Name: Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie die physische Isolierung von Endosporen aus Umweltproben durch gezielte Lyse vegetativer Zellen. Diese nicht-destruktive Methode ermöglicht nachfolgende Kultivierung und molekulare Analysen.

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Die Autoren danken dem Schweizerischen Nationalfonds Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 und No. 151948 und Fundation Pierre Mercier Pour La Science.

1. Herstellung von Chemikalien und Geräte <ol><li> Bilden 500 ml einer 1% Natriumhexametaphosphat (SHMP) (NaPO 3) n-Lösung und durch Autoklavieren sterilisieren. </li><li> Sterilisieren Nitrocellulose (NC) Filter (Porengröße 0,22 um, Durchmesser 47 mm) durch Autoklavieren in geschlossenen Glaspetrischalen. </li><li> Sterilisieren NC-Filter (Porengröße 0,22 um, Durchmesser 25 mm) durch Autoklavieren in geschlossenen Glaspetrischalen. </li><li> Wiegen und beachten Sie das Leergewicht von sterilen 50-ml-Röhrchen (mit Kappe auf) (ein Röhrchen je Probe). </li><li> Vorbereitung Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer) 1x: make Lösung von 10 mM Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) und 1 mM EDTA Puffer. PH-Wert auf 8 und durch Autoklavieren sterilisieren. </li><li> Vorbereitung Lysozymlösung (20 mg / ml) durch Auflösen von 0,02 g Lysozym in 1 ml TE-Puffer. Im Idealfall machen frische jeder Zeit. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 Woche. </li><li> Vorbereitung physiologischen Lösung durch Lösen von 8 g / l Natriumchlorid(NaCl) in destilliertem Wasser. Durch Autoklavieren sterilisieren. </li></ol> 2. Trennung von Biomasse aus Sediment <ol><li> In 3 g Sedimentprobe, um vorher gewogenes steriles 50-ml-Röhrchen unter Verwendung von Ethanol-geflammt Metall Messlöffel. Führen Sie dies in einer sauberen, UV sterilisiert Biosicherheitswerkbank, um Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> 15 ml einer 1% igen sterilen (autoklaviert) SHMP Lösung zu der Probe unter Verwendung eines sterilen Bürette gefüllt. Die SHMP Lösung kann auch gefiltert, um Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> Homogenisieren das Sediment und SHMP-Lösung mit einer Flüssigkeit Dispergierer / Homogenisator (zB Ultra-Turrax-Homogenisator). 70% Ethanol-sterilisiert oder autoklaviert Dispergierlaufrades vor der Verwendung. Führen Sie die Homogenisierung für 1 min bei 17.500 Umdrehungen pro Minute. Ließ die Probe für 2 Minuten ruhen und wiederholen die Homogenisierung für 1 min bei der gleichen Rotordrehzahl. </li><li> Lassen Sie die Probe stehen für 10 min. Bei diesem Schritt werden die schwersten Teilchen (Mineralien) zu begleichen. Die Zellen und alle organischen Bestandteile der Probe jedoch wschlecht in Lösung bleiben. Danach den Überstand (enthaltend Zellbiomasse) in ein sauberes 50-ml-Tube, während kümmert sich nicht um das Sediment Pellet stören. </li><li> Um das Sediment Pellet hinzuzufügen erneut 15 ml einer 1% igen sterilen (autoklaviert) SHMP-Lösung mit einem sterilen Bürette. Dann wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4. Diese Wiederholung sorgt für die Trennung von der maximalen Anzahl von Zellen und organische Teilchen aus der Mineralkomponente des Sediments. Der Überstand dieser zweiten Trennung kann mit dem Überstand aus der ersten Trennzusammengeführt werden. Hinweis: Die folgenden Schritte werden alle auf dem Überstand durchgeführt (die Zellbiomasse). Die mineralische Komponente (Sediment Pellet) kann verworfen werden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 20 g für 1 min. Dieser Schritt erhöht die Beschleunigungskraft genug, um kleine Mineralpartikel absetzen, während die biologischen Zellmaterials noch in Lösung bleibt. Nach dem Zentrifugieren den Überstand (enthaltend Zellbiomasse) in einesauberes 50-ml-Tube. Entsorgen Sie die Mineral Pellet. </li><li> Bestimmen das endgültige Volumen der Lösung, die Biomasse durch Wiegen der Probe. Die Gewichtsbestimmung wird vermieden, daß die Probe in einem Messzylinder übertragen und reduziert die Gefahr einer Kontamination. </li></ol> 3. Sammlung von Biomasse auf Filter Membrane <ol><li> Bereiten Filtrationseinheit (47 mm Durchmesser Membranen) und Vakuumpumpe. Sterilisieren Sie die Filtereinheit entweder durch Autoklavieren oder (wenn Pyrexglas) durch Besprühen mit 70% Ethanol und flamm es mit einem Bunsenbrenner. Abkühlen lassen, bevor Sie mit dem Protokoll. </li><li> In sterilen NC-Membran in die Filtrationseinheit unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierten Pinzette. </li><li> Die Hälfte des Überstandsprobe (aus Schritt 2.6) auf der Membranfiltrationseinheit und sammeln Zellen auf der Membran unter Verwendung der Vakuumpumpe. </li><li> Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter geleitet, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie vorsichtig die Membran unter Verwendung von Ethanol-Flamme sterilisierten Pinzette. Legen Sie die Membran in einer sterilen Petrischale. <ol><li> Schneiden Sie die Membran in die Hälfte unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierte Schere. Fügen Sie jede Hälfte der Membran in eine separate 2-ml-Tube. Eine Hälfte der Membran für die DNA-Extraktion und Analyse der gesamten Bakteriengesellschaft verwendet werden. Die andere Hälfte der Filter wird bei -80 ° C gelagert werden und dient als eine Sicherung. </li></ol></li><li> Zeigen neuen NC-Membran auf die Filtrationseinheit und sammeln Biomasse aus der zweiten Hälfte des Probenvolumens (aus Schritt 2.6) mit der Vakuumpumpe. </li><li> Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter geleitet, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie vorsichtig die Membran unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierten Pinzette. Legen Sie die gesamte Membran in eine separate 2-ml-Tube. Diese Probe wird für die Behandlung, um Endosporen von vegetativen Zellen getrennt verwendet werden. Die Probe kann bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 4. Lyse von vegetativen Zellen <ol><li> Führen Sie dieBehandlung Endosporen aus vegetativen Zellen auf der zuvor auf einem NC-Membran (Schritt 3.6) gesammelt Biomasse abzutrennen. <ol><li> Wenn die Membran war gefroren, lassen Sie es bei Raumtemperatur für 10 Minuten auftauen. Dann legen Sie die Membran in einer sterilen Petrischale und schneiden Sie es (etwa 4 mal) in kleinere Stücke unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierte Schere. Dann legen Sie alle Membranfilterstücke in ein steriles 2 ml-Tube. </li></ol></li><li> Fügen Sie 900 ul 1x TE (Tris-EDTA) Puffer (siehe 1.5) auf das Rohr, das die Probenmembran und mischen durch Wirbel. Bei diesem Schritt wird die Biomasse von der Membran in der TE-Pufferlösung entfernt. </li><li> Das Röhrchen wird in einen Inkubator bei 65 ° C für 10 min und 80 min. Danach