Name: Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Lernen Sie eine laserbasierte Heizmethode für die lokale Tumortherapie mit wärmeempfindlichen Liposomen. Diese Technik ermöglicht die kontrollierte Freisetzung von Cisplatin bei 42 °C unter Echtzeit-MRT-Überwachung.

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Diese Forschung wird durch einen Betriebskostenzuschuss der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) an C.A. und D.A.J. finanziert. Die Autoren danken der Canadian Foundation for Innovation und der Princess Margaret Cancer Foundation für die Finanzierung der STTARR-Forschungseinrichtung, die die Bildgebungs- und Therapieforschungskomponenten dieser Arbeit ermöglicht.

1. Liposomen-Herstellung <ol><li> Löse den Lipiden 1,2-Dipalmitoyl- sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), 1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-Phosphatidylcholin (MSPC oder S-Lyso-PC) und N - (Carbonyl- Methoxypolyethylenglykol 2000) -1,2-Distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamin (mPEG 2000 -DSPE) in Chloroform. Beispielsweise für die Herstellung von 10 ml HTLC abzuwiegen 314,4 mg DPPC, 39,4 mg MSPC und 83,9 mg mPEG 2000 -DSPE in eine Braunglasampulle. Dann lösen sich die Lipide in 2 ml Chloroform und erwärmen das Fläschchen für 30 s in einer 60 ° C warmen Wasserbad. </li><li> Entfernen des Chloroforms am Rotationsverdampfer. Legen Sie die resultierende Lipidfilm unter Hochdruck-Vakuum-O / N. </li><li> 10 ml HTLC, Hydrat der Lipidfilm mit 5 ml 0,1 N Tris-Puffer (pH 7,4) für 1 Std. Zur gleichen Zeit, wiegen 162,4 mg 1,2-Dipalmitoyl--sn-glycero-3-Phosphoglycerin (DPPG) Lipid und 100 mg CDDP Pulver und Hydrat with 5 ml 0,1 N Tris-Puffer, enthaltend 30% Ethanol (pH 7,4) für 1 Stunde. </li><li> Für die Gd-HTLC Formulierung abzuwiegen die gleiche Menge an DPPG Lipid und 10 mg CDDP Pulver, dann Hydrat mit 2,5 ml Gd-HP-DO3A Lösung (279,3 mg / ml) plus 2,5 ml 0,1 N Tris-Puffer, enthaltend 30% Ethanol ( pH 7,4) für 1 Stunde. Während der Hydration sind die Mischungen in Braunglasfläschchen aufbewahrt und auf einer Heizplatte bei 70 ° C unter konstantem Rühren und Vortexen alle 10 Minuten gesetzt werden. </li><li> Kombinieren Sie die Lipidmischung und die Lipid-Wirkstoff-Mischung, wieder Hydrat für 1 Stunde. Vortex alle 15-20 min. </li><li> Montieren Sie die 10-ml-Extruder mit zwei Stapel von 200 nm Polycarbonatfilter. Verbinden den thermobarrel des Extruders zu einem zirkulierenden Wasserbad bei 70 ° C und eine Verbindung dem Extruder in einer komprimierten Stickstofftank. </li><li> Unmittelbar nach der Hydration, übertragen Sie die Mischung in den Extruder Kammer. Öffnen Sie den Stickstoffstrom (set Druck auf 200 psi), um die Liposomen durch die Membranen zu extrudieren. Sammeln Sie die Liposomes in ein 50 ml Röhrchen. Halten des Rohres in ein heißes Wasserbad (70 ° C) zu jeder Zeit während des Extrusionsprozesses. Wiederholen Sie diesen Vorgang 5 mal. </li><li> Demontieren Sie den Extruder und wechseln Sie in zwei Stapel von 100 nm Polycarbonatfilter. Montieren Sie den Extruder und setzen Sie den Druck auf 400 psi. Wiederholen Sie Schritt 5, mit der Ausnahme, extrudieren die Liposomen 10 mal. Die Probe wird aus dem endgültigen Extrusion in einen 15-ml-Tube. </li><li> Cool down der Liposomen auf RT und Zentrifuge bei 1.000 × g für 3 min, um unlösliche CDDP auszufällen. </li><li> Dialysieren der Liposomen O / N gegen 0,9% Salzlösung in Dialyseschläuchen mit einer 15.000 Molekulargewichtsgrenze (MWCO) unter sterilen Bedingungen. </li><li> Verdünnen Sie 10 ul der Liposomen in 990 &amp; mgr; l destilliertem Wasser. Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung, um die Größenverteilung der HTLC und Gd-HTLC messen. Führen Sie 3 Messungen mit je 10 Läufe. </li><li> Verdünnen von 40 ul der Liposomen in 3.960 &amp; mgr; l destilliertes Wasser. Machen 5-6 Standardlösungen von Platin und Gadoliniumim Konzentrationsbereich von 0,1 bis 20 &amp; mgr; g / ml. Messung der Platin und Gadoliniumkonzentrationen mit induktiv gekoppelten Plasma-Atomemissionsspektrometer (ICP-AES) bei 3 verschiedenen Wellenlängen. Führen Sie 3 Messungen bei jeder Wellenlänge für durchschnittliches Ergebnis. </li><li> Bestimmen das Gel flüssigkristallinen Phasenübergangstemperatur (T m) der HTLC Liposomenformulierung unter Verwendung eines Differential-Scanning-Kalorimeter (DSC). Last 5-10 mg HTLC in eine DSC-Wanne und eine leere Pfanne als Referenz. Verwenden einer Scanrate von 5 ° C / min von 0 ° C Rampe bis die Temperatur auf 60 ° C. </li><li> Wickeln Sie die Liposomen in Alufolie, um Belichtung und bei 4 ° C zu vermeiden. </li></ol> 2. in vitro-Freisetzung von Liposomen <ol><li> Bereiten Spinsäulen. <ol><li> Inkubieren Sie 50 g Gelfiltration Perlen in 400 ml 0,9% Kochsalzlösung bei Raumtemperatur für 3-4 