Name: Mess TCR-pMHC Binding In-situ- Mit einem FRET-Mikroskopie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie TCR-pMHC-Bindungskinetiken im immunologischen Synapsenbereich mit FRET-Mikroskopie messen. Diese Methode ermöglicht quantitative Analysen von Affinität, Off-Rate und On-Rate in situ auf Einzelmolekülebene.

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MA wurde durch ein Schrödinger-Stipendium des Wissenschaftsfonds (FWF, J3086-B11) und dankt der Max-Planck-Gesellschaft für finanzielle und administrative Unterstützung getragen. GS und JH wurden vom Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF, LS13-030) unterstützt.

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Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ ist sehr erwünscht können insbesondere bei geringen Affinität Wechselwirkungen wie TCR-pMHC Bindung 11. Dies, da die An-Rate als auch die Stabilität eines solchen Wechselwirkungen signifikant durch die besonderen Umstände, unter denen eine Bindung stattfindet, beeinflusst. Minimalinvasive FRET-basierten Imaging-Ansätze sind also im Prinzip perfekt für solche Aufgabenstellungen geeignet, dennoch beinhalten eine Reihe von Hürden, die überwunden werden müssen. Rauschen, das durch zelluläre Autofluoreszenz erzeugten begrenzt die Empfindlichkeit der Messungen und sollte daher auf ein Minimum beschränkt werden. TIRF-Mikroskopie dient dieses Bedürfnis sehr gut 12 erfordert aber die Funktionalisierung von Glasobjektträger, idealerweise in der Form einer ebenen Glasgestützten Lipiddoppelschicht mit Proteinen der Wahl 13-15 eingerichtet. Ein weiterer Vorteil einer teilweise rekonstitutiven Ansatzes ist, dass rekombinante Doppelschicht-Resident FRET-Partner kann sehr viel mErz leicht in quantitativer ortsspezifische und rationelle Weise mit kleineren und heller Fluorophoren markiert, als es mit der Zelloberfläche exprimierten Proteine ​​möglich. TCRs mit rekombinanten scF V s, die T-Zell-Erkennung nicht beeinflussen markiert, wie zuvor 2 getestet wurde. Darüber hinaus ist die Proteinzusammensetzung der SLB, beispielsweise die Dichte pMHCs und die Wahl des Hilfsfaktoren können an einen spezifischen Bedürfnisse angepasst werden. Wir haben zuvor durchgeführten Versuchen mit unterschiedlichen Dichten von stimulierenden pMHCs, aber noch nicht detektierten signifikanten Unterschiede in der 2D-K off und 2D-K D2. Soweit hier die Erkennung von MHC Klasse II-Moleküle mit nur behandelt, vor allem wegen der Art ihrer Peptidbindungsspalte, die an beiden Enden offen ist und somit Platz für größere Peptide einschließlich eines Linkers für Fluorophor Anlage. In einigen Fällen kann ein solcher Ansatz auch für die Kennzeichnung MHC cla arbeitenss-I-Moleküle 16, aber großer Vorsicht zu treffen, um ihre Verwendung in Experimenten zu überprüfen. Die Empfindlichkeit der T-Zellen gegen Antigene, die durch T-Zell-Proliferations-Assays, sowie die pMHC-TCR Bindungskinetik gemessen wie in vitro durch Oberflächenplasmonresonanz gemessen werden durch die Zugabe des Linkers und Fluorophors beeinflusst das Peptid. Alternativ können MHC-Klasse-I-Molekülen, sich in einer ortsspezifischen Art und Weise mit der Einführung eines ungepaarten Cystein innerhalb der Sequenz der schweren Kette (unveröffentlichte Beobachtungen) markiert werden. Mit der Verwendung von geeigneten Molekularsonden jedes synaptischen Protein-Protein-Wechselwirkung können prinzipiell in einer hierin beschriebenen Art und Weise untersucht werden. Solche Sonden, beispielsweise sollte scF V s oder Designed Ankyrin Repeat Proteine ​​(DARPins) 17, monovalente und sollte ihre Ziel stabil zu binden, ohne die Interaktion von Interesse. Natürlich Struktur information für rationales Sondendesign sehr wünschenswert, aber nicht unbedingt erforderlich. Bei der Festlegung eines neuen Paares von FRET-Partner, wird empfohlen, zu erfassen und zu analysieren, FRET in Groß ersten. Seiten der Etikettenbefestigungs kann beträchtlich variiert werden, um die FRET-Signals zu maximieren und auch zu überprüfen, ob gemessen FRET Erträge hängen von der inter-Farbstoff der Entfernung ab. Sobald das System optimiert ist, einzelne FRET-Signale können durch die Begrenzung der Markierung von hoher Häufigkeit FRET Partner auf 10-30%, und das Bleichen des niedriger Abundanz FRET Partner bis einzelne Moleküle auflösbar sind auf dem Gebiet der Beleuchtung erfasst werden. Nicht zuletzt ist darauf hinzuweisen, dass SLBs nähern einige, aber nicht alle Aspekte einer physiologischen Plasmamembran. Eigenschaften wie Membrankrümmung und Flexibilität Domäne Kompartimentierung Umordnung des Cytoskeletts und der Zellbeweglichkeit sowie eine hohe Vielzahl von Oberflächen-exprimierten Membranproteine ​​werden von SLBs dargestellt aber beeinflussen könnten ter untersuchte verarbeiten. Große Anstrengungen müssen investiert, um die bildgebenden Verfahren, die Überwachung der Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Einzelmolekülauflösung in physiologischer Synapsen, die unzugänglich für TIRF Bildgebung ermöglichen festzulegen.

Ein grundlegendes Verständnis davon, wie T-Zellen erkennen Antigene erfordert der Suche an der richtigen Stelle, das heißt, innerhalb der immunologischen Synapse zwischen der T-Zelle und der APC gebildet. Hier Molekular Bindungskinetik werden nicht nur von den inhärenten biochemischen Eigenschaften der Interaktionspartner beteiligt, aber bestimmt ab zu einem großen Teil auf die Zellparameter, die zellulären Kräfte, Membran-Architektur und lateralen Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen sowie Synapse spezifischen geometrischen Beschränkungen beinhalten 3. Biochemische Ansätze zu Auflösungsvermögen, da sie die Zerstörung von mindestens einem der synaptischen Membranen beteiligt notwendig beschränkt. Aus diesem Grund wird ein FRET-basierten Imaging-Methode wurde entwickelt, um zu überwachen Bindung des TCR, um antigene pMHCs 2. Hier T-Zellen mit einem rekombinanten eingerichtet und ortsspezifisch TCR &amp; bgr;-reaktives Einzelketten-Antikörperfragment (SCF V) markiert und mit Plan konfrontiert<html> AR-Glas-gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs), die MHC Klasse II-Moleküle mit einem fluoreszierend markierten antigenen Peptid beladen, costimulatorischen Molekülen und Adhäsionsproteine ​​zu beherbergen. Synaptischen Bindung zwischen Farbstoff markierten TCR und farbstoffmarkierten pMHC ergibt FRET, der auf einer Masse und Einzelmolekülebene durch Total Internal Reflection Fluoreszenz (TIRF) -Mikroskopie überwacht werden können. In diesem Artikel wird im Detail erläutert, wie man SLBs zur Bestimmung von T-Zellsynapsen zu nutzen, überprüfen Sie ihre Integrität über eine funktionelle T-Zell-Calcium-Flux Assay Verhalten FRET-Messungen in der Masse und mit Einzelmolekülempfindlichkeit