entfernen Sie den Schlauch aus dem Inkubator und abkühlen lassen für 15 Minuten. </li><li> 100 ul frisch hergestelltes Lysozym (siehe 1.5), um eine Endkonzentration von 2 mg / ml zu erreichen. Nicht das Lysozym nicht hinzufügen, bevor die Probe auf 37 ° C abgekühlt, da dies könnte degrade des Enzyms. </li><li> Inkubieren der Probe bei 37 ° C für 60 min und 80 min werden die optimalen Bedingungen für die Lysozym vegetative Zellen zu lysieren. </li><li> Nach kompletter Lyse, fügen 250 ul 3 N Natriumhydroxid (NaOH) und 250 &amp; mgr; l 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung zu der Probe. Durch das Hinzufügen dieses, das Probevolumen 1,5 ml erreicht und es besteht eine Endkonzentration von 0,5 N NaOH und einer Endkonzentration von 1% SDS. </li><li> Inkubieren dieser Mischung bei RT für 60 min und 80 min. Zugabe der Base und Reinigungsmittel werden in endgültige Zell-Lyse zu helfen. Die Konzentration dieser Reinigungsmittel hat, um nicht die Endosporen schaden optimiert, während Lysieren vegetativen Zellen. </li><li> Bereiten Sie eine sterile Filtrationseinheit, die Durchmesser von 25 mm Membranen hält durch Autoklavieren, oder (wenn Pyrexglas) Besprühen mit 70% Ethanol und flamm es mit einem Bunsenbrenner. Abkühlen lassen. </li><li> Legen Sie eine 0,2 um NC-Membran (Durchmesser 25 mm) an der Filtrationseinheit unter Verwendung von Ethanol-Flamme sterilisierten Pinzette. &lt;/ li&gt; <li> Hinzufügen der Probe aus Schritt 4.7 auf die Membran und Filtern der Flüssigkeit unter Verwendung der Vakuumpumpe. Wenn Flüssigkeit durchlaufen hat, schalten Sie Vakuumpumpe. Bei diesem Schritt wird die lysierte vegetative Zellmaterial entfernt wird, da es nicht auf die Membran zurückgehalten. Nur Endosporen auf der Membran verbleiben. </li><li> 2 ml steriler physiologischer Lösung zu waschen Rest Wasch- und filtern Sie die Flüssigkeit mit Hilfe der Vakuumpumpe. </li><li> Wenn Flüssigkeit vollständig gefiltert wurde, schalten Sie die Vakuumpumpe. Verlassen die Membran auf der Filtrationseinheit. </li></ol> 5. DNase-Behandlung Hinweis: Führen Sie die DNase-Behandlung direkt auf der Filtermembran. Es ist wichtig, dass die Filtereinheit nicht auslaufen und die Vakuumpumpe wird abgeschaltet. <ol><li> Fügen Sie 450 ul sterilem Wasser, 50 ul DNase-Reaktionspuffer (1x) und 0,5 ul DNase Enzym direkt auf der Filtermembran und lassen Sie es für 15 Minuten stehen gelassen. Wenn möglich, tun dies die Verdauung in einem Raum, der leicht ist Kriegmer als durchschnittliche RT, da das Enzym arbeitet besser bei Temperaturen von 25 ° C und darüber. Anmerkung: Halten des Bunsenbrenners Seite der Filtereinheit erhöht auch die Temperatur und hat den zusätzlichen Vorteil, halten die Umgebung steril daher reduzierten Risiko der Kontamination der Proben. </li><li> Wenn die DNase-Verdau beendet ist, schalten Sie Vakuumpumpe, um das Enzym aus der Probe zu entfernen. </li><li> Abzuwaschen restliche Enzym durch Zusatz und Filtrieren von 1 ml physiologischer Lösung. </li><li> Wenn Flüssigkeit vollständig durchlaufen hat, schalten Sie Vakuumpumpe und entfernen Sie die Filtermembran, Endosporen mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale. Hinweis: Die Probe getrennt Endosporen ist nun bereit für Downstream-Analyse. Lagerung bei -20 ° C, wenn für die DNA-Extraktion oder alternativ bei 4 ° C verwendet werden, wenn für die Keimung und Kultivierung verwendet. </li></ol>