Stunden. Roll up ein Stück Glaswolle, nass mit 0,9% Salzlösung und legen Sie sie in die Spitze einer 1 ml Spritze. Drücken Sie die Glaswolle auf etwa 0,05 bis 0,1 ml der Spritze zu füllen. Verwenden Sie eine Glaspipette auf etwa 1 ml Gelfiltrationsmedien in die Spritze nach und nach hinzufügen. </li><li> Legen Sie die Spritze in einen 15-ml-Tube und zentrifugieren bei 1.000 × g für 3 min. Entfernen Sie die Spin-Säule und legen Sie sie in einen 15-ml-Tube. </li></ol></li><li> Probe 400 ul HTLC oder Gd-HTLC in 8 1-Dram-Glasfläschchen und Inkubieren in einem temperaturkontrollierten Wasserbad bei entweder 37 ° C oder 42 ° C. Nehmen Sie ein Fläschchen zu jedem Zeitpunkt (dh, 5, 15, 30 und 60 min) und sofort legen Sie es auf Eis. </li><li> 100 l 0,9% Kochsalzlösung in den vorbereiteten Spin-Säule, dann wurden 100 ul HTLC oder Gd-HTLC hinzuzufügen vor der Inkubation (Kontrolle) oder nach Inkubation im Wasserbad in die Spin-Säule. Zentrifuge bei 1000 × g für 3 min. Entfernen der Spritze aus der Röhre und verdünnt die Lösung in dem Rohr für ICP-AES-Analyse. </li></ol> 3. Die Implantation von subkutanen Xenotransplantat von GebärmutterhalskrebsTumor <ol><li> Alle tierexperimentellen Studien wurden nach Tiernutzung Protokolle von der Animal Care Committee der University Health Network (UHN) genehmigt durchgeführt. </li><li> Führen Sie alle tierexperimentellen Studien in einer Sicherheitswerkbank (BSC). Autoklaven alle chirurgische Instrumente vor jeder Operation. Nach jeder Operation, wischen Sie die chirurgische Werkzeuge mit 70% Ethanol und sterilisieren wieder unter Verwendung eines heißen Perle Sterilisator. </li><li> Um Sterbehilfe, legen Sie das Tier in einem isolierten CO 2 Kammer, führen Genickbruch. </li><li> Für eine Vollnarkose mit 100% Sauerstoff, verwenden Sie 5% Isofluran für die Induktion und 2% für die Wartung. Um die Tiefe der Anästhesie zu gewährleisten, wenden Sie Druck mit einer Pinzette nach Palmar Oberfläche der Fußsohle zu Tier Reaktion zu beobachten. Bewerben Augen Schmierstoff bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Für ein Tier, das Operation unterzogen hat, legen Sie das Tier in einem sauberen Käfig ohne die Gesellschaft von anderen Tieren. Überwachen, bis genügend Bewusstsein wiedererlangt. </li><li> KulturDie ME-180-Zellen in Alpha-Minimalmedium (α-MEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika ergänzt. </li><li> Ernten Sie die Zellen und die Zellen in komplettem Medium zu halten vor der Impfung. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Zu impfen jedes Spender Maus, um eine intramuskuläre (im) ME-180 (humanes Zervixkarzinom-Zellen) Tumor zu tragen. Hinweis: Das Wachstum in der im Ort ist, um die Entwicklung von Tumoren gut vaskularisiert sicherzustellen ausgewählt. Kauf weiblichen SCID-Mäusen (im Alter von 6-8 Wochen, ca. 20 g) von einer Inhouse-Zuchtanlage. <ol><li> Anesthetize einen weiblichen SCID-Maus und spritzen 1 x 10 6 ME-180-Zellen in den Gastrocnemius-Muskel der Hintergliedmaße mit einer 27 G-Nadel. </li><li> Messen der Tumorgröße mit einem Bremssattel, bis die Tumoren 9-12 mm in ihrer längsten Dimension erreicht. Beenden Sie die Studie, wenn der Tumor 12 mm überschritten hat, oder wenn die Tumormasse beeinträchtigt normales Verhalten, Gehfähigkeit, Futter- und Wasseraufnahme. </li></ol></li><li> Implant Tumorstücke aus Spendermäusen in Empfängermäuse. <ol><li> Anesthetize eine Spendermaus mit 5% Isofluran. Euthanize die Maus mit Genickbruch unter Narkose. Entfernen Sie das Geber Tumor aus der Spendermaus. Schneiden Sie den Tumor in Kubik Fragmente von 2-3 mm 3. </li><li> Anesthetize eine Empfängermaus mit 5% Isofluran. Injizieren 100 ul 0,5 mg / ml Meloxicam subkutan vor der Operation. Bewerben Jod chirurgischen Scheuerlösung, dann 70% Ethanol und schließlich Jodlösung auf die rasierte Haut. Rasieren Sie die linke Hinterbein des Empfängers Maus. Einen Einschnitt auf der Ebene der Haut. Stecken Sie ein Spendertumorstück subkutan durch den Einschnitt. Schließen Sie den Schnitt mit 1-2 Wundklammer (n). </li><li> Entfernen Sie die Clips von 3-5 Tagen nach der Implantation. Subkutanen Tumor ist für die Verwendung der laserbasierten Heizungs Einrichtung erforderlich. </li><li> Erlauben Tumoren, für 2-3 Wochen Wärmebehandlung wachsen. </li></ol></li></ol> 4. Entwurf, AssemBly und Kalibrierung eines Conformal Laser Liefer Illuminator für In-vivo-Heizung <ol><li> Gewebeerwärmung zu erreichen unter Verwendung eines 763 nm-Diodenlaser, um eine konforme Illuminator Verwendung einer optischen Faser gekoppelt ist. <ol><li> Der Illuminator bietet einheitliche oberflächliche Laserbeleuchtung des Tumors Xenograft. Es besteht aus einem 30 x 20 x 17 mm-Block aus hoch reflektierendem Material, das drei beige- fügtem Lichtintegrationskammer Kugeln mit einer Kammer in der Mitte (16 mm