und die erfassten Daten zu analysieren. Empfehlungen sind auf die Herstellung einwandfrei angepaßt Proteine, die für Doppelschicht Funktionalisierung erforderlich angeboten. Für genauere Informationen bezüglich Doppelschichtbildung und Aufbau eines geeigneten TIRF-Mikroskop bitte zu einem zusätzlichen Zugang der Öffentlichkeit JoVE Publikation veröffentlicht Rücken an Rücken 4 beziehen. Zelt &quot;&gt; Natur von SLBs Funktionalisierbaren SLBs leicht von unilamellaren Vesikeln (SUVs), welche die beiden Lipide 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-phosphocholin erzeugt werden (kurz: POPC, 90-99%) und 1,2-Dioleoyl-sn - glycero-3 - {[N (5-Amino-1-carboxypentyl) Iminodiessigsäure] Succinyl} (kurz: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs auf sauberen Glasobjektträger verteilt, um eine zusammenhängende planare Doppelschicht 4 zu bilden. DGS-NTA-Ni dazu dient, Polyhistidin-tag-Proteine ​​über Polyhistidin-vermittelte Komplexbildung mit dem synthetischen NTA-Ni-enthaltenden Kopfgruppe (1A) zu verankern. Für stabile Assoziation einer Regel ersetzt die nativen Transmembran-Domäne und den cytoplasmatischen Schwanz des Adhäsionsprotein ICAM-1 und der co-stimulierenden Molekül B7-1 mit einem Tag mit zwölf Histidine (ICAM-1-12h, B7-1 -12H) (1B) . Das Peptid-beladenen Klasse II-Molekül IE k enthält zwei Membran-Embedded (α und β) Polypeptidkettes. Die Trans / zytoplasmatischen Domänen beider Ketten müssen mit einem Tag mit sechs Histidinen jeweils (IE k α 6H β 6H oder IE k -2x6H) ersetzt werden. Als Alternative zur Verlängerung der α-Kette mit zwölf Histidinen und dem Verlassen der extrazellulären Domäne des β-Kette ohne Tags (was zu IE k α 12H β 0H oder IE k -12H) führt zu zufriedenstellenden Ergebnissen (Abbildung 1B). Standortspezifische Kennzeichnung pMHCs Es ist wichtig, um die pMHC stöchiometrisch und ortsspezifisch, um zu kennzeichnen, um in der Lage zu mess FRET Renditen in sinnvolle Gleichgewichtsbindungskonstanten zu konvertieren. Dies kann durch chemische Markierung eines synthetischen Peptids, das in die Peptidbindungsspalte von rekombinanten Histidin-markierten MHC Klasse II-Moleküle geladen 2,5 erreicht wird. Das Peptid umfaßt alle Rückstände des T-Zell-Epitop wie well als eine kurze C-terminale Linker (GGS), gefolgt von Cystein (zB in der Motten Cytochrom c (MCC) Peptid ANERADLIAYLKQATK- GGSC, der Linker ist fett markiert). Dieses Cystein wird verwendet, um das Peptid stöchiometrisch unter Verwendung von Maleimid-Farbstoff-Derivate zu bezeichnen. An dieser Stelle sei besonders vorsichtig, um die Überprüfung quantitative Farbstoff Kopplung an die Cystein-enthaltenden Peptid gewidmet sein. HPLC-Reinigung des Peptids Farbstoff Addukt wird empfohlen und ist vom Elektrospray-Ionisations-Massenspektroskopie verfolgt werden. Etwaige zeichneten Massen entsprechend der Peptid Edukt (ohne Farbstoff) zu reflektieren unvollständige Etikettierung. Wenn dies wahr ist, sollte der HPLC-gereinigte Peptid an aufeinander folgenden Runden von Farbstoff-Markierung unterzogen werden, bis die Kennzeichnung gilt quantitativ. Beachten Sie, dass der MALDI-TOF-Massenspektroskopie sollte vermieden werden, da diese Methode beinhaltet Laserstrahlung für die Proben Ionisation werden. Diese Behandlung löst die beigefügten empfindliche Fluorophore vor Peptidmasse wird ausgelesen und damit underrepre<html> SENTS Grade Farbstoff-Konjugation. Indirekte noch ortsspezifische Markierung von zellgebundenem TCRs mit der Verwendung von monovalenten Einzelketten-Fv-Fragmente Es ist immer noch eine Herausforderung, Farbstoffe oberflächenassoziierten Proteine ​​lebender Zellen in einer ortsspezifischen Weise Zelle zu befestigen. Diese Hürde für oberflächenexponierten TCRs zu überwinden, wurde eine monovalente einkettige Version (SCF V) aus den Genen des TCR &amp; bgr -reaktive monoklonalen Antikörper H57-197 2 errichtet. Die Kristallstruktur dieses Antikörpers im Komplex mit dem TCR ermöglicht, rational zu entwerfen eine Version, bei der ein Serinrest in der Nähe des C-Terminus der MHC-assoziiertes Peptid (wobei die entsprechenden FRET Partner Farbstoff angebracht ist) ist für eine substituierte Cysteinrest. Diese Mutante Cystein dient dann als Akzeptor für Farbstoff-Konjugation (Abbildung 2). Methoden zur FRET aufnehmen nt &quot;&gt; Groß FRET-Werte sind am besten geeignet, um die Beziehung zwischen gewählten Inter-Farbstoff Entfernungen Akkreditierung und FRET-Effizienzen in diesem TCR-pMHC gemessenen Bindungssystem 2. Darüber hinaus Groß FRET-Messungen zeigen, qualitative und quantitative Unterschiede in der synaptischen TCR-pMHC Affinitäten ( siehe unten und Protokoll Abschnitt 3.2). Verschiedene Ansätze zur Quantifizierung der FRET-Effizienzen wurden in der Literatur 6 eingeführt. In über dieser Artikel FRET erfasst (a) Spender Erholung nach Akzeptor Bleichen, und über (b) sensibilisiert FRET-Akzeptor-Emission. Das erste Verfahren (a) erfordert die Verwendung eines FRET-Akzeptor, die leicht gebleicht werden können, und einem Spender, der eher photo ist. Zusätzlich ist es wichtig, sicherzustellen, dass die fotogebleicht Akzeptor ist nicht mehr in der Lage ist das Abschrecken der Donor-Fluoreszenz. Da die gleichen Detektionskanal (Donor) ist für die Quantifizierung verwendet, keine Korrekturfaktoren eind keine chromatischen Aberrationen berücksichtigt werden müssen, was dieses Verfahren einfach und zuverlässig macht. Jedoch können quantitative Messungen nicht auf dem gleichen Punkt der Probe wiederholt werden und Veränderungen in der FRET nicht über die Zeit aufgezeichnet werden. Um Effekte durch molekulare Diffusion oder zellulärer Motilität eine schnelle Bleichstufe angestrebt werden, die die Zeit, die zwischen dem ersten FRET-Donor (vor Akzeptor-Bleichen) und dem zweiten FRET-Donor Bildaufnahme (nach FRET-Akzeptor Bleichen) minimiert zu vermeiden. Es ist zu empfehlen, um eine leistungsfähige Laser-Lichtquelle des FRET-Akzeptor Anregungswellenlänge, um die Beleuchtung und Bleichzeiten zu minimieren beschäftigen. Im Gegensatz dazu in dem Ansatz der sensibilisierten FRET Emissionsmessung (b) der FRET-Donor ist, angeregt und die Emission der FRET-Akzeptor in dem FRET-Akzeptor-Kanal beobachtet. Änderungen im FRET-Akzeptor-Signal kann im Laufe der Zeit aber Emission der FRET-Donor in den roten Bereich verschobenen Akzeptor-Kanal aufgezeichnet werden (termed Durchscheinen) und FRET-Akzeptor Quererregung über Donoranregung müssen genau bestimmt und aus dem aufgezeichneten FRET-Akzeptor-Kanal subtrahiert werden. Hierzu werden die entsprechenden FRET-Donor und FRET-Akzeptor-Bilder sind räumlich ausgerichtet werden. Detektion von Einzelmolekül (sm) FRET-Ereignissen Bei der Verwendung von Lasern als Anregungsquelle, einer empfindlichen Kamera und geräusch gedämpft TIRF-Mikroskopie