<ol><li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li>
<li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li>
<li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America%27s+Largest+Hot+Spring%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li>
<li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li>
<li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G%2BC+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+%28Firmicutes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li>
<li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li>
<li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRicca%2C+E+%22Bacterial+spore+formers%3A+probiotics+and+emerging+applications%22">Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications</a>. , Horizon Bioscience. (2004).</li>
<li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li>
<li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil%2C+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+General+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li>
<li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281(2011).</li>
<li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiol+J%22%5BJournal%5D)">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li>
<li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li>
<li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li>
<li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li>
<li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li>
<li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li>
<li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene%2C+spo0A.%2C+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li>
<li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li>
<li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils%3A+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Widerstand der Endosporen externe aggressive physikochemische Faktoren (zB Temperatur oder Waschmittel) wurde verwendet, um ein Verfahren, um bakterielle Endosporen von vegetativen Zellen in Umweltproben getrennt entwickeln. Dies ist die erste umfassende Methode, um Endosporen aus Umweltproben in einem zerstörungsfrei zu isolieren. Früheren Methoden zu quantifizieren ist, nachzuweisen oder zu analysieren Endosporen Proben wurden über die Messung des spezifischen Proxies für Endosporen wie Dipicolinsäure ode...

Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, ein Protokoll für die Abtrennung von bakteriellen Endosporen aus vegetativen Bakterienzellen in Umweltproben bereitzustellen. Die Bildung von bakteriellen Endosporen ist eine Überlebensstrategie, in der Regel durch Verhungern ausgelöst, in einer Anzahl von Bakteriengruppen zum Stamm Firmicutes 1 gehör gefunden. Endosporen-bildende Bakterien sind gut untersucht, vor allem, da eine Reihe von Stämmen sind Krankheitserreger und folglich der medizinischen Bedeutung (zB Bacillus anthracis oder Clostridium difficile). Umwelt Stämme von Endosporen-bildenden Bakterien wurden aus nahezu jedem Umfeld (Boden, Wasser, Sediment, Luft, Eis, menschlichen Darm, Tiere gut, und mehr) 1-3 isoliert. Daher sind Firmicutes das zweithäufigste Stamm in Stammsammlungen 4. Wegen ihrer hardy äußeren Rinde und Schutzkernproteine ​​können Endosporen extremen Umweltbedingungen im Bereich fr überlebenom Austrocknung zu hohe Strahlungs, extreme Temperaturen und schädliche Chemikalien 5. Diese bemerkenswerte Widerstandsfähigkeit macht es eine Herausforderung, DNA von Endosporen 6-8 extrahieren. Dies erklärt wahrscheinlich, warum sie in der Umweltsequenzierungsstudien 9,10 sehen worden. Andere Verfahren, wie die Zielrichtung Endosporen in Umweltproben durch fluoreszierende Antikörper 11, Quantifizierung von Dipicolinsäure (DPA) im Boden 12 und Sediment 13, Durchflusszytometrie 14 oder Pasteurisierung und anschließende Kultivierung 15,16 verwendet worden, um in abzurufen oder zu quantifizieren Endosporen Umweltproben. In den letzten Jahren optimierten DNA-Extraktionsverfahren als auch spezifische molekulare Primer zielen Endosporen spezifischer Gensequenzen wurden entwickelt 10,17-20. Dies hat dazu beigetragen, mehr Biodiversität in dieser Gruppe von Bakterien 21 offenbaren und hat sich auch auf Anwendungen in Industrie und Medizin zum Nachweis von Endosporen geführtZum Beispiel in Milchpulver 19. Das hier vorgestellte Protokoll basiert auf dem Unterschied in der Beständigkeit gegenüber Schad physikochemischen Bedingungen (wie Wärme und Reinigungsmittel) von bakteriellen Endosporen verglichen mit Zellen, vegetativen basiert. Vegetativen Zellen in einer Probe zu zerstören wir nacheinander erhitzen, Lysozym und niedrigen Konzentrationen von Detergentien. Die Zeit und die Kraft dieser Behandlungen sind optimiert worden, um nicht-Sporen zu zerstören, sondern um alle vegetativen Zellen lysieren. Einige Zellen in einer Umweltzellpool sind widerstandsfähiger als andere, so, um die Wahrscheinlichkeit der Zerstörung aller vegetativen Zellen zu erhöhen, verwenden wir drei verschiedene Behandlungen. Der Vorteil und die Neuheit dieses Verfahrens ist, dass die Endosporen nach der Behandlung noch intakt und kann für weitere Downstream-Analysen verwendet werden. Dazu gehören DNA-Extraktion, quantitative PCR (qPCR) und Amplikon oder Metagenom-Sequenzierung (Targeting gezielt die Gruppe der Endosporen und damit Reduzierung diversity, bei gleichzeitiger Erhöhung Deckung). Die Endosporen könnte auch für die nachgeschalteten Anbau oder die Quantifizierung durch Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, Durchflusszytometrie oder Detektion von DPA. Ein wichtiges Merkmal dieses Verfahrens ist, dass durch Vergleichen eines unbehandelten Probe mit einer behandelten Probe, kann man die Menge und Vielfalt von Endosporen in einer Umweltprobe zusätzlich zu der Komponente, die Zellen vegetativen abzuleiten.

