Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen Plasmodium falciparum

Humane microRNAs translozieren von Wirts-Erythrozyten zu Plasmodium falciparum-Parasiten. Im Folgenden werden die Techniken beschrieben, mit denen synthetische microRNAs in Erythrozyten des Wirts transfiziert und alle RNAs aus P. falciparum isoliert werden. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von Polysomen in P. falciparum beschrieben, um die ribosomale Belegung und das translationale Potenzial von Parasitentranskripten zu bestimmen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Rolle von Erythrozyten-microRNAs bei der posttranskriptionellen Genregulation von Plasmodium falciparum-Transkripten zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Malaria zu beantworten, z. B. wie RNA-Spleißereignisse mit kleinen RNAs des Wirts oder Parasiten das Translationspotenzial von Fusions-mRNAs beeinflussen können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Gesamt- und kleine RNAs zusammen in einem Pool zu erfassen, was das Vorhandensein von kleinen RNAs und Fusions-RNAs in einer Zelle demonstriert.

Darüber hinaus nutzt dieses Verfahren das Polysomen-Profiling, um zu zeigen, wie diese kleinen RNAs die Translation ihrer Fusions-mRNA-Produkte beeinflussen. Zu Beginn wird die Transfektion von 300 Mikrolitern roter Blutkörperchen in vollständigem Malariamedium bei 800 mal G für fünf Minuten eingerichtet. Waschen Sie die Erythrozyten zweimal mit RPMI-Medium, resuspendieren Sie die Zellen in einer vollständigen Zytomischung bei 50% Hämatokrit.

Übertragen Sie anschließend die Zellen in ein Elektroporationsvete und fügen Sie 10 Mikrogramm DYS th Biotin konjugierte Mikro-RNA oder eine unkonjugierte Negativkontroll-Mikro-RNA hinzu. Um die Zellen zu elektroporieren, legen Sie das Vete in ein elektroporiertes und geben Sie einen einzelnen Impuls ab. Dann plattieren Sie die Zellen und infizieren Sie sie nach vier Stunden mit Plasmodium falciparum, wie im Textprotokoll beschrieben.

Geben Sie dann 50 Mikroliter verpacktes, abgestreiftes Avid und Kügelchen zu 10 Mikrogramm Parasiten-RNA in ein Mikrozentrierröhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie den Streifen Davan und die Kügelchen 30 Sekunden lang bei 800 mal G und waschen Sie dann das Pellet mit 500 Mikrolitern RNP-Puffer, der eine Verdünnung des RNA-Inhibitors von eins bis 1000 enthält. Als nächstes eluieren Sie die RNA aus den Kügelchen durch Resus und suspendieren sie in 200 Mikrolitern RNA.

Fangen Sie den Elutionspuffer auf, der überschüssiges Biotin enthält. Inkubieren Sie die Kügelchen über Nacht bei vier Grad Celsius mit Rotation. Zentrifugieren Sie dann die Kügelchen 30 Sekunden lang bei 800 mal G und sammeln Sie die überstehende RNA.

Es ist wichtig, mit einem Überschuss an Biotin zu eluieren und die minimale Menge an Streptokokken und Kügelchen zu verwenden, um eine ordnungsgemäße spezifische Elution zu gewährleisten. Dadurch wird die RNA-Anreicherung im Hintergrund reduziert. Bestimmen Sie schließlich den Grad der Anreicherung von P falciparum-Transkripten und der Mikro-RNA-Anreicherung durch quantitatives R-T-P-C-R, wie im Textprotokoll beschrieben, um mit der Polysomentrennung zu beginnen.

Geben Sie zuerst fünf Milliliter einer 50%igen Saccharoselösung in ein Ultrazentrifugenröhrchen. Schichten Sie dann vorsichtig fünf Milliliter einer 15%igen Saccharoselösung über die 50%ige Lösung. Verschließen Sie anschließend das Gradientenrohr mit Perfil und kippen Sie das Rohr vorsichtig, bis es waagerecht auf der Tischplatte liegt.

Stellen Sie sicher, dass sich das Rohr in einer stabilen Position befindet, um ein Rollen zu verhindern. Halten Sie die Röhre mindestens zwei Stunden lang in dieser Position, damit sich der Gradient bilden kann. In der Zwischenzeit werden ca. 100 Milliliter einer asynchronen Kultur von mit Plasmodium infiziertem Blut bei drei bis 5% Persit entnommen.

Fügen Sie dann 10 Milliliter Nährmedium hinzu, das zwei millimolare Cyclo und Heide enthält, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen sieben Minuten lang bei 500 mal G und waschen Sie sie dann zweimal mit 80 Millilitern PBS mit 200 mikromolaren Cycloheide-Resus. Suspendieren Sie das Pellet in PBS mit Cycloheximid und legen Sie es auf Eis.

Pelletieren Sie die Zellen und entfernen Sie den Überstand, um das Pelletvolumen zu schätzen. Anschließend werden die Zellen in einem Endvolumen von 4,25 Millilitern Lyse lyziert, gepuffert und 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit Rotation inkubiert. Frühere Versuche des Polysomen-Profilings und der Malaria verursachenden Spezies zeigten hauptsächlich Monos, da die Komponentenlyse zum Abbau von Polysomen in Monozonen führt.