die Fluoreszenz der einzelnen Fluorophore können leicht über die Zeit verfolgt werden. Ähnliches gilt für den Nachweis der intermolekularen smFRET Ereignisse. Jedoch können Komplikationen durch FRET-Donor Durchbluten und Queranregung des FRET-Akzeptor verursacht werden, und daher mit großer Sorgfalt bei der Einstellung der Fluorophor Dichten im smFRET Versuch genommen werden. In dem Protokoll unten angegeben (Protokoll Abschnitt 4) wurde das TCR als FRET-Donor in hoher Fülle und pMHC als FRET-Akzeptor in geringer Menge ausgewählt. Um FR dämpfenET Spenderdurchscheinen ausreichend, dekorieren 10-30% der TCRs mit fluoreszierenden scF V und 90-70% der TCRs mit nicht-fluoreszierenden scF V. Hier wurde das FRET-Akzeptor-Kanal als Einzelmolekül-Kanal gewählt, weil es mit der konfokalen Einzelmolekül-FRET-Kanal. Dies hilft, smFRET Veranstaltungen mit Einzelmolekül-FRET-Akzeptoren, die die Grundlage der smFRET Validierung auszurichten. Extrahieren von synaptischen off-Raten durch smFRET Messungen Photobleaching beider FRET-Donor-Akzeptor und FRET müssen für beim Extrahieren der Halbwertszeit von Wechselwirkungen von Einzelmolekül-FRET-Spuren berücksichtigt werden. Die Anzahl der beobachtbaren FRET-Signale zu Beginn ihres Auftretens als Einzel Donor-Akzeptor-Paar N (0) wird über die Zeit sowohl unverbindlich des Rezeptor-Ligand-Komplex und Photobleich reduziert. Die Zahl der überlebenden Komplexe zu einem bestimmten Zeitpunkt N (t) kann mathematisch wie folgt ausgedrückt werden: In der Photoblei Ausdruck exp (-t / τ Bleichmittel) ist die Zeit t durch das Produkt aus der Anzahl der Beobachtungen n und der Beleuchtungszeit t schlecht aufgrund der nicht-kontinuierlichen, diskreten Betrachtungsmodus (dh Bleichen während der Beleuchtung tritt nur beschrieben ). Innerhalb der kinetischen Term exp (t / τ off) die Zeitdauer t ist das Produkt aus der Anzahl der Beobachtungen n und dem Zeitpunkt t lag für einen einzelnen FRET Beobachtung (dh kontinuierlich geschieht kinetische freibleibend). Gleichung 1 kann wie folgt ausgedrückt werden: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> Der Begriff τ Bleichmittel / τ krank describes die Anzahl der Beobachtungen bis Bleich auftritt und ist definiert als der Erwartungswert &lt;n bleichen&gt; der Exponentialfunktion. Gleichung 2 kann wie folgt vereinfacht werden: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> Der Erwartungswert &lt;n (t lag)&gt; der Anzahl von Rahmen N (t) mit beobachtbaren FRET-Ereignissen nach der Zeit t wird direkt aus dem Experiment bestimmt. Es hängt von der einstellbaren Zeit zwischen Beobachtungen (t lag) in das Experiment ausgewählt und die unbekannten Werte für τ off (das Inverse der off-Rate k off) und &lt;n bleichen&gt;, den Erwartungswert der Anzahl der Beobachtungen vor dem Bleichen auftritt . So Berechnung des Erwartungswertes &lt;n (t lag)&gt; für mindestens zwei Werte von t <sub&gt; Verzögerung ermöglicht die experimentelle Bestimmung der &lt;n bleichen&gt; und &amp; tgr; aus. Extrahieren von synaptischen 2D-K D Werte durch FRET-Messungen Messen TCR Belegung ein, dh das Verhältnis zwischen gebundenen TCRs und insgesamt TCRs ist von zentraler Bedeutung für die Bestimmung der synaptischen 2D-K D -Werte. Nach der Formel 4 dieser Begriff ist direkt proportional zu der gemessenen FRET Ausbeute solange TCRs dient als FRET-Donoren und pMHCs als FRET-Akzeptoren. <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> mit a = TCR Belegung, C = Umrechnungsfaktor C eine Konstante ist, die auf dem FRET-System abhängt, und die verwendeten Fluorophore. Es kann experimentell wie folgt bestimmt werden. ein in eine 2D-K D nach Gleichung 5 umgewandelt, wenn derAnfangsdichte von TCR-Liganden vor der Zugabe von T-Zellen, um die Doppelschicht bekannt ist. Dies ist wegen der hohen Mobilität der SLB-Proteine ​​gebunden und auch, weil SLBs bieten ein nahezu unerschöpfliches Reservoir an Liganden 2. <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> mit [pMHC Anfangs] = Anfangsdichte von pMHC vor der Zugabe von T-Zellen Mit den Gleichungen 4 und 5 kann man nun leicht die synaptische 2D-K D zwischen TCR und pMHC. Dies wird am zuverlässigsten mit FRET-Messungen basierend auf Spender Erholung nach Akzeptor Bleichen (siehe Protokoll Abschnitt 3.1) durchgeführt. Jedoch zur Messung C die Beziehung zwischen der Intensität I FRET FRET (Hintergrund korrigiert, FRET-Donor Durchbluten und FRET-Akzeptor Queranregung) und TCR Belegung a bestimmt werden muss. Dazu werden einbenötigt, um das Verhältnis R zwischen der mittleren Fluoreszenzintensität von einzelnen TCR-assoziierten FRET Donorfluorophore (zB Cy3 oder AF555) sm weiß ich FRET-Donor und die mittlere Intensität des einzelnen Moleküls FRET Ereignisse sm I FRET. R hängt von der FRET-System in Frage, Emissionsfilter und Kamera für die Fluoreszenzdetektion eingesetzt. Der TCR Belegungsbeginn a kann dann nach Gleichung 6 direkt bestimmt werden. <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> mit R = sm I FRET-Donor / sm I FRET R wurde als 1,45 für den H57 scFv- Cy3 / Cy5 pMHC-Systems bestimmt zu: a = Groß Ich FRET / Groß I TCR-cy3 • 1,45 Die Beziehung zwischen dem TCR Belegung a und der FRET-Ausbeute kann durch FRET-Donor bestimmen erholeny nach dem Akzeptor-Bleichen. Hierzu werden beide Parameter gegeneinander für eine Reihe TCR Mikrocluster aufgetragen, wie in 4A .Die Steigung der linearen Anpassung gezeigt gibt die Umwandlungsfaktor C (aus Gleichung 4). Wie in 4A gezeigt, C Beträge für (a) die H57 scF V - Cy3 / Cy5 pMHC-FRET-System und (b) der aufgebrachten Mikroskop Systemkonfiguration auf 1.995. Der TCR Belegungsbeginn ein leicht wie folgt abgeleitet werden: TCR Belegung a = FRET-Ausbeute • 1.995

<table><tbody><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bakterielle</td></tr><tr><td>Expression Sf900 II</td><td>Life Technologies</td><td>10227402</td><td>Insektenzellmedien für die Herstellung von Baculoviren</td></tr><tr><td>Insect-XPRESS mit L-Glutamin (Lonza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10564038</td><td>Insektenzellmedien für die Expression von Baculoviren</td></tr><tr><td>Sf9-Zellen</td><td>Life Technologies</td><td>11496-015</td><td>Zellen für Viren Produktion und Expansion</td></tr><tr><td>High Five Cells</td><td>Life Technologies</td><td>B855-02</td><td>Zellen für die Kaliumexpression</td></tr><tr><td>LB-media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>bakterielle Expression</td></tr><tr><td>Centramate System</td><td>Pall</td><td></td><td>Proteinkonzentration aus großen Volumina</td></tr><tr><td>Centramate Kassette 10kDa Cutoff</td><td>Pall</td><td>OS010T12</td><td>Proteinkonzentration aus großen