Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Betrieb einer speziell angefertigten, laserbasierten Heizvorrichtung zu demonstrieren, die zur lokalen Erwärmung von subkutanen Tumoren für die Abgabe einer wärmeaktivierten Liposomenformulierung verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem die HTLC-Formulierung zunächst durch Lipidfilmbildung, Hydratationsextrusion und Dialyse vorbereitet wird. Im zweiten Schritt wird eine Spendermaus mit Gebärmutterhalskarzinomzellen beimpft.

Nach vier bis fünf Wochen wird der Tumor herausgeschnitten, in Fragmente geschnitten und einzeln in eine Empfängermaus implantiert. Im letzten Schritt wird der Tumor der Empfängermaus mit Hilfe des laserbasierten Heizsystems lokal auf 42 Grad Celsius erhitzt. Das laserbasierte Heizgerät ist MR-kompatibel, was die Überwachung der Änderungen der Gewebetemperatur während der Lichtzufuhr ermöglicht, und ein kleines und tragbares Gerät, das eine einfache und effektive Erwärmung des Tumors in der Bohrung des Kleintieres ermöglicht

. Letztendlich kann die wärmeaktivierte Freisetzung des wärmeempfindlichen HTLC durch Echtzeit-Magnetresonanztomographie überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Verwendung eines Wasserbades und eines Heizkatheters, besteht darin, dass unsere Technik eine konforme Methode bietet, um dem Tumor innerhalb von ein bis zwei Minuten nach Beginn der Wärmebehandlung Wärme zuzuführen, und eine Echtzeitanpassung der Laserleistung ermöglicht, wodurch die Temperaturschwankungen während des Eingriffs minimiert werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir begannen, In-vivo-Studien mit unserer HTLC thermosensitiven Liposomenformulierung durchzuführen.

Wir stellten fest, dass die bestehenden Methoden nicht in der Lage waren, eine lokale Erwärmung eines subkutanen Tumors effizient zu gewährleisten. Die Verfahren zur Herstellung von Liposomen werden von myung, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um die Liposomen vorzubereiten, beginnen Sie mit der Kombination einer frisch zubereiteten Lipidmischung mit einer frisch zubereiteten Lipidmischung, gefolgt von einer einstündigen Hydratation mit Vortexing alle 15 bis 20 Minuten, während die Lipidmischung hydratisiert. Montieren Sie den 10-Milliliter-Extruder mit zwei Stapeln von 200-Nanometer-Polycarbonatfiltern, dem Thermozylinder des Extruders, zu einem zirkulierenden Wasserbad, das auf 70 Grad Celsius eingestellt ist, und schließen Sie das Gerät an einen komprimierten Stickstofftank an.

Unmittelbar nach der Hydratation werden die Lipide in die Extruderkammer übertragen und der Stickstofffluss geöffnet. Dann extrudieren Sie die Liposomen bei einem Druck von 200 PSI durch die Membranen und sammeln die Liposomen in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, das in das 70 Grad Celsius heiße Wasserbad gestellt wird. Nachdem Sie die Liposomen fünfmal extrudiert haben, zerlegen Sie das Gerät und bauen Sie es mit zwei Stapeln von 100-Nanometer-Polycarbonatfiltern wieder zusammen.

Stellen Sie den Druck auf 400 PSI ein und extrudieren Sie die Liposomen 10 Mal, wie gerade gezeigt. Durch das Sammeln der Liposomen aus der Endextrusion in einem konischen 15-Liter-Röhrchen können die Liposomen auf Raumtemperatur abkühlen, gefolgt von der Ausfällung des unlöslichen Cisplatins durch Zentrifugation, dann dialysieren Sie die Liposomen über Nacht gegen 0,9 % Kochsalzlösung in Dialyseschläuchen mit einem Cutoff von 15.000 Molekulargewicht unter sterilen Bedingungen. Um das Xenotransplantat des Gebärmutterhalstumors zu implantieren, entnehmen Sie mir 180 Zellen aus einer 90%igen konfluenten Kultur und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Gebärmutterhalskrebszellen nach Hämo

Das Zytometer verdünnt dann die Zellen auf eins mal 10 bis sechs me 180 Zellen pro 100 Mikroliter. Alle Tierarbeiten wurden im Star Innovation Center durchgeführt, weibliche Sketch-Mäuse durch intramuskuläre Injektion in den Magenmuskel der Hintergliedmaße mit Messschiebern geimpft, die resultierende Tumorgröße gemessen, bis die Tumore neun bis 12 Millimeter in ihrer längsten Dimension erreicht haben. Dann schneiden Sie den Tumor aus der Spendermaus heraus und zerkleinern ihn in zwei bis drei Kubikmillimeter große Fragmente.

Rasieren Sie nun die linke Hintergliedmaße des Empfängertieres und machen Sie einen Schnitt in die nackte Haut. Führen Sie ein Stück des Spendertumors subkutan durch den Schnitt ein und verschließen Sie die Haut drei bis fünf Tage nach der Implantation mit ein bis zwei Wundclips. Entfernen Sie die Klammern und lassen Sie den Tumor zwei bis drei Wochen lang wachsen, um die Wärmebehandlung durchzuführen.

Verbinden Sie zunächst ein Ende einer Laserfaser mit dem Lasergerät und das andere Ende mit der Beleuchtung. Als nächstes führen Sie einen 27-Gauge-Injektionskatheter in die laterale Schwanzvene einer anästhesierten Empfängermaus ein, gefolgt von der Einführung eines 22-Gauge-Katheters in die Mitte des Tumors. Platzieren Sie dann eine faseroptische Temperatursonde in den Hohlkatheter, um eventuelle Temperaturänderungen zu überwachen und den gesamten Tumor mit dem Illuminator abzudecken. Finale.

Stellen Sie die Leistung auf 0,8 bis ein Watt ein, schalten Sie dann den Laser ein und warten Sie, bis die Temperatur manuell ansteigt, indem Sie die Laserleistung während der gesamten Behandlung zwischen 0,1 und 0,8 Watt einstellen, um die Temperatur des Tumors bei 42 Grad Celsius zu halten, wie in diesem Bild eines Querschnitts durch einen wärmebehandelten Tumor dargestellt. Unter der Annahme einer Gesamtleistung von einem Watt beträgt die maximale Fluenzrate an jedem Punkt des Tumors 70 Milliwatt pro Quadratzentimeter, wobei die Fluenzrate im Tumor in der Hauttiefe 50 % der maximalen Fluenzrate misst, wie durch die Protonenresonanzfrequenzverschiebung zur Magnetresonanz-Thermometrie-Heizung bestätigt. Die Verwendung des laserbasierten Heizaufbaus erzeugt eine relativ gleichmäßige Temperaturverteilungskarte, die die relative Temperaturänderung aus einer absoluten Basislinienmessung verfolgt, die vor der Erwärmung durch die Punktquelle aufgenommen wurde. Der erhitzte Tumor zeigt nach Verabreichung von gad HTLC den höchsten relativen Signalanstieg im Vergleich zum unerhitzten Turt-Muskel, der durch Magnetresonanz-Signalanalyse bestimmt wurde, wobei das Signal bis zum Ende der Heizperiode aufrechterhalten wird. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 15 Minuten eingerichtet werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, und stellt ein wertvolles Werkzeug für die präklinische Bewertung von thermosensitiven Liposomenformulierungen dar.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Laser der Klasse vier äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille getroffen werden sollten.