Mess TCR-pMHC Binding

In diesem Video zeigen wir, wie man die Kinetik zwischen dem T-Zell-Antigenrezeptor und dem mit Peptiden beladenen major histocompatibility complex (PMHC) in C zwei innerhalb des immunologischen Synapses zwischen einer T-Zelle und einer planaren, unterstützten Lipiddoppelschicht misst. Wir führen Sie kurz durch wichtige Aspekte der Proteinproduktion und überprüfen die funktionelle Integrität der Lipiddoppelschicht mittels Kalzium-Flux-Messungen. Für detailliertere Informationen zur Herstellung der Lipiddoppelschicht und zum Aufbau eines Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskops verweisen wir auf unseren parallelen Beitrag im Journal of Visualized Experiments. Anschließend erläutern wir ausführlich, wie man Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen durchführt und analysiert.

Um die Kinetik der synaptischen Bindung des T-Zell-Rezeptors an das PMHC abzuleiten und unsere auf FRET basierende Strategie innerhalb unseres Gesamtansatzes zu erklären, beginnen wir mit der Kristallstruktur des T-Zell-Rezeptors oder TCR, hier in Blau dargestellt, während er sein Antigen, das peptidbeladene MHC-Molekül oder PMHC, in Gelb und Rot dargestellt, bindet. Wir führen außerdem ein einzelnes Kettenfragment der variablen Domänen aus einem T-Zell-Rezeptor-Beta-reaktiven Antikörper namens age 57 ein. Für quantitative, auf FRET basierende Messungen ist es zwingend erforderlich, sowohl den FRET-Donor, in unserem Fall das einzelne Kettenfragment, als auch den FRET-Akzeptor, das PMHC, ortsspezifisch zu markieren.

Dies ist bei rekombinanten Proteinen durch die Einführung einer nicht gepaarten Cystein-Gruppe möglich, die anschließend kovalent an miteinander konjugierte Fluorophore gebunden werden kann. Wie gezeigt, verknüpfen wir den Donor-Farbstoff Alexa Fluor 555 oder Side Three mit dem einzelsträngigen Fragment und den FRET-Akzeptor Alexa Fluor 647 oder SI Five mit dem C-Terminus des MHC-gebundenen Peptids.

Der Indy-Abstand, wie in dieser zusammengesetzten Struktur gezeigt, beträgt etwa 41 Ångström, noch weniger als der erste Radius, der Abstand der halbmaximalen Energietransferleistung zwischen den beiden Farbstoffen. In unseren Experimenten verwenden wir planare, glasgestützte Lipiddoppelschichten als Ersatz-Antigen-präsentierende Zellen. Diese sind mit PMXC, dem Ligandenmolekül B sieben eins und dem Adhäsionsmolekül I chem eins, funktionalisiert.

Auf diese Weise kann die Bildgebung im Totalreflexions-Fluoreszenzmodus durchgeführt werden, der Fluor-Kräfte nahe der Grenzfläche anregt und dadurch das zelluläre Hintergrundsignal erheblich reduziert. FRET ist nur nachweisbar, wenn einzelne, markierte TCR-Fragmente an in der Schicht eingebettete PM-HCS binden. Dies ermöglicht es uns, die T-Zell-Rezeptor-PM-HC-Bindung zu visualisieren und anschließend die Bindungskinetik in C zwei korrekt gefalteten histogenen Takt zu berechnen.

Die extrazellulären Anteile von P seven one und I chem one werden aus Überständen von Insektenzellkulturen gereinigt, die mit dem entsprechenden BUC-Virus infiziert wurden. Die Reinigung erfolgt in drei Schritten, beginnend mit Nickel-Anti-Aros-Affinitätschromatographie, gefolgt von Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie. Histo-Tag-MHC-Klasse-zwei-Heterodimere werden in E. coli als Einschlusskörper exprimiert und in vitro bei vier Grad Celsius sowie in Gegenwart eines Platzhalterpeptids durch schnelle Verdünnung in Redoxpuffer umgefaltet.

Das Platzhalter-Peptid wird später durch Bestrahlung mit UV-Licht gespalten. Richtig gefaltete pMHC-Komplexe werden anschließend gereinigt und vom Platzhalter getrennt. Das Peptid wird bei pH 5,2 gespalten und durch das fluoreszierende Peptid ersetzt.