Durchmesser) und 2 kleine Kammern auf beiden Seiten (16 mm Länge und 5 mm besteht im Durchmesser) (Abbildung 1). </li><li> Damit Licht, um von einer Kammer in die andere übergeben wurden zwei kleine Löcher mit einem Durchmesser von 5 mm zwischen den kleinen äußeren Kammern und dem größeren mittleren Kammer geschnitten. Licht von dem Laser in die äußeren Kammern mit einem 400 &amp; mgr; m Schnittende Faser zu dem Laser, der in die Kammer durch ein 600 &amp; mgr; m Durchmesser Loch geführt angeschlossen geliefert. </li><li> Aufgrund der Natur des Lichtes interaction mit den Kammerwänden ist das Licht in einer der kleinen Kammern geliefert räumlich homogenisiert dann durch die Innenöffnungen in der größeren Kammer, wo es weiter räumlich homogenisiert. Licht tritt dann aus dem Durchmesser von 10 mm-Anschluss an der mittleren Kammer. </li></ol></li><li> Kalibrieren Sie das Hilfslicht Lieferung in Bezug auf die Laserleistungseinstellung mit einem NIST kalibriert 50 mm Ulbrichtkugel, um die abgegebene Leistung zu messen. <ol><li> Berechnen Sie die Lichtverteilung im Tumor mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen auf Basis einer vereinfachten Geometrie des Tumors. Generieren Sie die Monte-Carlo-Code in einem benutzerdefinierten Algorithmus mit einem kommerziellen Computersoftwarepaket und Basis auf dem Standard-Code des Monte-Carlo-Modellierung von Lichttransport in mehrschichtigen Geweben von Jacques et al. 14 geschrieben. </li><li> Modell der Tumor als eine Halbkugel, die auf einem flachen Hautlinie mit einem Durchmesser entsprechend der durchschnittlichen Tumor Dimension 7 mm an der Hautoberfläche und eine eright von 5 mm. Modell homogenen Beleuchtung der Oberfläche durch zufälliges Starten Photonen ganzen exponierten Hemisphäre und direkt im Zentrum der Kugel. </li><li> Verwenden optischer Eigenschaften, einschließlich Absorption, &amp; mgr; a = 0,025 mm -1, Streuen, = μ s 10 mm -1, Anisotropiefaktor g = 0,9 und der Brechungsindex n = 1,4. Verwenden einer Million Photonen in der Berechnung. </li><li> Führen Sie diese Messungen vor allen in vivo Experimenten Heizung ohne weitere Änderungen, die nach anfänglichen Kalibrierung. </li></ol></li></ol> 5. Conformal Heizung der Tumor mit Maßgeschneiderte Laserkammer-Setup <ol><li> Verbinden eines Endes eines Laserfaser an den Laser-Gerät und dem anderen Ende an dem Illuminator. </li><li> Betäuben das Tier unter Verwendung von 5% Isofluran. Legen Sie eine 27 G Injektionskatheter in die laterale Schwanzvene der Maus. Legen Sie eine 22 G-Katheter in das Zentrum des Tumors. Legen Sie einen faseroptischen Temperatur probe in den hohlen Katheter auf eine Temperaturänderung zu überwachen. </li><li> Decken die gesamte Tumor mit der Beleuchtungseinrichtung (Abbildung 2). Stellen Sie zuerst die Macht, 0,8-1 W. Schalten Sie den Laser und warten Sie, die Temperatur zu steigen. Pflegen Sie die Temperatur des Tumors bei 42 ° C von der manuellen Einstellung der Laserleistung zwischen 0,1 bis 0,8 W. </li></ol> 6. Temperaturverteilung ausgewertet Durch MR-Temperaturmessung (MRT) <ol><li> Messen der Temperaturverteilung der beheizten Tumor mit der lasergestützten Erwärmung Konfiguration durch Protonenresonanz-Frequenzverschiebung (PRF-Verschiebung) MRT auf einem 7-Tesla-MR-Bildgebungssystem präklinischen 15 in Verbindung mit der faseroptischen Temperaturfühler Messungen. </li><li> Erwerben Thermometrie Bilder in 10 Sekunden-Intervallen mit Hilfe eines 2D-FLASH-Impulsfolge (Echozeit 4,5 ms, Wiederholungszeit 156,25 ms) mit 312 x 312 &amp; mgr; m in-plane-Auflösung und 2 mm Schichtdicke in einer einzigen Scheibe auf der Ebene der Faseroptik TemperaturprofilSein. </li></ol> 7. MR Überwachung der Wirkstofffreisetzung <ol><li> Führen T 1 -gewichteten Bildgebung vor und 20 Minuten nach der Verabreichung von Gd-HTLC. </li><li> Implantat zwei Tumoren, eine auf jeder der Hinterbeine eines weiblichen SCID-Maus unter Verwendung der oben in Abschnitt 3 zur Implantation beschriebenen Verfahrens. Vorwärmen der Tumor am linken hinteren Gliedmaßen für 5 min bei 42 ° C vor der Injektion von Gd-HTLC mit einer Dosis von 66,3 mg / kg Gd-HP-DO3A und 1,4 mg / kg CDDP, dann Hitze des Tumors für weitere 20 min nach der Injektion. Führen Einspritzung während Wärmebehandlung. Verwenden Sie den Tumor am rechten Hinterbein nach einem unbeheizten Kontrolle. </li><li> Erwerben dynamischen MR-Bilder (36 x 20 mm Feld-of-view, 200 x 200 um Auflösung in der Ebene, 2 mm Schichtdicke; MR-Sequenz-Protokoll), um Gd-HP-DO3A Release bei 12 Sekunden-Intervallen für den gesamten 20 Minuten überwachen nach der Verabreichung von Gd-HTLC, beginnend 30 Sekunden vor der Injektion. </li><li> Kontur des Tumors (beheizt und unbeheizt) und Muskelvolumen.Berechnen Sie die mittlere MR-Signal aller Voxel in jedem konturierte Volumen. </li></ol>