Volumina</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900308</td><td>Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC800308</td><td>Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>5123</td><td>Proteinkonzentration</td></tr> &<tr><td>Auml; kta pure 25L</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0182-24</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5174-01</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Mono Q 5/50GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5166-01</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Ni Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5318-01</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Gilson HPLC-System</td><td>Gilson</td><td></td><td>Aufreinigung von Fluorochrom-gekoppelten</td></tr><tr><td>Peptiden Pursuit XRs C18, 5 & micro; m Partikelgröße, 21,2 * 250 mm Säulengröße</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>Aufreinigung von Fluorchrom-gekoppelten Peptiden</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 & micro; m Partikelgröße, 21,2*50 mm Säulengröße</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>Aufreinigung von Fluorochrom-gekoppelten Peptiden</td></tr><tr><td>Tricorn 10/20 Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4064-13</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Gilson HPLC-System</td><td>Gilson</td><td></td><td>Aufreinigung von Fluorochrom-gekoppelten</td></tr><tr><td>Peptiden Pursuit XRs C18, 5 & Mikro; m Partikelgröße, 21,2 * 250 mm Säulengröße</td><td>Agilent</td><td>A6000250X212</td><td>Aufreinigung von Fluorchrom-gekoppelten Peptiden</td></tr><tr><td>Pursuit XRs C18, 5 & micro; m Partikelgröße, 21,2*50 mm Säulengröße</td><td>Agilent</td><td>A6000050G212</td><td>Aufreinigung von Fluorchrom-gekoppelten Peptiden</td></tr><tr><td>Cy3-Maleimid</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23031</td><td>ortsspezifische Proteinmarkierung über mutierte ungepaarte Cysteine</td></tr><tr><td>Cy5-Maleimid</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25031</td><td>ortsspezifische Proteinmarkierung über mutierte ungepaarte Cysteine</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 C2 Maleimid</td><td>Life Technologies</td><td>A-20346</td><td>ortsspezifische Proteinmarkierung über mutierte ungepaarte Cysteine</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimid</td><td>Life Technologies</td><td>A-20347</td><td>ortsspezifische Proteinmarkierung über mutierte ungepaarte Cysteine</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, zellpermeiert</td><td>Life Technologies</td><td>F-1221</td><td>Calcium-sensitiver Farbstoff für die Zellmarkierung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>zum Auflösen von Fura-2 am</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution plus Calcium/Magnesium</td><td>Fisher Scientific</td><td>10225362</td><td>Imaging-Puffer</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin lyophilisiertes Pulver</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>Ergänzung für Imaging-Puffer</td></tr><tr><td>14-4-4S</td> Antikörper-Affimetrix <td>eBioscience</td><td>14-5980-81</td><td>blockierender Antikörper für H2-I-Ek (anerkannt durch 5c.c7, 2B4 und AND TCR)</td></tr><tr><td>5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen</td><td>Becton Dickinson</td><td>FALCON 352063</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Ultrafree-MC Zentrifugalfiltereinheit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30GV0S</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter 0,2&micro; m</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Mikrosphären, 0,1 & Mikro; m, fluoreszierend blau/grün/orange/dunkelrot</td><td>Life technologies</td><td>T-7279</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop für Fura-2-basierte Kalziummessungen&nbsp;</td><td>LEICA</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop für (Einzelmolekül-)FRET-Messungen</td><td>LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td> für <td>Details siehe parallelen JoVE-Beitrag von Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>planar getragene Lipiddoppelschichten</td><td></td><td>für Details siehe parallelen JoVE-Beitrag von Axmann et al.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, mit L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>11554416</td><td>T-Zell-Medien</td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäure 100X</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>T-Zell-Medienergänzung</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin / L-Glutamin 100x</td><td>Life Technologies</td><td>12000226</td><td>T-Zell-Medienergänzung</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>T-Zell-Medienergänzung</td></tr><tr><td>Maus Interleukin-2 rekombinantes Protein</td><td>BPS Bioscience</td><td>90185-B</td><td>T-Zell-Medienergänzung</td></tr><tr><td>Forschungsqualität Fötales Rinderserum-Hyklon</td><td></td><td>SV30160.03</td><td>T-Zell-Medienergänzung</td></tr><tr><td>Herkunft (Analyseprogramm)</td><td>OrigenLab</td><td>http://www.originlab.com/</td> <td>nichtlineare Anpassung von zwei Parametern (Tauoff, [NTLAG])</td></tr></tbody></table>

mess tcr-pmhc binding<em&gt; in-situ-</em&gt; mit einem fret-mikroskopie assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-Zellen sind bemerkenswert spezifisch und effektiv bei der Erkennung von Antigenen in Form von Peptiden, die in MHC-Moleküle (pMHC) auf der Oberfläche von Antigen Presenting Cells (APCs) eingebettet sind. Und das, obwohl T-Zell-Antigenrezeptoren (TCRs) bei der Bindungsmessung in vitro in der Regel eine moderate Affinität (μM-Bereich) zum Antigen ausüben 1. In Anbetracht der molekularen und zellulären Parameter, die zur Empfindlichkeit von T-Zell-Antigenen beitragen, wurde eine mikroskopiebasierte Methodik entwickelt, um die TCR-pMHC-Bindung in situ zu überwachen, wie sie in der Synapse einer lebenden T-Zelle und einer künstlichen und funktionalisierten glasgestützten planaren Lipiddoppelschicht (SLB) auftritt, die die Zellmembran einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) nachahmt 2. Die Messungen basieren auf dem Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zwischen einem blau- und rotverschobenen Fluoreszenzfarbstoff, der an den TCR gebunden ist, und dem pMHC. Da die Effizienz von FRET umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Inter-Dye-Abstands ist, kann man FRET-Signale verwenden, um die synaptische TCR-pMHC-Bindung zu visualisieren. Die Empfindlichkeit des Mikroskopie-Ansatzes unterstützt die Detektion von Einzelmolekül-FRET-Ereignissen. Dies ermöglicht es, die Affinität und Off-Rate synaptischer TCR-pMHC-Wechselwirkungen zu bestimmen und damit die On-Rate der Bindung zu interpolieren. Analoge Assays könnten angewendet werden, um andere Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen in ihrer nativen Umgebung zu messen.