Das Endprodukt wird nach der Größe gereinigt. Das einzelne Kettenfragment wird mit einer nicht gepaarten Cystein-Gruppe als Einschlusskörper in E. coli exprimiert, in vitro durch stufenweise Dialyse umgefaltet und nach der Größe gereinigt. Anschließend wird es über die nicht gepaarte Cystein-Gruppe mit einem maleinimidkonjugierten Farbstoff markiert und erneut nach der Größe gereinigt.

Alle rekombinanten Proteine werden abschließend gegen PBS mit 50 % Glycerol dialysiert, auf eine Konzentration von einem Milligramm Protein pro Milliliter angereichert und bei Minus 20 Grad Celsius zur Langzeitlagerung aufbewahrt. Verwenden Sie den ratiometrischen URA3-Farbstoff, um die intrazellulären Kalziumspiegel in T-Zellen zu messen und so die stimulatorische Wirksamkeit des Lipidblatts zu überprüfen. Beladen Sie die T-Zell-Blasten mit dem URA3-AM-Ester.

Dieses Verbindung gelangt über seine AM-Gruppe in die Zellen, wird dort jedoch durch die Wirkung von Esterasen festgehalten, die den AM-Anteil abspalten. Fügen Sie Fura 2:00 AM zu etwa 3 Millionen T-Zellen in einer Endkonzentration von fünf Mikromol pro Liter hinzu. Überführen Sie die Zellen von der 24-Loch-Platte in ein neues Röhrchen und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen einmal in Imaging-Puffer, der Hank’s Pufferlösung mit Salz enthaltend Kalzium und Magnesium sowie 1 % Albumin enthält. Zur Überwachung des intrazellulären Kalziums verwenden Sie ein automatisiertes, UV-fähiges inverses Mikroskopsystem. Starten Sie das Zeitmessprotokoll und geben Sie weniger als zwei beladene T-Zellen auf die funktionalisierte Lipiddoppelschicht, die sich im Fokus auf dem Mikroskopständer befindet. Erfassen Sie in regelmäßigen Zeitabständen ein DIC-Bild sowie zwei Fluoreszenzbilder, die mit 340 und 380 Nanometer UV-Licht angeregt werden.

Sofort nach Herstellung des Bilayer-Kontakts weisen die T-Zellen erhöhte Kalziumspiegel auf, was durch das URA-Zwei-Verhältnis 15 Minuten nach Versuchsbeginn angezeigt wird. Geben Sie einen blockierenden Antikörper zu den Zellen hinzu, der alle pMHC-Antigene saturiert. Daraufhin sinken die intrazellulären Kalziumkonzentrationen auf das Niveau der nichtaktivierten Zellen ab, das später als Referenz dient.

Sobald die vorhandenen Konzentrationen des blockierenden Antikörpers auf einen Wert abnehmen, der den nichtaktivierten Zustand widerspiegelt – den wir für FRET-Messungen auf eins normieren –, müssen T-Zellen für jedes Experiment mit einem TCR-reaktiven, einzelketten Fragment-FRET-Sonde gefärbt werden. Überführen Sie etwa eine Million Zellen in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 400 × g. Entsorgen Sie das Medium und entfernen Sie verbleibende Tropfen, indem Sie das Röhrchen mit einem Papiertuch an den Innenwänden abtupfen. Dies gewährleistet ein minimales Inkubationsvolumen von etwa 30 Mikrolitern, wie bereits erwähnt.

Das FRET-Probe wird bei einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter und 50 % Glycerin bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Sie wird ortsspezifisch mit entweder Alexa, Fluor 555 oder Atto 5 zu einem Proteinverhältnis von 1:0,3 markiert. Geben Sie 0,3 Mikroliter der Sonde zu den Zellen. Klopfen Sie das Pellet vorsichtig mehrmals an und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten auf Eis.

Waschen Sie die Zellen in eiskaltem Imaging-Puffer. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang einmal. Inkubation, Zentrifugation und Lagerung bei niedriger Temperatur stellen sicher, dass T-Zellen die fluoreszierende Sonde nicht internalisieren, während sie dieser ausgesetzt sind.

Dies würde zu einer erhöhten Hintergrundfluoreszenz führen. Außerdem verlieren T-Zellen die Sonde während des Waschens und der Lagerung bei Kälte nicht, bevor die Kammer mit dem Lipiddoppelschichtträger auf den Mikroskopständer gebracht wird. Ersetzen Sie das PBS nacheinander durch Imaging-Puffer und vermeiden Sie unter allen Umständen eine Belüftung der Lipiddoppelschicht, da dies diese zerstören würde.