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</ol>

Es gibt keine Offenlegungen.

Liposomen wurden in den 1960er Jahren als Arzneimittelabgabevehikel, die hydrophilen Arzneimitteln in ihrem inneren wässrigen Volumen und hydrophobe Arzneimittel in ihrer Lipiddoppelschicht 2 tragen entwickelt. Zusätzlich zu in therapeutischen Anwendungen zu verwenden, wurden Liposomen zur diagnostischen Anwendungen untersucht worden, wenn sie mit Radionukliden markiert oder mit Bildgebungskontrastmittel 17 geladen. In den letzten Jahren theranostics und therapeutischen Diagnosepaaren verfolgt word...

Die Pathophysiologie von soliden Tumoren ergibt die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) von nanoskaligen Systemen. Dies hat zu der Entwicklung von vielen Arzneistoffabgabesysteme, die die Vorteile dieses Effektes, das Tumorgewebe gezielt unter Minimierung systemischen Nebenwirkungen 1 geführt. Liposomalen Verabreichungstechnologien wurden weitgehend für Arzneimittel oder bildgebende Sonden 2 untersucht. Obwohl Liposomen deutlich gegenüber einer herkömmlichen Chemotherapie reduziert die systemische Toxizität, gab es einige Verbesserungen der klinischen Wirksamkeit 3,4. Studien haben gezeigt, dass die begrenzte Wirksamkeit aufgrund des Fehlens der Arzneimittelfreisetzung aus dem Träger 4,5 ist. Als Ergebnis wurde die Entwicklung von Liposomen, die aktiviert werden, um das eingekapselte Arzneimittel in Reaktion auf äußere Reize frei beträchtliche Aufmerksamkeit erregt. Hyperthermie ist seit Jahrzehnten als eine relativ sichere Behandlungsmethode für Krebspatienten, 6 eingesetzt. Deshalb ist die Entwicklunglung von wärmeempfindlichem Liposomen mit Wärme als ein externes Trigger hat eine logische Kombination mit beträchtlicher Bedeutung für die klinische Übersetzung. Tatsächlich hat die Lysolipid enthaltenden thermo Liposomformulierung Doxorubicin, wie LTSL-DOX war, nun erreichte klinische Bewertung 7. Neuere klinische Daten mit LTSL-DOX hat gezeigt, dass das Protokoll für die Wärmeabgabe ist ein kritischer Faktor, die Behandlungsergebnisse 8 stark beeinflussen können. Beim Menschen sind Radiofrequenz, Mikrowelle, Laser- und Ultraschallwandler verwendet, um Hyperthermie lokal an Tumorstellen 9 anzuwenden. In präklinischen Studien Erwärmung der subkutanen Tumoren erforderlich sind Heizung Kathetern 10,11 und Wasserbäder 12,13 am häufigsten eingesetzt wird. In diesem Manuskript, führen wir eine neue Methode zum Erwärmen subkutane Tumoren unter Verwendung eines kundenspezifischen Laser-basierten Setup-Heizung, die mehr konforme Erwärmung des Tumorvolumens ermöglicht. Verwenden von MR-kompatible mastoffe, ist die Einrichtung klein genug, um innerhalb der Bohrung eines kleinen Tieres MR Imager passt, um sich in Echtzeit-Überwachung von Veränderungen in der Gewebetemperatur während der Lasererhitzung. Das MR-Kontrastmittels, Gadoteridol (Gd-HP-DO3A), wurde mit CDDP zusammen verkapselt sind, in einer wärmeempfindlichen Liposomformulierung CDDP (HTLC) wie Gd-HTLC bekannt, Echtzeit-MR bildgeführte Überwachung und Bewertung der Wärme -aktivierten Wirkstofffreisetzung und Validierung der Heizungs Protokoll. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das laserbasierte Heizvorrichtung effizient aktiviert die Freisetzung von eingekapselten Mitteln aus dem Gd-HTLC Formulierung, während sie durch MR-Bildgebung überwacht.

<table><tbody><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG</td><td>Laborota 4000</td><td></td></tr><tr><td>Hochdruckextruder</td><td>Northern Lipids Inc.</td><td>T.001</td><td>10 ml Thermofass</td></tr><tr><td>Heizthermostat</td><td>VWR International LLC.</td><td>11305</td><td>Verbunden mit Extruder</td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membranfilter</td><td>Whatman</td><td>110605; </td><td></td>110606</tr><tr><td>Dynamisches Differenzkalorimeter (DSC)</td><td>TA Instruments</td><td>Q100</td><td></td></tr><tr><td>Atomemissionsspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES)</td><td>PerkinElmer</td><td>Optima 7300DV</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Instruments Ltd.</td><td>Nano-ZS</td><td></td></tr><tr><td>Zell-Inkubator</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-5800</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Wundclip-Clip-Applizator</td><td>Becton Dickinson</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip-Wundclip-Entferner</td><td>Becton Dickinson</td><td>427637</td><td></td></tr><tr><td>Wundclips</td><td>Becton Dickinson</td><td>427631</td><td>9 mm</td></tr><tr><td>763 nm Lasergerät</td><td>Biolitec</td><td>Ceralas CD 403 Laser</td><td></td></tr><tr><td>Lasersonde</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>FT400EMT</td><td>Mit SMA und flachen Spaltsteckern</td></tr><tr><td>Spectralon (Beleuchtung)</td><td>Labsphere Inc.</td><td>FAST-SL-5CMX5CM</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>CSTM-SL-5CMX5CM</td><td></td></tr><tr><td>7 Tesla prälinisches Magnetresonanztomograph (MR) Bildgebungssystem</td><td>Bruker Corporation</td><td>Biospec 70/30</td><td></td></tr><tr><td>Faseroptischer Temperatursensor</td><td>LumaSense Technologies Inc.</td><td>Luxtron FOT Lab Kit</td><td></td></tr><tr><td>Ulbrichtsche Kugel</td><td>Newport Corporation</td><td>819C</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>Newport Corporation</td><td>1830-R</td><td></td></tr></tbody></table>

kundenspezifische laser-basierte heizvorrichtung zum ausgelöste freisetzung von cisplatin von wärmeempfindlichen liposomen mit magnet-resonanz-bild anleitung