Hier verwenden wir einen Lysepuffer, der die Erythrozyten und Parasiten gleichzeitig lysiert, um das Polysomenmuster von Plasmodium falciparum zu erhalten, das Lysat in Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen und dann 10 Minuten lang bei 16.000 Mal G bei vier Grad Celsius zu drehen. In ein separates vorgekühltes Fünf-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen 1,25 Milliliter kalte 0,5-molare Saccharose-Kissenlösung mit einer Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel geben. Schichten Sie vorsichtig 3,75 Milliliter des Lysatüberstands über das Saccharosekissen.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 366.000 mal G bei vier Grad Celsius für 146 Minuten. Während dieser Zeit bringen Sie das mit Saccharose erschlagene Ultrazentrifugenröhrchen langsam wieder in eine vertikale Position und lassen Sie es mindestens 15 Minuten auf Eis stehen. Nachdem Sie das Lysat aus der Ultrazentrifuge entfernt haben, sammeln Sie den Überstand vorsichtig in einem konischen 15-Milliliter-Zweizylinder

Lagern Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius, um die von den Ribosomen ungebundene RNA-Fraktion zu erhalten. Als nächstes resuspendieren Sie das Ribosomenpellet in 500 Mikrolitern Resus-Suspension, puffern es, indem Sie es fünf Minuten lang pipettieren, um die Probe zu mischen, zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Um unlösliches Material zu entfernen, entfernen Sie vorsichtig die Param-Dichtung auf dem Gradientenröhrchen, um eine Störung des Gradienten zu vermeiden, und schichten Sie dann die ribosomale Suspension mit einer Spritze und einer 27-Gauge-Nadel darüber.

Nachdem Sie das Röhrchen 180 Minuten lang bei 200.000 Mal G bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, lagern Sie die Gradienten bei vier Grad Celsius, bis sie auf den Fraktionator geladen werden können. Legen Sie ein leeres Ultrazentrifugenröhrchen in den Gradientenfraktionator und waschen Sie das System fünf Minuten lang mit RNA-freiem Wasser. Stellen Sie während des Waschvorgangs die Empfindlichkeit des UV-Absorptionsdetektors auf 254 Nanometer bis 0,2 ein.

Dies muss jedoch je nach Signal angepasst werden. Stellen Sie als Nächstes das Basissignal auf Null, während Wasser durch den Detektor fließt. Kehren Sie nach dem Waschen des Kollektors den Flüssigkeitsfluss durch den Fraktionator um, um die Leitungen zu entleeren, und entfernen Sie dann das leere Ultrazentrifugenröhrchen.

Lassen Sie eine 60%ige Saccharoselösung durch den FRAKTIONATOR laufen, bis sie aus dem Nadelgerät austritt. Platzieren Sie dann das beladene Gradientenrohr oben in der Ladekammer und ziehen Sie die Dichtung fest. Stechen Sie mit der Nadel in den Boden des Rohrs.

Setzen Sie dann die Strömungsgeschwindigkeit des Fraktionators auf 12,5 x 10 zurück und sammeln Sie 18-Sekunden-Fraktionen in Mikrozentrifugenröhrchen. Starten Sie den Vorlauf der 60%igen Saccharoselösung, um die Fraktionen zu eluieren, bevor der erste Tropfen der Gradientenlösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen gelangt. Beginnen Sie sowohl mit der Erfassung als auch mit der Live-Aufzeichnung der Absorption bei einem Signal von 254 Nanometern.

Wenn das Absorptionssignal an der Grenzfläche von 50%iger und 60%iger Saccharoselösung stark abfällt, stoppen Sie den Durchfluss und die Aufnahme. Lagern Sie die Gradientenfraktionen bei minus 80 Grad Celsius. Kehren Sie dann den Flüssigkeitsfluss um, bis sich die 60%ige Lösung aus dem Ultrazentrifugenröhrchen entleert.

Entfernen Sie das Rohr und beginnen Sie mit der Analyse des nächsten Gradienten. Die Transfektion der roten Blutkörperchen mit microRNA 4 5 1, gefolgt von der Wiederherstellung der biotinylierten micro NA mRNA-Hybride, zeigte eine Anreicherung der PKAR-Fusionstranskripte. Eine Scheintransfektion oder eine nicht verwandte microRNA-Transfektion reicherte das PKAR-Transkript nicht an.

Die Daten zeigen die elucianischen Peaks der ribosomalen Untereinheiten 40 s und 60 s, des a DS-Ribosoms und der Polysomenfraktionen, die die angegebene Anzahl von Ribosomen enthalten. Die Ribosomen waren mit den Transkripten assoziiert, die aus PCI isoliert wurden, die sich in roten Blutkörperchen befinden. Die Blutanalyse des Nordens zeigte, dass die Ribosomen und das Polysom mit dem 18 S und dem 28 SRNA assoziiert waren.

Neben diesem Verfahren können weitere Methoden wie der R-Nasen-H-Verdau, Ribonuklease-Schutz-Assays und Northern-Blotting durchgeführt werden, um das Vorhandensein von microRNA-MR zusätzlich zu validieren. NA-Fusionen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man microRNAs in Erythrozyten transfiziert und anschließend kleine RNAs mit Gesamt-RNA, einschließlich chimärer Transkripte, einfängt. Sie sollten auch in der Lage sein, Polysomen zu rekonstruieren, um die ribosomale Belegung und damit das translationale Potenzial dieser Fusionstranskripte zu bestimmen.