Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, bakterielle Endosporen aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaftsproben, wie z. B. Sedimenten, zu trennen. Diese Methode hilft, Schlüsselfragen im Bereich der Mikrobiologie über das Vorhandensein und die Häufigkeit von Endosporen in natürlichen Proben zu beantworten. Sie beruht auf einem Unterschied in der Resistenz zwischen Endosporen und vegetativen Zellen gegenüber Chemikalien und Hitze. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Methode für Endosporen nicht destruktiv ist, so dass sie für nachgelagerte Experimente wie Kultivierung, Quantifizierung und Stoffwechseltests verwendet werden können.

Obwohl wir diese Methode so konzipiert haben, dass sie mit der Ökologie von endosporbildenden Bakterien arbeitet, kann sie auch in Bereichen wie der Exobiologie oder der Lebensmittelindustrie eingesetzt werden, in denen Sporen entweder nützlich oder schädlich sein können. Nach der Vorbereitung von Lösungen und Geräten gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie unter einer UV-sterilisierten Biosicherheitswerkbank geflammte Ethanol-Metallschaufeln, um drei Gramm Sedimentprobe in vorgewogene, sterile 50-Milliliter-Röhrchen zu geben. Geben Sie mit einer sterilen, graduierten Bürette 15 Milliliter eines sterilen, filtrierten 1%igen Natriumhexametaphosphats oder einer SHMP-Lösung in die Probe.

Mit einem Flüssigkeitsdispergierer oder Homogenisator und einem sterilen Dispergierrotor wird die Probe eine Minute lang bei 17.500 U/min homogenisiert. Lassen Sie die Probe zwei Minuten ruhen und wiederholen Sie die Homogenisierung. Lassen Sie die Probe 10 Minuten ruhen, damit sich die schwersten Partikel absetzen können.

Füllen Sie das Überkorn, das die Zellbiomasse enthält, in ein sauberes 50-Milliliter-Röhrchen um und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Geben Sie weitere 15 Milliliter aliquot SHMP zu dem sedimentierten Pellet und wiederholen Sie die Homogenisierung, bevor Sie den Überstand auffangen und mit dem ersten Aliquot kombinieren. Die Probe wird eine Minute lang bei 20 mal G zentrifugiert und der Überstand in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt, bevor das Pellet verworfen wird.

Nachdem die Filtrationseinheit und die Vakuumpumpe gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, verwenden Sie eine Ethanolflamme, um die Pinzette zu sterilisieren und der Filtrationseinheit eine sterile Nitrozellulosemembran hinzuzufügen. Geben Sie die Hälfte der gerade vorbereiteten Überstandsprobe auf die Membranfiltrationseinheit und verwenden Sie die Vakuumpumpe, um die Zellen auf der Membran zu sammeln. Wenn die Flüssigkeit den Filter vollständig passiert hat, stoppen Sie die Vakuumpumpe.

Verwenden Sie eine sterilisierte Pinzette, um die Membran vorsichtig zu entfernen und in eine sterile Petrischale zu legen. Wiederholen Sie mit einem frischen Stück steriler Membran die Filtration mit der restlichen Hälfte der Lösung. Um Endosporen von vegetativen Zellen in der gerade gesammelten Biomasse zu trennen, tauen Sie die Membran auf, wenn sie gefroren wurde, und schneiden Sie sie mit einer ethanolgeflammten, sterilisierten Schere in kleinere Stücke.

Übertragen Sie die Membranstücke in ein steriles Zwei-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 900 Mikroliter 1X TE Puffer hinzu. Gründlich mischen, indem man vortext, um die Biomasse von der Membran freizusetzen. Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius und 80 U/min.

Nehmen Sie dann das Röhrchen aus dem Inkubator und lassen Sie es 15 Minuten abkühlen. Geben Sie 100 Mikroliter frisch zubereitetes Lysozym in eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter und inkubieren Sie die Probe 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 80 U/min, um die vegetativen Zellen zu lysieren. Nachdem die Lyse abgeschlossen ist, geben Sie 250 Mikroliter 3 normales Natriumhydroxid und 250 Mikroliter 6%ige SDS-Lösung in die Probe.