Um den zellulären Hintergrund zu reduzieren, verwenden wir eine Streifenausleuchtung. Dazu positionieren wir den Anregungsstrahl im kritischen Winkel, bei dem Totalreflexion auftritt. Schalten Sie die Anregung aus, schalten Sie das Breitfeldlicht ein und geben Sie die T-Zelle in die Ltec-Kammer, damit sie sich auf dem Lipidfilm absetzen kann.

Schalten Sie die Anregung ein und fokussieren Sie eine nicht-turfartige Beleuchtung. Die Zellmembran erscheint als Ring entlang der optischen Achse in jeder Fokusebene; im Turf ist lediglich die basale Membran, die mit der Doppelschicht in Kontakt steht, sichtbar. Fokusebenen darüber werden nicht mehr angeregt und sind daher nicht sichtbar.

Das Zeitungsprotokoll beginnt mit den roten und grünen Anregungsimpulsen zur Abbildung von pMHC und TCR, gefolgt von einem roten Bleichimpuls, um den P-M-H-C-F-Akzeptor abzulösen. Ein grüner Impuls zur Abbildung des TCR nach der F-Farbstoff-Akzeptor-Bleichung und ein roter Impuls zur Überprüfung der Akzeptor-Ablation werden auf einer Zeitskala von weniger als einer Sekunde durchgeführt, mit dem kürzestmöglichen Abstand zwischen dem ersten und zweiten grünen Impuls. Optional kann am Anfang ein DIC-Bild aufgenommen werden; eine zweifarbige Bildaufspaltung ermöglicht die gleichzeitige Detektion des gespendeten Donors und des gespendeten Akzeptorkanals.

Die angeregte Akzeptoranregung zeigt die Anreicherung von pMHC in der T-Zell-Synapse. Dieses Vorab-Bild bestätigt das Vorhandensein von pMHC und weist bereits auf TCR-vermittelte pMHC-Bindung hin. Anregend. Der Akzeptor liefert Bilder in beiden Kanälen.

Das Signal des angeregten Donorkanals ist aufgrund des Energieübergangs in den F-Akzeptorkanal teilweise in der Intensität vermindert. Das Signal des FRET-Akzeptorkanals setzt sich aus FRET-Übersprechen des angeregten Donors und einer Kreuzanregung des FRET-Akzeptors zusammen. Auf jeden Fall wird dieses Bild nicht für die Analyse verwendet.

Im vorliegenden Protokoll folgt ein schneller Bleichschritt, der alle akzeptierten Fluorophore des F-Donors eliminiert. Die Intensität des F-Donor-Bildes nach akzeptablem FRET-Bleichen wird nun ohne Intensitätsverlust in den FRET-Kanal auf höhere Werte wiederhergestellt.

Die folgende FRET-Akzeptorerwartung überprüft die vollständige F-Fettsäure-Akzeptor-Bleichung. Vergrößern wir die Synapse, um die erholte Donorfluoreszenz zu quantifizieren. Bestimmen Sie die durchschnittliche Hintergrundintensität, die unabhängig vom FRET-Akzeptor konstant bleibt.

Photobleichen Sie anschließend und bestimmen Sie die durchschnittliche Intensität der Synapse sowie die einer repräsentativen TCR-Cluster. Die FRET-Ausbeute wird dann berechnet, indem die Differenz vor und nach der Ablation des Akzeptors normalisiert wird. In unserem Beispiel messen wir 16 % FRET für die gesamte Synapse und 26 % FRET für die repräsentative Cluster.

TCR-Cluster-FRET-Ausbeuten werden später in TCR-Besetzungen umgewandelt, die zweidimensionale synaptische Dissoziationskonstanten aus Einzelmolekül-Daten ergeben. Dies ermöglicht es uns, die Kinetik der synaptischen TCR-Peptid-MHC-Bindung für Einzelmolekül-F-Threat-Experimente abzuleiten. Wir verwenden dieselben Reagenzien und dieselbe Markierungsstrategie wie zuvor.

Jedoch, um sicherzustellen, dass wir tatsächlich die Interaktion zwischen einem einzelnen T-Zell-Rezeptor und einem einzelnen Peptid-MHC beobachten, entscheiden wir uns dafür, das folgende Kriterium zu erfüllen. Ein Kandidatenereignis für ein einzelnes Molekül-FRET muss umgangssprachlich mit dem einzelnen FRET-Akzeptor- oder FRET-Donormolekül übereinstimmen. Hier verwenden wir ein einzelnes pMHC als FRET-Akzeptormolekül, um die Einzelmolekül-Natur des beobachteten FRET-Ereignisses zu verifizieren, aber mit umgekehrter Logik.