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomen als Arzneimittelabgabesysteme eingesetzt worden, um feste Tumore durch Ausbeutung der erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Wirkung was zu erheblichen Verringerungen der systemische Toxizität zu zielen. Dennoch hat unzureichende Freisetzung von verkapselten Arzneimittels aus Liposomen ihre klinische Wirksamkeit begrenzt. Temperaturempfindliche Liposome wurden entwickelt, um ortsspezifische Freisetzung des Arzneimittels, um das Problem der begrenzten Tumor-Medikament Bioverfügbarkeit zu überwinden. Unser Labor hat entworfen und entwickelt eine wärmeaktivierte wärmeempfindliche Liposomenformulierung von Cisplatin (CDDP), wie HTLC bekannt, um ausgelöste Freisetzung von CDDP bei soliden Tumoren bereitzustellen. Wärmeaktivierte Lieferung in vivo wurde in Mausmodellen mit einem speziell angefertigten laserbasierten Heizvorrichtung, die eine konforme Heizmuster bietet am Ort des Tumors, wie durch MR-Thermometrie (MRT) bestätigt erzielt. Eine faseroptische Temperaturüberwachungseinrichtung verwendet, um die Temperatur in Echtzeit zu messen,während der gesamten Heizperiode mit Online-Anpassung der Wärmeabgabe durch den Wechsel der Laserleistung. Arzneimittelabgabe wurde unter Magnetresonanz (MR) Bildführung durch Co-Einkapselung eines MR-Kontrastmittels (dh Gadoteridol) zusammen mit CDDP in die wärmeempfindlichen Liposomen als Mittel, um die Hitzeprotokoll zu validieren und Tumorakkumulation beurteilen optimiert. Das Erhitzen Protokoll bestand aus einer Vorwärmzeit von 5 min vor der Verabreichung des HTLC und 20 Minuten Erhitzen nach der Injektion. Diese Erwärmung Protokoll ergab eine wirksame Freisetzung der eingekapselten Wirkstoffe mit dem höchsten im Vergleich zum unbeheizten Tumor und Muskel im beheizten Tumors beobachtet MR Signaländerung. Diese Studie zeigte die erfolgreiche Anwendung des laserbasierten Heizvorrichtung für die präklinische Entwicklung wärmeempfindliches Liposom und die Bedeutung der MR-gesteuerte Validierung des Heizprotokoll zur Optimierung der Arzneimittelabgabe.

Die HTLC Liposomen werden unter Verwendung üblicher Verfahren, einschließlich Lipidfilmbildung, Hydratation, Extrusion und Dialyse hergestellt. Während der Schritte mit CDDP ist Vorsicht geboten, nicht eingenommen werden, um CDDP zu jedem Aluminium-Material freizulegen, wie CDDP wird durch die Bildung eines schwarzen Niederschlag deaktiviert werden. Eine Abbildung der HTLC ist in Abbildung 3 dargestellt. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der HTLC wurden in einer Handschrift vor kurzem veröff...

Ein MRI-kompatiblen maßgeschneiderten Laserbasis Heizvorrichtung wurde entwickelt, um eine lokale Erwärmung der subkutanen Tumoren um die Freisetzung von Wirkstoffen aus wärmeempfindlichen Liposomen gezielt an der Tumorregion aktivieren bereitzustellen.