Bei Raumtemperatur und 80 U/min 60 Minuten inkubieren. Bereiten Sie als Nächstes eine Sterilfiltrationseinheit vor, die Membranen mit einem Durchmesser von 25 Millimetern durch Autoklavieren hält. Nachdem die Filtereinheit abgekühlt ist, legen Sie eine Nitrozellulosemembran mit einem Durchmesser von 25 Millimetern und 0,2 Mikrometern darauf.

Geben Sie die Probe auf die Membran und verwenden Sie die Vakuumpumpe, um die Flüssigkeit zu filtern und die Endosporen auf der Membran einzufangen, während das vegetative Zellmaterial hindurchströmt. Um Reinigungsmittelreste abzuwaschen, geben Sie zwei Milliliter sterile physiologische Lösung auf die Membran und setzen Sie die Vakuumpumpe ein. Wenn die Flüssigkeit vollständig gefiltert ist, schalten Sie die Pumpe aus und lassen Sie die Membran auf der Filtereinheit.

Um die DNase-Behandlung direkt auf der Membran durchzuführen, geben Sie 450 Mikroliter steriles Wasser, 50 Mikroliter 1X DNase-Reaktionspuffer und 0,5 Mikroliter DNase-Enzym auf die Membran und lassen Sie sie 15 Minuten lang bei ca. 25 Grad Celsius stehen. Die zuvor aus lysierten Zellen freigesetzte extrazelluläre DNA wird enzymatisch verdaut und anschließend abgewaschen. Dadurch wird sichergestellt, dass das endgültige Endosporenpräparat frei von externer DNA ist, was für nachgelagerte Analysen wie die molekulare Analyse von entscheidender Bedeutung ist.

Es ist wichtig, daran zu denken, dass das Filtergerät nicht undicht sein darf und die Probe nicht austrocknet. Nach der Inkubation fügen Sie einen Milliliter physiologische Lösung hinzu und schalten Sie die Pumpe ein, um das restliche Enzym aus der Probe zu waschen. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Membran mit Endosporen in eine sterile Petrischale zu übertragen.

Analysieren Sie die Probe gemäß dem Textprotokoll. Das in diesem Video gezeigte Protokoll der gezielten Lyse vegetativer Zellen führt zu einer gereinigten Endosporenprobe und einer signifikanten Erhöhung des Anteils der Endosporen, die Firmicutes bilden. Bei der Amplikon-Sequenzierung des ribosomalen 16S-RNA-Gens entsprechen die Firmicutes in unbehandelten Proben nur 8% bis 19% der Sequenzen.

Im Gegensatz dazu machten Firmicutes nach der Behandlung 90,6 % bzw. 83,9 % der endosporinreichen Stichprobe aus. Die beiden Hauptordnungen der Endosporen bildenden Firmicutes, Bazillen und Clostridialen, waren angereichert, während nicht-endosporbildende Firmicutes wie Laktobazillen fehlten. Die Wirksamkeit der Behandlung wurde auch anhand von Reinkulturen nachgewiesen.

Es wurden ein Endosporenpräparat und eine vegetative Zellkultur behandelt, alle Zellen inkubiert und das Wachstum mit einer optischen Dichte von 600 Nanometern gemessen. Wie hier gezeigt, wurde ein Wachstum für die Endosporenkulturen beobachtet, während in der behandelten E.Coli-Kultur kein Wachstum beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass vegetative Zellen irreversibel geschädigt sind. Sobald diese Technik gemeistert ist und bereits Lösungen und Geräte vorbereitet wurden, sollte sie in etwa fünf Stunden durchgeführt sein.

Es ist wichtig, daran zu denken, jegliche Kontamination zu vermeiden, indem unter sterilen Bedingungen gearbeitet und die Sterilität der Lösungen und aller Geräte sichergestellt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Kultivierung, Isolierung und Stoffwechseltests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Stammidentifikation und zum metabolischen Potenzial von Endosporen zu beantworten. Außerdem können nachgelagerte DNA-Extraktion und metagenomische Sequenzierung durchgeführt werden, um die Artenvielfalt und das Vorhandensein von Genen zu analysieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Endosporen von Umweltproben trennt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reinigungsmitteln wie SDS äußerst gefährlich sein kann. Vergessen Sie nicht, persönliche Schutzausrüstung zu tragen.