Die Verwendung von „fed“-Akzeptoren in höheren Knöpfen und Fred-Donatoren in niedrigen Knöpfen ist durchaus eine Option. Üblicherweise beleuchten wir T-Zellen, die eine stimulatorische Lipid-Doppelschicht kontaktieren, mit 514 und 647 Nanometer Anregungslicht, wobei sequenzielle und wiederholte Anregung von Donator und Akzeptor mit einer minimalen Zeitverzögerung von einer Millisekunde erfolgt, gefolgt von einer Verzögerungszeit, die je nach Anforderungen des Experiments variiert werden kann.

Um innerhalb von Millisekunden nach der Anregung ein ausreichend starkes fluoreszentes Signal für die Detektion einzelner Die zu erhalten, müssen wir hohe Anregungsleistungsdichten im Bereich von ein bis fünf Kilowatt pro Quadratzentimeter anwenden. Aufgrund von Photobleichen sinkt die Anzahl sichtbarer PMHC-FRET-Akzeptormoleküle schnell auf ein Niveau, bei dem einzelne FRET-Akzeptor-Fluorophore in einer Doppelschicht mit 30 oder mehr markierten PMHCs pro Quadratmikrometer unterscheidbar werden. Ein Beispiel hierfür wird bei einer Gesamtverzögerungszeit von 42 Millisekunden gezeigt.

Ein einzelnes, mit einem roten Kreis markiertes FRET-Ereignis wird im zweiten und dritten Zeitpunkt sichtbar. Es lokalisiert sich zusammen mit einem einzelnen S5-Molekül, das mit einem grünen Kreis markiert ist. In diesem Beispiel weist das beobachtbare FRET-Ereignis eine Spurlänge von zwei auf; sammeln Sie weitere Einzelmolekül-FRET-Spuren, wie in der Tabelle gezeigt, insgesamt 128 Spuren.

Berechnen Sie anschließend die komplementäre kumulative Summe der Spuren, wie durch die grünen Zahlen gezeigt, und normalisieren Sie diese, wie im Diagramm dargestellt. Tragen Sie die normalisierten Werte auf und passen Sie sie mit einer monoexponentiellen Funktion an. Der Erwartungswert liegt etwas über 1,5 Zeitrastern. Dieser Wert hängt von der TCR-Peptidbindung, der MHC-Bindung und der Photobleiche ab. Um zwischen diesen beiden Beiträgen unterscheiden zu können, muss der Erwartungswert daher für mindestens drei verschiedene Zeitpunkte berechnet werden.

Die Verzögerungen zeigen nun alle Erwartungswerte in Abhängigkeit von den jeweiligen Zeitverzögerungen und passen die Datenpunkte an die hier dargestellte Funktion an, die die Lebensdauer mit 2,12 Sekunden und den Erwartungswert für PHOTOBLEICHUNG f Fred enthält. Die Wiederherstellung des Donors nach akzeptablem Bleichen von f Fred, wie hier und zuvor detaillierter gezeigt, kann verwendet werden, um in nur wenigen Schritten die zweidimensionalen Dissoziationskonstanten zu bestimmen, wie sie innerhalb der immunologischen Synapse wirksam sind.

Hier konzentrieren wir unsere Analyse auf die TCR-Bindung und TCR-Cluster, bei denen die T-C-R-P-M-H-C-Bindung am ausgeprägtesten ist. Wie aus den gezeigten Messungen hervorgeht, variieren die F FRED-Werte erheblich. Für einzelne TCR-Cluster.

Die Multiplikation von F_fred mit dem Proportionalitätsfaktor C führt zur TCR-Besetzung, einem Begriff, der das Verhältnis zwischen der Anzahl gebundener pMHC-TCR-Komplexe und ihrer Gesamtanzahl beschreibt. C muss einmalig für einen bestimmten Satz von FRE-Paaren und das verwendete FRE-System bestimmt werden. Gegen Ende dieser Präsentation erläutern wir detaillierter, wie C beispielsweise unter Verwendung von SI drei und SI fünf, die spezifisch am TCR-reaktiven einzelketten Antikörperfragment und am C-Terminus des MHC-gebundenen Peptids platziert sind, bestimmt wird. Dies entspricht etwa zwei synaptischen, zweidimensionalen Dissoziationskonstanten, die aus der als A bezeichneten TCR-Besetzung und der anfänglichen Dichte der auf der Lipid-Bilayer vorhandenen pMHCs berechnet werden können.