Die Aufzeichnung der intrazellulären Calcium über den Fura-2 Calciumfarbstoff sowie die anschließende Zellanalyse die stimulierende Wirkung und damit Funktionalität der SLBs sind in Abbildung 4 gezeigt, um zu verifizieren. Wie deutlich wird, steigen die Calciumspiegel in T-Zellen (wie die ausgedrückt normalisierten Fura-2 340 nm / 380 nm Verhältnis zum Ausgangswert gleich 1) sofort, sobald sie auf die stimulierende SLBs begleichen. Calcium-Spiegel wieder auf das Ausgangsniveau kurz nach der Zugabe eines Antikörpers, der Blöcke pMHCs von TCR Engagement und welcher endet T-Zell-Aktivierung. Figur 6 zeigt einen typischen Versuch mit FRET-Donor-Akzeptor Erholung nach Bleichen, das verwendet wird, um FRET Ausbeuten messen und die 2D-K D -Werte berechnet dient (in 4 gezeigt). Bitte beachten Sie die Zunahme der FRET-Donor Intensität, die TCR stellt über AF555 markiert, nachdem eine schnelle und vollständige Ablation des FRET eincceptor Arten (hier: AF647 mit pMHCs zugeordnet). Außerdem erkennt man die starke Verringerung des FRET-Kanal, dh dem FRET-Akzeptor-Kanal unter FRET Donoranregung nach FRET-Akzeptor Bleichen. Die kaum sichtbaren Restsignal entspricht Spenderdurchscheinen FRET. FRET Renditen innerhalb einzelner TCR Mikrocluster oder ganze Synapsen werden berechnet auf der Grundlage der angegebenen gemessenen Intensitätswerten (6B). Figur 7 zeigt eine Bahn und Zeitablauf eines einzelnen Moleküls FRET Ereignis in zwei Zeitrahmen sichtbar. Wie oben in der Einleitung dargelegt solches Verhalten wird sowohl durch Zerfall von synaptischen TCR-pMHC-Bindung und Photobleich verursacht. Um zwischen diesen beiden Beiträge zu unterscheiden, haben die Versuchserfassungszeitrahmen zu der Dauer variiert werden, während eine konstante Lichtbleichung verbleibt, werden Änderungen in FRET Ereignis Trajektorienlänge nur durch die Bindungskinetik verursacht. Eine Quantifizierung der tracelengths, w<html> hich die Grundlage für die Berechnung der in 7 gezeigt ist off-Raten und Bleich bildet, sind in den Tabellen 1 bis 3 zur Verfügung gestellt. Bestimmung der 2D-K D s erfordert Aufzeichnung von Groß FRET Renditen für FRET-Donor markierten TCRs. Mit der Verwendung des experimentell abgeleitete Konstante C (Abbildung 4) kann ein FRET-Ausbeute für eine TCR Microcluster oder eine ganze Synapse, gemessen in die TCR umgewandelt bezugs ein, dh das Verhältnis von pMHC-Eingriff und die Gesamt TCRs (4C) . Mit bekannten pMHC Dichten in der SLB vor der Zugabe der T-Zelle vorhanden ist, können a -Werte aufgetragen, um synaptische 2D-K D -Werte (4D) zu bestimmen. On-Raten können mit dem Massenwirkungsgesetz berechnet werden (2D-k on = 2D-k off / 2D-K D) von der fest synaptischen off-Rate und 2D-KD-Werte. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1 Schematische Darstellung der Lipiddoppelschicht-System planare Glasgestützten (SLB). (A) SLBs aus POPC (90-99%) und dem synthetischen Lipid DGS Ni-NTA (1-10%) zusammengesetzt und bilden sich spontan, wenn saubere Glasoberflächen mit kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) berechnet, die aus den entsprechenden Lipiden. (B) Einmal gebildet, können solche SLBs mit löslichen Polyhistidin-markierten extrazellulären Anteile von pMHCs abgeleiteten kostimulatorischen B7-1-Proteine ​​und ICAM-1-Adhäsionsproteine, funktionalisiert werden, um als APCs für T-Zellen dienen. Für weitere Informationen über die Vorbereitung SLBs siehe Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> zu 2. Förster Resonance Energy Transfer basierten Assay zu quantifizieren TCR-pMHC Bindung in situ. (A) eine Verbundstruktur aus einem TCR mit einer H57 einkettiges Fragment Eingriff eines pMHC komplexiert stellt die hierin beschriebene FRET-basierten Ansatz. Beachten Sie die kurze Entfernung von ca. 41A zwischen den beiden entsprechenden Fluorophore unterziehen FRET. Akzeptor-Stellen für die Fluorophor-Maleimide sind in grün und rot angezeigt. (B) Das Prinzip der Erfassung TCR-pMHC Wechselwirkungen in situ dargestellt. Nur scF V -Dekoriert TCRs und pMHCs (hier IE k), die spezifische Komplexe zu bilden, führen zu einer messbaren FRET-Signals. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &quot;/&gt; Abbildung 3. Die Chromatogramme der endgültigen Gelfiltrationsschritt was zu monomeren scF V s und Peptid-beladenen IE k -2x6H Moleküle. X-Achsen stellen Rückhaltevolumen in ml, Y-Achsen geben Absorption bei 280 nm in willkürlichen Einheiten (AU) . (A) H57 scF V ortspezifisch mit Alexa Fluor 555 maleimid bis S75 unterzogen, wobei nicht umgesetzte Farbstoff von dem Protein (Schritt 1.2.5) getrennt markiert. Fraktionen, die Retentionsintervall 14 bis 15 ml (gestrichelte Linien) darstellen monomeren H57 scF V markiert. (B), dh k -2x6H Moleküle mit der UV-spaltbare ANP-Abstandshalter-Peptid komplexiert war UV-bestrahlt wurden, mit ortsspezifisch Alex inkubiert 647 Maleinimid-markierten Peptids und schließlich zu S200 unterzogen, wobei das Protein aus freien Peptids (Schritt 1.1.2.4) zu trennen. Der Abstand zwischen den gestrichelten Linien enthält und richtig gefalteten monomeren pMHCs. (A, B) </strong&gt; 0,7 ml Probe wurde auf die Säule mit Beginn der rum (0 ml Punkt) aufgebracht. Gesammelten Fraktionen wurden eingeengt. Das Protein-zu-Farbstoff-Verhältnis wurde photospektrometrisch vor der Dialyse gegen PBS / 50% Glycerin bestimmt (für die Lagerung bei -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bestimmung 2D-K D s und 2D-k auf s. (A) Die Korrelation zwischen der FRET-Ausbeute von Geberrückgewinnung bestimmt, nachdem Akzeptor Bleichen und TCR Belegung wurde experimentell gemessen. TCR Belegung kann für einzelne TCR Mikrocluster bestimmt werden, wie in Abschnitt 4.2 erläutert. Eine lineare Anpassung der Daten wird durch die Linie angezeigt wird, gleich dem Verhältnis zwischen C TCR ist deren NeigungBelegung und die FRET-Ausbeute. C ist eine Konstante, spezifisch für den FRET-System und den Fluorophoren (hier Cy3 und Cy5) eingesetzt. In diesem Beispiel ergab 1.988. (B) FRET-Ertragsdaten wurden für die einzelnen TCR Mikrocluster ermittelt (N = 187, Temperatur = 24 ° C) durch Spenderrückgewinnung von Akzeptor-Bleichen. Zahlen unter Histogramm-Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (C) Die Umwandlung der in (B) gezeigten Daten durch Multiplizieren gemessenen FRET-Renditen mit der Konstante C bestimmt in (A). Zahlen unter Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (D) Histogramm (halblogarithmischen, base = 4), welches die Verteilung von 2D-K D s für einzelne TCR Mikrocluster gemessen. Die mediane 2D-K D wird blau angezeigt. Zahlen unter Balken zeigen die obere Grenze innerhalb des Intervalls. (E) Die in (D) gezeigt, Histogramm wurde int umgewandeltoa 2D-k auf -histogram (halblogarithmischen, Base = 4) unter Verwendung der synaptischen k off für 24 ° C (0,41 s -1). Der ermittelte Median 2D-k auf Wert wird blau angezeigt. Die Daten wurden ursprünglich in Huppa et al. 2 veröffentlicht und sind hier in einem neuen Format visualisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Abbildung 5. Funktionelle Validierung SLBs für T-Zellstimulation und Imaging beschäftigt. (A) TCR-transgene T-Zellblasten mit Fura-2 beladen waren mit stimulierenden SLB konfrontiert beherbergen gene pMHCs, ICAM-1 und B-7. Cellular Fura-2-Emission bei 340 nm und 380 nm angeregt sowie DIC Bilder wurden aufgezeichnet. Wie angegeben, Verhältniswerte der Emissionsintensitäten bei 34 erregt0 und 380 nm sind auf der rechten Seite angezeigt. Zugabe pMHC blockierende