfe der dritten Ligatur fest. Lösen Sie nun die Klemme.

Stellen Sie sicher, dass der Blutpuls im Katheter sichtbar ist, um eine korrekte Platzierung zu überprüfen. Danach beginnen Sie die Perfusion und binden die erste und zweite Ligatur. Anschließend durchtrennen Sie schnell die linke Nierenvene, um den Druck zu entlasten.

Spülen Sie weitere ein bis zwei Minuten lang fort, bis die Organe vollständig entfärbt sind. Anschließend schneiden Sie die Nierenblutgefäße, die Harnröhre sowie das umgebende Bindegewebe und Fettgewebe durch. Um die Nieren zu entfernen, schlagen Sie eine kurze Öffnung in die Nierenkapsel und ziehen Sie die Nieren vorsichtig aus der Kapsel heraus.

Dann legen Sie die Nieren in eiskaltes PBS. Bereiten Sie anschließend fünf mal fünf Millimeter und 25 mal 25 Millimeter große Deckgläser vor, die mit poly-L-Lysin beschichtet sind.

Schneiden Sie die Nieren mit einem Rasiermesser entlang der Frontalebene in ein bis zwei Millimeter dicke Schnitte. Legen Sie dann einen der Schnitte unter ein Stereomikroskop. Suchen Sie die Zysten, die als runde Hohlräume erscheinen, mit fein-spitzigen Pinzetten.

Dissezieren Sie die innere epitheliale Schicht einer Zyste so dünn wie möglich, um einen einlagigen Bereich zu erhalten. Danach befestigen Sie sie auf einem mit Polylysin beschichteten Glasstück und positionieren die Zyste mit der apikalen Seite nach oben. Um den Pipetten Zugang für die Elektrophysiologie zu ermöglichen, füllen Sie die Patch-Clamp-Kammer mit Badlösung. Anschließend übertragen Sie das Deckglasstück mit den isolierten Geweben in die Kammer.

Wählen Sie eine Zelle in der epithelialen Monolage aus und nähern Sie sich mit einer Patch-Pipette einer typischen Membran. Führen Sie danach ein konventionelles Patch-Clamp-Experiment im Zell-angehefteten Modus durch. Platzierten Sie in diesem Verfahren die isolierten Zysten und aufgespaltenen Tubuli in einer 3,5 cm großen Petrischale, die PSS enthält, und geben Sie 5 µM Flu, 8 HD und 0,05 % ursodeoxycholsäure hinzu, um die Dispersion der Acetoxymethylester zu unterstützen.

Danach die Probe vor Licht schützen und 30 bis 40 Minuten bei Raumtemperatur auf einem langsamen Schüttler inkubieren. Nach der Inkubation das Inkubationsmedium mit sauberer PSS ausspülen. Anschließend das Gewebe unter ein konfokales Mikroskop legen, um die Fluoreszenzbildgebung weiter durchzuführen.

Schalten Sie die Software für die konfokale Bildaufnahme ein. Schalten Sie anschließend den Argonlaser auf eine Anregung von 488 Nanometern ein und stellen Sie die Emission auf 520 über 25 Nanometer ein. Suchen Sie danach das Gewebe im Hellfeld.

Überwachen Sie die Fluoreszenz von Flu oh acht H in der Gewebeprobe mit einer Frequenz von 0,25 Hertz oder höher. Wenden Sie TP oder andere pharmakologische Modulatoren an, um eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration auszulösen. Dargestellt sind hier repräsentative Stromspuren für die Aktivität des epithelialen Natriumkanals, gemessen in an Zellen angehefteten Patches frisch isolierter Zysten von 16 Wochen alten PCK-Ratten nach der Behandlung mit Benzoyl und Trinkwasser für 12 Wochen.

Gestrichelte Linien zeigen den jeweiligen Zustand an, wobei C und op n die geschlossenen und offenen Zustände bezeichnen. Dieses Diagramm fasst die beobachtete Aktivität des epithelialen Natriumkanals zusammen, bei der Benzoyl, ein selektiver Inhibitor des epithelialen Natriumkanals, die Aktivität des epithelialen Natriumkanals signifikant verringerte. Dieses Video zeigt die mit Fluo-8H beladene zystische Monoschicht vor und nach der Gabe von 10 Mikromolar ATP. Die Zunahme der grünen Fluoreszenzsignalintensität ist sichtbar, wenn die intrazelluläre Kalziumkonzentration als Reaktion auf ATP ansteigt. Dieses Diagramm fasst die Wirkung von ATP auf die Kalziumkonzentration in der Zelle zusammen.

Eine Monolayer von PCK-Ratten zeigt nach Applikation eines TP eine rasche Zunahme des intrazellulären Kalziumspiegels, der innerhalb von zwei oder drei Minuten auf den Ausgangswert zurückkehrt. Diese Technik bietet eine einzigartige Möglichkeit, Veränderungen des Kalziumflusses und der Eisenkanalaktivität in den zystischen Nieren zu überwachen. Neben der Charakterisierung der Aktivität des zellulären Natriumkanals und des Kalziumeinstroms in PCK-Ratten kann dieser Ansatz auch zur Analyse weiterer Eisenkanäle in verschiedenen AR- und ADPKD-Modellen verwendet werden.