Die dargestellte Beziehung leitet sich aus dem Massenwirkungsgesetz ab und wird im Artikel, der diesem Film beiliegt, ausführlicher erläutert. In unserem Beispiel beträgt die anfängliche Dichte der pmcs 30 Moleküle pro Quadratmikrometer. Wir gelangen zu einer Verteilung der 2D-kds, die in der T-Zell-Synapse wirksam sind, mit einem Medianwert von etwa 34 Molekülen pro Quadratmikrometer.

Die Assoziationsratenverteilung kann aus der synaptischen 2D-KD-Verteilung und der entsprechenden Dissoziationsrate hier, 0,41 pro Sekunde, berechnet werden, wie mittels Einzelmolekül-FRET-Spurenanalyse bei 24 Grad Celsius bestimmt wurde. Der Medianwert beträgt etwa 0,01 Quadratmikrometer pro Molekül pro Sekunde. Zusammenfassend ermöglichen FRET-Messungen zwischen T-Zell-Rezeptor und peptidbeladenem MHC eine umfassende Analyse aller kinetischen Parameter, die die Reaktionsdynamik in C zwei beschreiben.

Diese Methodik kann prinzipiell auf die Analyse anderer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen verallgemeinert werden, da diese möglicherweise für die Erkennung zwischen Zellen von zentraler Bedeutung sind. Nicht zuletzt erläutern wir, wie die Konstante C experimentell bestimmt werden kann, die zur Umrechnung von Fett-Ausbeuten in TCR-Besetzungen erforderlich ist. Dieses Verfahren muss nur einmal durchgeführt werden.

Die bestimmte Konstante C kann anschließend für alle folgenden Experimente verwendet werden, bei denen dasselbe FRET-System mit denselben Fluorophoren eingesetzt wird. In diesem Verfahren leiteten wir im Wesentlichen die in einzelnen TCR-Clustern gemessenen FRET-Ausbeuten, basierend auf der Donator-Rekuperation nach Akzeptor-Photobleaching, auf die entsprechenden Intensitätswerte um, die im sensitisierten FRET-Kanal detektiert wurden. Wie zuvor erörtert, wird die FRET-Ausbeute aus den hintergrundkorrigierten FRET-Donator-Kanal-Bildern vor und nach der Ablation des FRET-Akzeptors bestimmt.

Der sensibilisierte FRET-Kanal muss mit dem F-Donator-Kanal sowie in X- und Y-Richtung ausgerichtet und auf Hintergrund korrigiert werden. Hier gezeigt sind die Durchmischung des Fred-Donators und die Kreuzanregung des Fred-Akzeptors. Eine detaillierte Beschreibung, wie die Durchmischung des Fred-Donators und die Kreuzanregung des Fred-Akzeptors korrigiert werden, ist in dem Artikel enthalten.

Begleitend zu diesem Video berechnen Sie nun für jeden TCR-Cluster das Verhältnis des Bug-Signals des korrigierten FRET-Bildes und des entsprechenden korrigierten FRET-Donatorbildes. Bestimmen Sie das korrigierte durchschnittliche Signal für einzelne FRET-Donatoren und Einzelmolekül-FRET-Ereignisse und berechnen Sie das Verhältnis. Die TCR-Besetzung wird dann durch Multiplikation beider Verhältnisse ermittelt.

Tragen Sie nun die für einzelne TCR-Cluster bestimmten FRET-Ausbeuten gegen deren TCR-Besetzungen auf. C wird dann durch lineare Regression bestimmt, wie hier gezeigt. In unserem Beispiel beträgt es rund zwei.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, eine mit Proteinen funktionalisierte Lipiddoppelschicht in Kombination mit Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zu nutzen, um die synaptischen Bindungskinetiken zwischen pMHC und TCR zu messen. Alle notwendigen Schritte, einschließlich der Proteinproduktion, der Markierung von T-Zellen und der abschließenden FRET-Messungen, wurden besprochen. Außerdem wurde die Bildanalyse detailliert gezeigt, die zu Aktivierungskurven von T-Zellen und FRET-Werten führt.

Schließlich wurde die Methodik zur Bestimmung der kinetischen Bindungs- und Dissoziationsraten vorgestellt. Im Prinzip kann ein analoger Ansatz verwendet werden, um andere synaptische Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei jedoch gegebenenfalls geeignete Modifikationen erforderlich sein könnten.