Antikörper 14 min in die Versuchsreihe führte zu einer Abnahme der intrazellulären Calciumspiegel vergleichbar mit derjenigen von ruhenden T-Zellen. (B) eine typische zeitliche Verlauf des durchschnittlichen Fura-2-Verhältnisse in T-Zellen in Kontakt stimulatorischen SLBs gekennzeichnet durch eine einem anfänglichen Anstieg des intrazellulären Calciums, die 2 bis 4 mal höher ist im Vergleich zu der nicht-aktivierten T-Zellen oder T-Zellen-Antigen nach der Antikörper-vermittelten Blockade beraubt. Grüne Kreise zeigen in (A) veranschaulicht den Zeitpunkten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Abbildung 6. Bulk-FRET-Ausbeuten durch FRET-Donor Erholung nach FRET-Akzeptor Bleichen gemessen. <strOng&gt; (a) ist ein Beispiel eines typischen synaptischen FRET-Messung. Wie auf der linken und auf der Oberseite angedeutet eine Reihe von Bildern mit der Verwendung eines Emissionsstrahlteiler, die zu einem FRET-Donor und ein FRET-Akzeptor-Kanal erworben (für nähere Informationen zu Strahlteiler siehe Axmann et al 4). Der in der linken Bild DIC gezeigte Linie zeigt die Begrenzung der T-Zell-Synapse. Beachten Sie den Intensitätsverlust in der FRET-Akzeptor-Kanal als auch der Anstieg der Intensität in der FRET-Donor Kanals nach FRET Akzeptorbleichen (Schritt 4). (B) FRET-Effizienz quantifiziert für einzelne synaptischen Regionen oder für ganze Synapsen bezeichnet werden. Zur Inspektion werden die Bilder vor und nach der FRET-Akzeptor Bleichen mit dem Einsatz von zwei Suchtabellen (LUTs, grün und Physik) angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </p&gt; <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Abbildung 7. Einzelmolekül-FRET-Ereignissen erscheinen und verschwinden insingle Schritte und sind perfekt mit einem einzigen FRET Akzeptor-Fluorophor ausgerichtet ist. Der Zeitablauf der Einzelmolekül-FRET-Event gezeigt. Bilder wurden mit einem rückseitig belichteten EMCCD Kamera erworben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Abbildung 8. Die Bestimmung τ off = 1 / k off aus gemessenen smFRET Trajektorien. (A) Die normierten kumulativen Summen beobachtbaren FRET-Signale (von H57 scF V -AF555 abgeleitet dekoriert 5c.c7 TCR transgene T-Zell-Blasten erkennen IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 bei 24 ° C) für vier verschiedene Zeitverzögerungen (42 msec, 490 msec, 1,007 ms 1,989 ms) wurden als Funktion der Gesamtzahl von Beobachtungen aufgetragen. Mono-exponentielle Anpassung Funktionen führen zu entsprechend den negativen Umkehrung der Erwartungswerte &lt;n (t lag)&gt;. (B) Prognose-Werte wurden gegen die Verzögerungen t lag aufgetragen und ausgestattet mit Hilfe der Gleichung &lt;n (t lag)&gt; = τ off / {(&amp; tgr; off / &lt;n bleichen&gt;) + t lag}, um τ ergeben aus und &lt;n bleichen&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Dieses Manuskript beschreibt, wie (Einzelmoleküle) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Assays durchgeführt werden, um die Bindungsdynamik zwischen T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) und antigenen, peptidbeladenen MHC-Molekülen zu messen, wie sie in der immunologischen Synapse einer T-Zelle in Kontakt mit einer funktionalisierten planar gestützten Lipiddoppelschicht auftreten.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

In diesem Video zeigen wir, wie man die Kinetik zwischen dem T-Zell-Antigenrezeptor und dem mit Peptiden beladenen major histocompatibility complex (PMHC) in C zwei innerhalb des immunologischen Synapses zwischen einer T-Zelle und einer planaren, unterstützten Lipiddoppelschicht misst. Wir führen Sie kurz durch wichtige Aspekte der Proteinproduktion und überprüfen die funktionelle Integrität der Lipiddoppelschicht mittels Kalzium-Flux-Messungen. Für detailliertere Informationen zur Herstellung der Lipiddoppelschicht und zum Aufbau eines Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskops verweisen wir auf unseren parallelen Beitrag im Journal of Visualized Experiments. Anschließend erläutern wir ausführlich, wie man Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen durchführt und analysiert.Um die Kinetik der synaptischen Bindung des T-Zell-Rezeptors an das PMHC abzuleiten und unsere auf FRET basierende Strategie innerhalb unseres Gesamtansatzes zu erklären, beginnen wir mit der Kristallstruktur des T-Zell-Rezeptors oder TCR, hier in Blau dargestellt, während er sein Antigen, das peptidbeladene MHC-Molekül oder PMHC, in Gelb und Rot dargestellt, bindet. Wir führen außerdem ein einzelnes Kettenfragment der variablen Domänen aus einem T-Zell-Rezeptor-Beta-reaktiven Antikörper namens age 57 ein. Für quantitative, auf FRET basierende Messungen ist es zwingend erforderlich, sowohl den FRET-Donor, in unserem Fall das einzelne Kettenfragment, als auch den FRET-Akzeptor, das PMHC, ortsspezifisch zu markieren.Dies ist bei rekombinanten Proteinen durch die Einführung einer nicht gepaarten Cystein-Gruppe möglich, die anschließend kovalent an miteinander konjugierte Fluorophore gebunden werden kann. Wie gezeigt, verknüpfen wir den Donor-Farbstoff Alexa Fluor 555 oder Side Three mit dem einzelsträngigen Fragment und den FRET-Akzeptor Alexa Fluor 647 oder SI Five mit dem C-Terminus des MHC-gebundenen Peptids.Der Indy-Abstand, wie in dieser zusammengesetzten Struktur gezeigt, beträgt etwa 41 Ångström, noch weniger als der erste Radius, der Abstand der halbmaximalen Energietransferleistung zwischen den beiden Farbstoffen. In unseren Experimenten verwenden wir planare, glasgestützte Lipiddoppelschichten als Ersatz-Antigen-präsentierende Zellen. Diese sind mit PMXC, dem Ligandenmolekül B sieben eins und dem Adhäsionsmolekül I chem eins, funktionalisiert.Auf diese Weise kann die Bildgebung im Totalreflexions-Fluoreszenzmodus durchgeführt werden, der Fluor-Kräfte nahe der Grenzfläche anregt und dadurch das zelluläre Hintergrundsignal erheblich reduziert. FRET ist nur nachweisbar, wenn einzelne, markierte TCR-Fragmente an in der Schicht eingebettete PM-HCS binden. Dies ermöglicht es uns, die T-Zell-Rezeptor-PM-HC-Bindung zu visualisieren und anschließend die Bindungskinetik in C zwei korrekt gefalteten histogenen Takt zu berechnen.Die extrazellulären Anteile von P seven one und I chem one werden aus Überständen von Insektenzellkulturen gereinigt, die mit dem entsprechenden BUC-Virus infiziert wurden. Die Reinigung erfolgt in drei Schritten, beginnend mit Nickel-Anti-Aros-Affinitätschromatographie, gefolgt von Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie. Histo-Tag-MHC-Klasse-zwei-Heterodimere werden in E. coli als Einschlusskörper exprimiert und in vitro bei vier Grad Celsius sowie in Gegenwart eines Platzhalterpeptids durch schnelle Verdünnung in Redoxpuffer umgefaltet.Das Platzhalter-Peptid wird später durch Bestrahlung mit UV-Licht gespalten. Richtig gefaltete pMHC-Komplexe werden anschließend gereinigt und vom Platzhalter getrennt. Das Peptid wird bei pH 5,2 gespalten und durch das fluoreszierende Peptid ersetzt.Das Endprodukt wird nach der Größe gereinigt. Das einzelne Kettenfragment wird mit einer nicht gepaarten Cystein-Gruppe als Einschlusskörper in E. coli exprimiert, in vitro durch stufenweise Dialyse umgefaltet und nach der Größe gereinigt. Anschließend wird es über die nicht gepaarte Cystein-Gruppe mit einem maleinimidkonjugierten Farbstoff markiert und erneut nach der Größe gereinigt.Alle rekombinanten Proteine werden abschließend gegen PBS mit 50 % Glycerol dialysiert, auf eine Konzentration von einem