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Betrieb einer speziell angefertigten, laserbasierten Heizeinrichtung zu demonstrieren, die zur lokalen Erwärmung subkutaner Tumore für die Applikation einer wärmeaktivierten Liposomenformulierung verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die HTLC-Formulierung durch Bildung eines Lipidfilms, Hydratationsextrusion und Dialyse hergestellt wird. Im zweiten Schritt wird eine Spendermaus mit Zervixkarzinomzellen inokuliert.Nach vier bis fünf Wochen wird der Tumor herausgeschnitten, in Fragmente zerteilt und einzeln in ein empfängnisfähiges Mausmodell implantiert. Im letzten Schritt wird der Tumor der Empfängertiere lokal mit dem laserbasierten Erhitzungssystem auf 42 Grad Celsius erwärmt. Die laserbasierte Heizeinrichtung ist MR-kompatibel, was die Überwachung der Temperaturveränderungen im Gewebe während der Lichtabgabe ermöglicht, und ist zudem klein und tragbar, sodass eine einfache und effektive Erwärmung des Tumors im Inneren des MRT-Geräts für Kleintiere erfolgen kann.Schließlich kann die durch Wärme ausgelöste Freisetzung des thermosensitiven HTLC mittels Echtzeit-Magnetresonanztomographie überwacht werden. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Verwendung eines Wasserbades und eines Heizkatheters, bestehen darin, dass unsere Methode eine konforme Wärmeeinbringung in den Tumor ermöglicht, die bereits innerhalb von einer bis zwei Minuten nach Beginn der Wärmetherapie wirksam wird, und zudem eine Echtzeit-Anpassung der Laserleistung erlaubt, wodurch Temperaturschwankungen während des Eingriffs minimiert werden. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir begannen, In-vivo-Studien mit unserer thermosensitiven Liposomenformulierung HTLC durchzuführen.Wir stellten fest, dass die bestehenden Methoden nicht in der Lage waren, eine effiziente lokale Erwärmung eines subkutanen Tumors bereitzustellen. Die Herstellungsverfahren für Liposomen werden von Myung, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um die Liposomen herzustellen, beginnen Sie damit, eine frisch zubereitete Lipidmischung mit einer frisch zubereiteten Lipid-Wirkstoff-Mischung zu kombinieren, gefolgt von einer einstündigen Hydratation, wobei alle 15 bis 20 Minuten verwirbelt wird, während die Lipidmischung hydratiert. Bauen Sie den 10-Milliliter-Extruder mit zwei Stapeln aus 200-Nanometer-Polycarbonatfiltern zusammen, stellen Sie den Thermo-Zylinder des Extruders auf ein zirkulierendes Wasserbad, das auf 70 Grad Celsius eingestellt ist, und verbinden Sie das Gerät mit einem Druckstickstofftank.Unmittelbar nach der Hydratation überführen Sie die Lipide in die Extrusionskammer und öffnen den Stickstofffluss. Anschließend extrudieren Sie die Liposomen bei einem Druck von 200 PSI durch die Membranen und sammeln sie in einem 50-Milliliter-Konischkolben, der in ein 70 °C heißes Wasserbad gestellt ist. Nachdem die Liposomen fünfmal extrudiert wurden, zerlegen Sie das Gerät und setzen es mit zwei Stapeln aus 100-Nanometer-Polycarbonatfiltern wieder zusammen.Stellen Sie den Druck auf 400 PSI ein und extrudieren Sie die Liposomen zehnmal, wie gerade gezeigt. Das Sammeln der Liposomen nach der letzten Extrusion in einem 15-Milliliter-Konizialrohr ermöglicht es, dass die Liposomen auf Raumtemperatur abkühlen, gefolgt von der Ausfällung des unlöslichen Cisplatin durch Zentrifugation. Anschließend dialysieren Sie die Liposomen über Nacht gegen 0,9 % Salzlösung in Dialysefolie mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 15.000 unter sterilen Bedingungen. Um das zervikale Tumor-Xenotransplantat zu implantieren, entnehmen Sie 180 Zellen aus einer 90 % konfluenten Kultur