<table><tbody><tr><td>Whatman Nitrozellulose-Membranfilter, 0,2 &#956; m Porengröße, 47 mm Durchmesser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182004 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859 Sigma-Aldrich</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 60-00-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Lysozym aus Hühnereiweiß</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971 Fluka</td><td>Pulver, CAS&nbsp; 12650-88-3&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax Homogenisator T18 basic</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>Glasfilterhalter für 47&nbsp; mm Membranen, Pyrexglas</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe für chemische Anwendungen</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V/50 Hz</td></tr><tr><td>Verteiler-Probenahmefiltration für 25&nbsp; mm Membranen</td><td>Millipore</td><td>1225 Probenahmeverteiler</td><td>Polypropylen</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td>RNASE-frei</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 1310-73-2&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfhut (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nitrozellulose-Membranfilter, 0,2 &#956; m Porengröße, 25 mm Durchmesser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182002 Aldrich</td><td></td></tr></tbody></table>

physische isolierung von endospores aus umweltproben durch gezielte lyse von vegetativen zellen

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Die Endosporenbildung ist eine Überlebensstrategie, die bei einigen Bakterien aus dem Stamm der Firmicutes zu finden ist. Während der Endosporenbildung gehen diese Bakterien in einen morphophysiologischen Ruhezustand über, der das Überleben unter widrigen Umweltbedingungen verbessert. Obwohl endosporbildende Firmicutes in Kultivierungsstudien zu den am häufigsten angereicherten und isolierten Bakteriengruppen gehören, fehlen sie in Diversitätsstudien, die auf molekularen Methoden basieren. Die Resistenz des Sporenkerns gilt als einer der Faktoren, die die Rückgewinnung von DNA aus Endosporen einschränken. Wir haben eine Methode entwickelt, die sich die höhere Resistenz von Endosporen zunutze macht, um sie mit physikalischen, enzymatischen und chemischen Lysemethoden von anderen Zellen in einer komplexen mikrobiellen Gemeinschaft zu trennen. Das so gewonnene reine Endosporenpräparat kann für die Rekultivierung oder zur Durchführung von Downstream-Analysen verwendet werden, wie z. B. maßgeschneiderte DNA-Extraktion, die für Endosporen optimiert ist, und anschließende DNA-Sequenzierung. Diese Methode, die auf Sedimentproben angewendet wird, hat die Anreicherung von Endosporen ermöglicht und nach der Sequenzierung eine große Vielfalt an Endosporenbildnern in Süßwasserseesedimenten aufgedeckt. Wir gehen davon aus, dass die Anwendung dieser Methode auf andere Proben zu einem ähnlichen Ergebnis führen wird.

Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht 10,21. Bitte für die Umwelt Interpretation und Diskussion der Daten beziehen sich auf diesen Artikel. Das Gesamtverfahren ist in Figur 1 zusammengefaßt und entspricht drei Hauptschritten: Zuerst wird die Trennung von Biomasse aus Sediment oder andere umwelt Matrix; Zweitens ist die Zerstörung von vegetativen Zellen; und drittens die nachgeschaltete Analyse der getrennten Endosporen. D...

Es wurde eine Methode entwickelt, um bakterielle Endosporen aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaften herauszufiltern, um maßgeschneiderte Kultur- oder molekulare Studien dieser Bakteriengruppe durchzuführen.

Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bakterielle Endosporen von komplexen mikrobiellen Gemeinschaftsproben, wie beispielsweise Sediment, zu trennen. Diese Methode hilft, zentrale Fragen im Bereich der Mikrobiologie zur Präsenz und Häufigkeit von Endosporen in natürlichen Proben zu beantworten. Sie basiert auf einem Unterschied in der Resistenz zwischen Endosporen und vegetativen Zellen gegenüber Chemikalien und Hitze. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass das Verfahren für Endosporen nicht destruktiv ist, sodass sie für nachfolgende Experimente wie Anzucht, Quantifizierung und Stoffwechseltests verwendet werden können.Obwohl wir diese Methode für die Ökologie von endosporenbildenden Bakterien konzipiert haben, kann sie auch in Bereichen wie der Exobiologie oder der Lebensmittelindustrie angewendet werden, in denen Sporen entweder vorteilhaft oder nachteilig sein können. Nachdem Sie die Lösungen und Geräte gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, geben Sie unter einem mit UV-Licht sterilisierten Sicherheitswerkbank mit alkoholbefeuerter Metallspatel drei Gramm Sedimentprobe in vorab gewogene, sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie mithilfe einer sterilen, kalibrierten Bürette 15 Milliliter einer sterilen, filtrierten 1%igen Natriumhexametaphosphat- oder SHMP-Lösung zur Probe hinzu.Mit einem Flüssigkeitsdispergierer oder Homogenisator und einem sterilen Dispergierrotor das Probenmaterial eine Minute lang bei 17.500 U/min homogenisieren. Die Probe zwei Minuten ruhen lassen und die Homogenisierung wiederholen. Die Probe danach 10 Minuten ruhen lassen, damit die schwersten Partikel absinken können.Überführen Sie das Überstandsgemisch, das die Zellbiomasse enthält, in ein sauberes 50-Milliliter-Gefäß, wobei darauf zu achten ist, den Pellet nicht aufzuwirbeln. Geben Sie eine weitere 15-Milliliter-Aliquot von SHMP zum sedimentierten Pellet hinzu und wiederholen Sie die Homogenisierung, bevor Sie den Überstand sammeln und mit dem ersten Aliquot vereinigen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 20 × g für eine Minute und überführen Sie den Überstand in ein frisches 50-Milliliter-Gefäß, bevor Sie den Pellet verwerfen.Nachdem die Filtrationseinheit und die Vakuumpumpe gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, sterilisieren Sie die Pinzette mit einer Ethanolflamme, um eine sterile Nitrocellulosemembran der Filtrationseinheit hinzuzufügen. Geben Sie die Hälfte der gerade hergestellten Überstandprobe auf die Membranfiltrationseinheit und verwenden Sie die Vakuumpumpe, um die Zellen auf der Membran zu sammeln. Sobald die Flüssigkeit vollständig durch den Filter gegangen ist, schalten Sie die Vakuumpumpe ab.Verwenden Sie sterilisierte Pinzetten, um die Membran vorsichtig zu entfernen, und legen Sie sie in eine sterile Petrischale. Führen Sie mit einem frischen Stück steriler Membran die Filtration mit der verbleibenden Hälfte der Lösung erneut durch. Um Endosporen von vegetativen Zellen in der gerade gewonnenen Biomasse zu trennen, tauen Sie die Membran auf, falls sie eingefroren war, und schneiden Sie sie mit alkoholflamme-sterilisierten Scheren in kleinere Stücke.Die Membranstücke in eine sterile 2-Milliliter-Röhrchen überführen und 900 Mikroliter 1X TE-Puffer hinzufügen. Zum Freisetzen der Biomasse von der Membran gründlich durch Vortexen mischen. Das Röhrchen 10 Minuten bei 65 Grad Celsius und 80 U/min inkubieren.Entfernen Sie dann das Reagenzglas aus dem Inkubator und lassen Sie es 15 Minuten lang abkühlen. Geben Sie 100 Mikroliter frisch zubereiteten Lysozym hinzu, um eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter zu erreichen, und inkubieren Sie die Probe 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 80 U/min, um die vegetativen Zellen zu lysieren. Nach Abschluss der Lyse fügen Sie 250 Mikroliter 3 normalen Natriumhydroxid und 250 Mikroliter 6 %ige SDS-Lösung zur Probe hinzu.Ansatz bei Raumtemperatur und 80 U/min für 60 Minuten inkubieren. Danach eine sterile