Milligramm Protein pro Milliliter angereichert und bei Minus 20 Grad Celsius zur Langzeitlagerung aufbewahrt. Verwenden Sie den ratiometrischen URA3-Farbstoff, um die intrazellulären Kalziumspiegel in T-Zellen zu messen und so die stimulatorische Wirksamkeit des Lipidblatts zu überprüfen. Beladen Sie die T-Zell-Blasten mit dem URA3-AM-Ester.Dieses Verbindung gelangt über seine AM-Gruppe in die Zellen, wird dort jedoch durch die Wirkung von Esterasen festgehalten, die den AM-Anteil abspalten. Fügen Sie Fura 2:00 AM zu etwa 3 Millionen T-Zellen in einer Endkonzentration von fünf Mikromol pro Liter hinzu. Überführen Sie die Zellen von der 24-Loch-Platte in ein neues Röhrchen und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Zellen einmal in Imaging-Puffer, der Hank’s Pufferlösung mit Salz enthaltend Kalzium und Magnesium sowie 1 % Albumin enthält. Zur Überwachung des intrazellulären Kalziums verwenden Sie ein automatisiertes, UV-fähiges inverses Mikroskopsystem. Starten Sie das Zeitmessprotokoll und geben Sie weniger als zwei beladene T-Zellen auf die funktionalisierte Lipiddoppelschicht, die sich im Fokus auf dem Mikroskopständer befindet. Erfassen Sie in regelmäßigen Zeitabständen ein DIC-Bild sowie zwei Fluoreszenzbilder, die mit 340 und 380 Nanometer UV-Licht angeregt werden.Sofort nach Herstellung des Bilayer-Kontakts weisen die T-Zellen erhöhte Kalziumspiegel auf, was durch das URA-Zwei-Verhältnis 15 Minuten nach Versuchsbeginn angezeigt wird. Geben Sie einen blockierenden Antikörper zu den Zellen hinzu, der alle pMHC-Antigene saturiert. Daraufhin sinken die intrazellulären Kalziumkonzentrationen auf das Niveau der nichtaktivierten Zellen ab, das später als Referenz dient.Sobald die vorhandenen Konzentrationen des blockierenden Antikörpers auf einen Wert abnehmen, der den nichtaktivierten Zustand widerspiegelt – den wir für FRET-Messungen auf eins normieren –, müssen T-Zellen für jedes Experiment mit einem TCR-reaktiven, einzelketten Fragment-FRET-Sonde gefärbt werden. Überführen Sie etwa eine Million Zellen in ein Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 400 × g. Entsorgen Sie das Medium und entfernen Sie verbleibende Tropfen, indem Sie das Röhrchen mit einem Papiertuch an den Innenwänden abtupfen. Dies gewährleistet ein minimales Inkubationsvolumen von etwa 30 Mikrolitern, wie bereits erwähnt.Das FRET-Probe wird bei einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter und 50 % Glycerin bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Sie wird ortsspezifisch mit entweder Alexa, Fluor 555 oder Atto 5 zu einem Proteinverhältnis von 1:0,3 markiert. Geben Sie 0,3 Mikroliter der Sonde zu den Zellen. Klopfen Sie das Pellet vorsichtig mehrmals an und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten auf Eis. Waschen Sie die Zellen in eiskaltem Imaging-Puffer. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang einmal. Inkubation, Zentrifugation und Lagerung bei niedriger Temperatur stellen sicher, dass T-Zellen die fluoreszierende Sonde nicht internalisieren, während sie dieser ausgesetzt sind.Dies würde zu einer erhöhten Hintergrundfluoreszenz führen. Außerdem verlieren T-Zellen die Sonde während des Waschens und der Lagerung bei Kälte nicht, bevor die Kammer mit dem Lipiddoppelschichtträger auf den Mikroskopständer gebracht wird. Ersetzen Sie das PBS nacheinander durch Imaging-Puffer und vermeiden Sie unter allen Umständen eine Belüftung der Lipiddoppelschicht, da dies diese zerstören würde.Um den zellulären Hintergrund zu reduzieren, verwenden wir eine Streifenausleuchtung. Dazu positionieren wir den Anregungsstrahl im kritischen Winkel, bei dem Totalreflexion auftritt. Schalten Sie die Anregung aus, schalten Sie das Breitfeldlicht ein und geben Sie die T-Zelle in die Ltec-Kammer, damit sie sich auf dem Lipidfilm absetzen kann.Schalten Sie die Anregung ein und fokussieren Sie eine nicht-turfartige Beleuchtung. Die Zellmembran erscheint als Ring entlang der optischen Achse in jeder Fokusebene; im Turf ist lediglich die basale Membran, die mit der Doppelschicht in Kontakt steht, sichtbar. Fokusebenen darüber werden nicht mehr angeregt und sind daher nicht sichtbar.Das Zeitungsprotokoll beginnt mit den roten und grünen Anregungsimpulsen zur Abbildung von pMHC und TCR, gefolgt von einem roten Bleichimpuls, um den P-M-H-C-F-Akzeptor abzulösen. Ein grüner Impuls zur Abbildung des TCR nach der F-Farbstoff-Akzeptor-Bleichung und ein roter Impuls zur Überprüfung der Akzeptor-Ablation werden auf einer Zeitskala von weniger als einer Sekunde durchgeführt, mit dem kürzestmöglichen Abstand zwischen dem ersten und zweiten grünen Impuls. Optional kann am Anfang ein DIC-Bild aufgenommen werden; eine zweifarbige Bildaufspaltung ermöglicht die gleichzeitige Detektion des gespendeten Donors und des gespendeten Akzeptorkanals.Die angeregte Akzeptoranregung zeigt die Anreicherung von pMHC in der T-Zell-Synapse. Dieses Vorab-Bild bestätigt das Vorhandensein von pMHC und weist bereits auf TCR-vermittelte pMHC-Bindung hin. Anregend. Der Akzeptor liefert Bilder in beiden Kanälen.Das Signal des angeregten Donorkanals ist aufgrund des Energieübergangs in den F-Akzeptorkanal teilweise in der Intensität vermindert. Das Signal des FRET-Akzeptorkanals setzt sich aus FRET-Übersprechen des angeregten Donors und einer Kreuzanregung des FRET-Akzeptors zusammen. Auf jeden Fall wird dieses Bild nicht für die Analyse verwendet.Im vorliegenden Protokoll folgt ein schneller Bleichschritt, der alle akzeptierten Fluorophore des F-Donors eliminiert. Die Intensität des F-Donor-Bildes nach akzeptablem FRET-Bleichen wird nun ohne Intensitätsverlust in den FRET-Kanal auf höhere Werte wiederhergestellt.Die folgende FRET-Akzeptorerwartung überprüft die vollständige F-Fettsäure-Akzeptor-Bleichung. Vergrößern wir die Synapse, um die erholte Donorfluoreszenz zu quantifizieren. Bestimmen Sie die durchschnittliche Hintergrundintensität, die unabhängig vom FRET-Akzeptor konstant bleibt.Photobleichen Sie anschließend und bestimmen Sie die durchschnittliche Intensität der Synapse sowie die einer repräsentativen TCR-Cluster. Die FRET-Ausbeute wird dann berechnet, indem die Differenz vor und nach der Ablation des Akzeptors normalisiert wird. In unserem Beispiel messen wir 16 % FRET für die gesamte Synapse und 26 % FRET für die repräsentative Cluster.TCR-Cluster-FRET-Ausbeuten werden später in TCR-Besetzungen umgewandelt, die zweidimensionale synaptische Dissoziationskonstanten aus Einzelmolekül-Daten ergeben. Dies ermöglicht es uns, die Kinetik der synaptischen TCR-Peptid-MHC-Bindung für Einzelmolekül-F-Threat-Experimente abzuleiten. Wir verwenden dieselben Reagenzien und dieselbe Markierungsstrategie wie zuvor.Jedoch, um sicherzustellen, dass wir tatsächlich die Interaktion zwischen einem einzelnen T-Zell-Rezeptor und einem einzelnen Peptid-MHC beobachten, entscheiden wir uns dafür, das folgende Kriterium zu erfüllen. Ein Kandidatenereignis für ein einzelnes Molekül-FRET muss umgangssprachlich mit dem einzelnen FRET-Akzeptor- oder FRET-Donormolekül übereinstimmen. Hier verwenden wir ein einzelnes pMHC als FRET-Akzeptormolekül, um die Einzelmolekül-Natur des beobachteten FRET-Ereignisses zu verifizieren, aber mit umgekehrter Logik.Die Verwendung von „fed“-Akzeptoren in höheren Knöpfen und Fred-Donatoren in niedrigen Knöpfen ist durchaus eine Option. Üblicherweise beleuchten wir T-Zellen, die eine stimulatorische Lipid-Doppelschicht kontaktieren, mit 514 und 647 Nanometer