und zählen die Anzahl der vitalen Zervixkarzinomzellen mittels Hämolyse.Zytometer, dann verdünnen Sie die Zellen auf eine Million Zellen pro 100 Mikroliter. Alle Tierversuche wurden im Star Innovation Center durchgeführt; impfen Sie weibliche SKIT-Mäuse durch intramuskuläre Injektion in den Gastrocnemius-Muskel der Hintergliedmaße unter Verwendung eines Messschiebers. Messen Sie die resultierende Tumorgröße, bis die Tumoren neun bis zwölf Millimeter in ihrer längsten Ausdehnung erreicht haben. Entfernen Sie dann den Tumor von der Spendermaus und zerkleinern Sie ihn in zwei bis drei Kubikmillimeter große Fragmente.Rasieren Sie nun das linke Hinterbein des Empfängertiers und führen Sie einen Schnitt in die nackte Haut ein. Führen Sie ein Stück des Spender-Tumors subkutan durch den Schnitt ein und verschließen Sie die Haut drei bis fünf Tage nach der Implantation mit ein bis zwei Wundclips. Entfernen Sie die Clips und lassen Sie den Tumor zwei bis drei Wochen lang wachsen, um die Wärmebehandlung durchzuführen.Verbinden Sie zunächst ein Ende einer Laserfaser mit dem Lasergerät und das andere Ende mit dem Beleuchter. Danach führen Sie eine Injektionskatheter der Größe 27 Gauge in die seitliche Schwanzvene einer anesthetisierten Empfängermaus ein, gefolgt vom Einbringen eines 22-Gauge-Katheters in das Tumorzentrum. Anschließend platzieren Sie eine faseroptische Temperatursonde in den hohlen Katheter, um eventuelle Temperaturänderungen zu überwachen, und bedecken den gesamten Tumor mit dem Beleuchter. Abschließend.Stellen Sie die Leistung auf 0,8 bis ein Watt ein, schalten Sie dann den Laser ein und warten Sie, bis die Temperatur ansteigt. Passen Sie die Laserleistung während der Behandlung manuell zwischen 0,1 und 0,8 Watt an, um die Temperatur des Tumors bei 42 Grad Celsius zu halten, wie in dieser Abbildung eines Querschnitts durch einen thermisch behandelten Tumor veranschaulicht. Bei einer Gesamtleistung von einem Watt beträgt die maximale Fluenzrate an jeder Stelle im Tumor 70 Milliwatt pro Quadratzentimeter, wobei die Fluenzrate im Tumor in der Hauttiefe 50 % der maximalen Fluenzrate erreicht, wie durch die Protonen-Resonanzfrequenzverschiebung bei der magnetischen Resonanz-Thermometrie bestätigt wurde. Mit der laserbasierten Heizanordnung wird eine relativ gleichmäßige Temperaturverteilung erzeugt, die in der Abbildung dargestellt ist und die relative Temperaturänderung gegenüber einer absoluten Basislinienmessung zeigt, die vor der Erwärmung durch die Punktquelle aufgezeichnet wurde. Der beheizte Tumor zeigt nach Gabe von gad HTLC im Vergleich zum unbeheizten Turt-Muskel den stärksten relativen Signalanstieg, wie durch die Analyse des magnetischen Resonanzsignals bestimmt wurde, wobei das Signal bis zum Ende der Heizphase erhalten bleibt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als 15 Minuten eingerichtet werden und stellt somit ein wertvolles Werkzeug für die präklinische Bewertung thermoempfindlicher Liposomenformulierungen dar.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Laser der Klasse vier äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzbrillen getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Beginnen Sie mit einem anästhesierten menschlichen Patienten mit freiliegendem Schädel. Bei dem Patienten wird ein intrakranieller Tumor diagnostiziert.Bohren Sie in den freiliegenden Schädel, um ein Loch zu schaffen und einen Zugangspunkt zu generieren.Führen Sie unter stereotaktischer Anleitung eine laserdiffundierende Faser oder LDF entlang des vorgegebenen Pfads ein und befestigen Sie sie.Übertragen Sie den Patienten auf einen MRT-Scanner und schließen Sie das LDF an eine Laserquelle...