Filtrationseinheit, die Membranen mit einem Durchmesser von 25 Millimetern aufnimmt, durch Autoklavieren sterilisieren. Nach dem Abkühlen der Filtrationseinheit eine Nitrocellulose-Membran mit einem Durchmesser von 25 Millimetern und einer Porengröße von 0,2 Mikrometern darauf platzieren.Geben Sie die Probe auf die Membran und verwenden Sie die Vakuumpumpe, um die Flüssigkeit zu filtrieren, wodurch die Endosporen auf der Membran zurückgehalten werden, während das Material der vegetativen Zellen durchläuft. Um restliche Detergenzien abzuwaschen, geben Sie zwei Milliliter sterile physiologische Lösung auf die Membran und setzen Sie die Vakuumpumpe ein. Sobald die Flüssigkeit vollständig filtriert ist, schalten Sie die Pumpe aus und lassen Sie die Membran in der Filtrationsvorrichtung.Um die DNase-Behandlung direkt auf der Membran durchzuführen, 450 Mikroliter sterilem Wasser, 50 Mikroliter 1X DNase-Reaktionspuffer und 0,5 Mikroliter DNase-Enzym auf die Membran geben und etwa 15 Minuten bei 25 Grad Celsius stehen lassen. Die zuvor aus lysierten Zellen freigesetzte extrazelluläre DNA wird enzymatisch abgebaut und anschließend abgewaschen. Dadurch wird sichergestellt, dass die endgültige Endosporenpräparation frei von externer DNA ist, was für nachfolgende Analysen wie molekularbiologische Untersuchungen entscheidend ist.Es ist wichtig zu beachten, dass keine Undichtigkeiten am Filterapparat auftreten dürfen und die Probe nicht austrocknet. Nach der Inkubation ein Milliliter physiologische Lösung hinzufügen und die Pumpe einschalten, um das restliche Enzym von der Probe abzuwaschen. Mit sterilen Pinzetten die Membran, die Endosporen enthält, in eine sterile Petrischale überführen.Analysieren Sie die Probe gemäß dem Textprotokoll. Das in diesem Video demonstrierte Protokoll zur gezielten Lyse vegetativer Zellen führt zu einer gereinigten Endosporenprobe und einer signifikanten Erhöhung des Anteils endosporenbildender Firmicutes. Bei der Amplikonsequenzierung des 16S-ribosomalen RNA-Gens entsprechen Firmicutes in unbehandelten Proben nur 8 % bis 19 % der Sequenzen.Im Gegensatz dazu stellten nach der Behandlung Firmicutes 90,6 % und 83,9 % der endosporenreichen Probe dar. Die beiden wichtigsten Ordnungen endosporbildender Firmicutes, Bacillales und Clostridiales, wurden angereichert, während nicht endosporbildende Firmicutes wie Lactobacillales fehlten. Die Wirksamkeit der Behandlung wurde zudem anhand von Reinkulturen nachgewiesen.Eine Endosporenpräparation und eine Kultur vegetativer Zellen wurden behandelt, alle Zellen inkubiert und das Wachstum anhand der optischen Dichte bei 600 Nanometern gemessen. Wie hier gezeigt, wurde Wachstum bei den Endosporenkulturen beobachtet, während in der behandelten E. coli-Kultur kein Wachstum festgestellt wurde, was darauf hinweist, dass die vegetativen Zellen irreversibel geschädigt sind. Sobald die Methode beherrscht ist und vorausgesetzt, dass Lösungen und Geräte bereits vorbereitet wurden, sollte diese Technik innerhalb von etwa fünf Stunden durchführbar sein.Es ist wichtig, daran zu denken, jegliche Kontamination zu vermeiden, indem unter sterilen Bedingungen gearbeitet und die Sterilität der Lösungen sowie des gesamten Geräts gewährleistet wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Anzucht, Isolierung und Stoffwechseltests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Stammidentifizierung und zum metabolischen Potenzial von Endosporen zu beantworten. Außerdem können anschließend DNA-Extraktion und metagenomische Sequenzierung durchgeführt werden, um die Artenvielfalt und das Vorhandensein von Genen zu analysieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Endosporen aus Umweltproben abtrennt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Detergenzien wie SDS äußerst gefährlich sein kann. Tragen Sie stets persönliche Schutzausrüstung.

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Forschung

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Umwelt

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