Anregungslicht, wobei sequenzielle und wiederholte Anregung von Donator und Akzeptor mit einer minimalen Zeitverzögerung von einer Millisekunde erfolgt, gefolgt von einer Verzögerungszeit, die je nach Anforderungen des Experiments variiert werden kann.Um innerhalb von Millisekunden nach der Anregung ein ausreichend starkes fluoreszentes Signal für die Detektion einzelner Die zu erhalten, müssen wir hohe Anregungsleistungsdichten im Bereich von ein bis fünf Kilowatt pro Quadratzentimeter anwenden. Aufgrund von Photobleichen sinkt die Anzahl sichtbarer PMHC-FRET-Akzeptormoleküle schnell auf ein Niveau, bei dem einzelne FRET-Akzeptor-Fluorophore in einer Doppelschicht mit 30 oder mehr markierten PMHCs pro Quadratmikrometer unterscheidbar werden. Ein Beispiel hierfür wird bei einer Gesamtverzögerungszeit von 42 Millisekunden gezeigt.Ein einzelnes, mit einem roten Kreis markiertes FRET-Ereignis wird im zweiten und dritten Zeitpunkt sichtbar. Es lokalisiert sich zusammen mit einem einzelnen S5-Molekül, das mit einem grünen Kreis markiert ist. In diesem Beispiel weist das beobachtbare FRET-Ereignis eine Spurlänge von zwei auf; sammeln Sie weitere Einzelmolekül-FRET-Spuren, wie in der Tabelle gezeigt, insgesamt 128 Spuren.Berechnen Sie anschließend die komplementäre kumulative Summe der Spuren, wie durch die grünen Zahlen gezeigt, und normalisieren Sie diese, wie im Diagramm dargestellt. Tragen Sie die normalisierten Werte auf und passen Sie sie mit einer monoexponentiellen Funktion an. Der Erwartungswert liegt etwas über 1,5 Zeitrastern. Dieser Wert hängt von der TCR-Peptidbindung, der MHC-Bindung und der Photobleiche ab. Um zwischen diesen beiden Beiträgen unterscheiden zu können, muss der Erwartungswert daher für mindestens drei verschiedene Zeitpunkte berechnet werden.Die Verzögerungen zeigen nun alle Erwartungswerte in Abhängigkeit von den jeweiligen Zeitverzögerungen und passen die Datenpunkte an die hier dargestellte Funktion an, die die Lebensdauer mit 2,12 Sekunden und den Erwartungswert für PHOTOBLEICHUNG f Fred enthält. Die Wiederherstellung des Donors nach akzeptablem Bleichen von f Fred, wie hier und zuvor detaillierter gezeigt, kann verwendet werden, um in nur wenigen Schritten die zweidimensionalen Dissoziationskonstanten zu bestimmen, wie sie innerhalb der immunologischen Synapse wirksam sind.Hier konzentrieren wir unsere Analyse auf die TCR-Bindung und TCR-Cluster, bei denen die T-C-R-P-M-H-C-Bindung am ausgeprägtesten ist. Wie aus den gezeigten Messungen hervorgeht, variieren die F FRED-Werte erheblich. Für einzelne TCR-Cluster.Die Multiplikation von F_fred mit dem Proportionalitätsfaktor C führt zur TCR-Besetzung, einem Begriff, der das Verhältnis zwischen der Anzahl gebundener pMHC-TCR-Komplexe und ihrer Gesamtanzahl beschreibt. C muss einmalig für einen bestimmten Satz von FRE-Paaren und das verwendete FRE-System bestimmt werden. Gegen Ende dieser Präsentation erläutern wir detaillierter, wie C beispielsweise unter Verwendung von SI drei und SI fünf, die spezifisch am TCR-reaktiven einzelketten Antikörperfragment und am C-Terminus des MHC-gebundenen Peptids platziert sind, bestimmt wird. Dies entspricht etwa zwei synaptischen, zweidimensionalen Dissoziationskonstanten, die aus der als A bezeichneten TCR-Besetzung und der anfänglichen Dichte der auf der Lipid-Bilayer vorhandenen pMHCs berechnet werden können.Die dargestellte Beziehung leitet sich aus dem Massenwirkungsgesetz ab und wird im Artikel, der diesem Film beiliegt, ausführlicher erläutert. In unserem Beispiel beträgt die anfängliche Dichte der pmcs 30 Moleküle pro Quadratmikrometer. Wir gelangen zu einer Verteilung der 2D-kds, die in der T-Zell-Synapse wirksam sind, mit einem Medianwert von etwa 34 Molekülen pro Quadratmikrometer.Die Assoziationsratenverteilung kann aus der synaptischen 2D-KD-Verteilung und der entsprechenden Dissoziationsrate hier, 0,41 pro Sekunde, berechnet werden, wie mittels Einzelmolekül-FRET-Spurenanalyse bei 24 Grad Celsius bestimmt wurde. Der Medianwert beträgt etwa 0,01 Quadratmikrometer pro Molekül pro Sekunde. Zusammenfassend ermöglichen FRET-Messungen zwischen T-Zell-Rezeptor und peptidbeladenem MHC eine umfassende Analyse aller kinetischen Parameter, die die Reaktionsdynamik in C zwei beschreiben.Diese Methodik kann prinzipiell auf die Analyse anderer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen verallgemeinert werden, da diese möglicherweise für die Erkennung zwischen Zellen von zentraler Bedeutung sind. Nicht zuletzt erläutern wir, wie die Konstante C experimentell bestimmt werden kann, die zur Umrechnung von Fett-Ausbeuten in TCR-Besetzungen erforderlich ist. Dieses Verfahren muss nur einmal durchgeführt werden.Die bestimmte Konstante C kann anschließend für alle folgenden Experimente verwendet werden, bei denen dasselbe FRET-System mit denselben Fluorophoren eingesetzt wird. In diesem Verfahren leiteten wir im Wesentlichen die in einzelnen TCR-Clustern gemessenen FRET-Ausbeuten, basierend auf der Donator-Rekuperation nach Akzeptor-Photobleaching, auf die entsprechenden Intensitätswerte um, die im sensitisierten FRET-Kanal detektiert wurden. Wie zuvor erörtert, wird die FRET-Ausbeute aus den hintergrundkorrigierten FRET-Donator-Kanal-Bildern vor und nach der Ablation des FRET-Akzeptors bestimmt.Der sensibilisierte FRET-Kanal muss mit dem F-Donator-Kanal sowie in X- und Y-Richtung ausgerichtet und auf Hintergrund korrigiert werden. Hier gezeigt sind die Durchmischung des Fred-Donators und die Kreuzanregung des Fred-Akzeptors. Eine detaillierte Beschreibung, wie die Durchmischung des Fred-Donators und die Kreuzanregung des Fred-Akzeptors korrigiert werden, ist in dem Artikel enthalten.Begleitend zu diesem Video berechnen Sie nun für jeden TCR-Cluster das Verhältnis des Bug-Signals des korrigierten FRET-Bildes und des entsprechenden korrigierten FRET-Donatorbildes. Bestimmen Sie das korrigierte durchschnittliche Signal für einzelne FRET-Donatoren und Einzelmolekül-FRET-Ereignisse und berechnen Sie das Verhältnis. Die TCR-Besetzung wird dann durch Multiplikation beider Verhältnisse ermittelt.Tragen Sie nun die für einzelne TCR-Cluster bestimmten FRET-Ausbeuten gegen deren TCR-Besetzungen auf. C wird dann durch lineare Regression bestimmt, wie hier gezeigt. In unserem Beispiel beträgt es rund zwei.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, eine mit Proteinen funktionalisierte Lipiddoppelschicht in Kombination mit Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zu nutzen, um die synaptischen Bindungskinetiken zwischen pMHC und TCR zu messen. Alle notwendigen Schritte, einschließlich der Proteinproduktion, der Markierung von T-Zellen und der abschließenden FRET-Messungen, wurden besprochen. Außerdem wurde die Bildanalyse detailliert gezeigt, die zu Aktivierungskurven von T-Zellen und FRET-Werten führt.Schließlich wurde die Methodik zur Bestimmung der kinetischen Bindungs- und Dissoziationsraten vorgestellt. Im Prinzip kann ein analoger Ansatz verwendet werden, um andere synaptische Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei jedoch gegebenenfalls geeignete Modifikationen erforderlich sein könnten.

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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IP-FCM: Immunpräzipitation mittels Durchflusszytometrie Detected

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Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

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