Interstitielle Laser-Wärmetherapie zur intrakraniellen Tumorablation bei einem menschlichen Patienten

Wir entwickelten neuartigen multifunktionalen Eigen nanovesicles porphysomes genannt, die strukturabhängigen Fluoreszenz Selbstlöschung und einzigartigen photothermischen Eigenschaften haben, so als potente photothermische Therapie Mittel. Wir formuliert porphysomes mit Hochdruckextrusion und untersucht ihre photothermische Therapie Wirksamkeit in einem Xenotransplantat-Tumor-Modell.

Eine Minute, Sub-One-Watt-Photothermische Tumor Ablation mit Porphysomes, Eigen Multifunktionale Nanovesicles

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Herstellungsmethode für Gold-Nanopartikel integriert fotoempfindlichen Liposome mit den im Handel erhältlichen Materialien. Es zeigt auch, wie die Mikrobläschen Kavitationsprozess der synthetisierten Liposomen bei der Behandlung von gepulsten Laser zu messen.

Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Das Protokoll stellt die optimierten Parameter für die Herstellung thermoempfindlicher Liposomen mit dem gestaffelten Fischgrät-Mikrofluidikgerät vor. Dies ermöglicht auch die Kokapselung von Doxorubicin und Indocyaningrün in die Liposomen und die photothermal ausgelöste Freisetzung von Doxorubicin zur kontrollierten/ausgelösten Wirkstofffreisetzung.

Mikrofluidische Produktion von Lysolipid-haltigen temperaturempfindlichen Liposomen

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Eisenoxid-Nanopartikel-Mikroblasen (NSMs) durch Selbstorganisation, synergisierende magnetische, akustische und optische Reaktionsfähigkeit in einer nanotherapeutischen Plattform für magnetische Hyperthermie und photothermische Kombinationskrebstherapie vorgestellt.

Magnetische, akustische und optische dreifach ansprechende Mikroblasen für magnetische Hyperthermie und pothotothermische Kombinationskrebstherapie

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für die genaue Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie unter Verwendung eines ausgeklügelten Verabreichungs- und Überwachungssystems erforderlich sind.

In-vitro- und In-vivo-Verabreichung von magnetischer Nanopartikel-Hyperthermie mit einem maßgeschneiderten Verabreichungssystem

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kontrollierte Hyperthermie, die durch magnetresonanzgesteuerten, hochintensiven fokussierten Ultraschall erzeugt wird, zu verwenden, um die Wirkstofffreisetzung von temperaturempfindlichen Liposomen in einem Rhabdomyosarkom-Mausmodell auszulösen.

Magnetresonanzgesteuerte, hochintensive, fokussierte, ultraschallerzeugte Hyperthermie: eine praktikable Behandlungsmethode in einem murinen Rhabdomyosarkommodell

Die thermoplasmonische Punktionsmethode integriert konfokale Mikroskopie, optische Pinzetten und Goldnanopartikel, um Proteinantworten während der Reparatur von Plasmamembranen in Zellen und riesigen unilamellären Vesikeln zu untersuchen. Die Technik ermöglicht eine schnelle und lokalisierte Membranpunktion und ermöglicht die Identifizierung von Schlüsselproteinen und ihrer funktionellen Rolle in der komplizierten Plasmamembran-Reparaturmaschinerie.

Ein thermoplasmonischer Ansatz zur Untersuchung der Reparatur von Plasmamembranen in lebenden Zellen und Modellmembranen

Das Glioblastom ist eine verheerende Form des primären Hirntumors, und die interstitielle Laser-Wärmetherapie entwickelt sich zu einer vielversprechenden Alternative zur konventionellen chirurgischen Resektion bei inoperablen Glioblastomen. Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes präklinisches Mausmodell, das zur Untersuchung von Behandlungseffekten oder adjuvanten und kombinatorischen Behandlungen verwendet werden kann.

Ein immunkompetentes Mausmodell für die interstitielle Laser-Wärmetherapie des Glioblastoms

Dieses Protokoll stellt Techniken und Methoden vor, die für eine gezielte hyperthermische Therapie in soliden Tumormodellen erforderlich sind. Der Ansatz nutzt die photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumoral injizierte Goldnanostäbchen, um eine lokale Erwärmung innerhalb der Tumormikroumgebung zu induzieren.

Induktion gezielter milder Hyperthermie in murinen Tumormodellen durch photothermische Umwandlung von Nahinfrarotlicht durch intratumorale Gold-Nanostäbchen

Lernen Sie eine laserbasierte Heizmethode für die lokale Tumortherapie mit wärmeempfindlichen Liposomen. Diese Technik ermöglicht die kontrollierte Freisetzung von Cisplatin bei 42 °C unter Echtzeit-MRT-Überwachung.

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung (Video) | JoVE Journal

Kundenspezifische Laser-basierte Heizvorrichtung zum ausgelöste Freisetzung von Cisplatin von wärmeempfindlichen Liposomen mit Magnet-Resonanz-Bild Anleitung

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