Name: Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 2. Allgemeine Practices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie sichere Praktiken im BSL-4-Labor am Beispiel der Plaque-Assay-Methode. Dieses Verfahren zeigt notwendige Modifikationen für Hochsicherheitsumgebungen und den Umgang mit hochpathogenen Viren.

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Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des US-Gesundheitsministeriums (DHHS) oder der Institutionen und Unternehmen wider, die mit den Autoren verbunden sind. Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Hauptvertrag des Battelle Memorial Institute mit dem US-amerikanischen National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) unter der Vertragsnummer finanziert. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. und J.W. führten diese Arbeit als Mitarbeiter des Battelle Memorial Institute aus. Subunternehmer des Battelle Memorial Institute, die diese Arbeit ausgeführt haben, sind: S.M. als Angestellter von MRI Global; M.G.L. als Mitarbeiter des Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; und J.H.K. als Mitarbeiter von Tunnell Government Services, Inc.

1. Labor Eintrag <ol><li> Sammeln Sie alle Lieferungen von einem BSL-2 Labor für das Experiment (zB Zellen, Medien und Verbrauchsmaterialien) vor dem Eintritt in das BSL-4 - Labor. </li><li> Füllen Sie das BSL-4 Eingabeprozedur (skizziert im Detail in Bezug auf 7). </li></ol> 2. Herstellung einer Klasse II Biosicherheitswerkbank in der BSL-4-Labor <ol><li> Einmal in der BSL-4 Labor, sorgen für die tägliche interne Checkliste (Abbildung 1) abgeschlossen ist. Füllen Sie die Checkliste, wenn die Checkliste wurde bisher nicht gefüllt worden und zeigen an, welche Viren verwendet werden. Hat der Prüfliste bereits abgeschlossen ist, fügen Sie Namen und das Virus wird in die Liste verwendet werden. </li><li> Reinigen der Klasse II BSC durch Besprühen der gesamten Innenseite des BSC unten (einschließlich des Flügels) mit 5% dual quartären Ammoniumdesinfektionslösung (beispielsweise n-alkyl Dimethyl benzyl - ammoniumchlorid, n-Alkyl - dimethyl benzyl ethyl AmmoniumChlorid oder andere Desinfektionsmittel geeignet für das Mittel verwendet wird) und wischen Sie mit Papierhandtüchern 10,11. Spray 70% Ethanol-Lösung im Inneren des Gehäuses und der Flügel die klebrige Desinfektionslösung zu entfernen. </li><li> Wenn gesetzt, stellen Sie den Stuhl vor der Klasse II BSC in bequemer Höhe , um sicherzustellen , dass die Rückseite des Gehäuses erreicht werden kann und dass das Gesicht des Laborfach oberhalb der vorderen Öffnung (Abbildung 2) 11 gelegen. </li><li> Bereiten Sie einen Abfallbehälter für die biologische Sicherheit Kabinett. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration von dual quartären Ammoniumdesinfektionslösung in den Abfallbehälter ist nicht weniger als 5%. Entsprechend zu planen und machen eine 10% ige Lösung, zu der Abfälle hinzugefügt werden, dass das Desinfektionsmittel zu verdünnen. Darüber hinaus legen Sie eine Sprühflasche mit 5% Dual quartären Ammoniumdesinfektionslösung innerhalb der Klasse II BSC alle Elemente sprühen vor dem Entfernen und behandschuhten Hände während und nach Beendigung des Tests. </li> &lt;li&gt; Legen Sie die geeigneten Materialien für das gesamte Experiment in der Klasse II BSC benötigt als im Schrank wie möglich weit zurück 11 wiederholt Material Einführungen in die Klasse II BSC und Störung des Luftstroms zu vermeiden. </li></ol> 3. Beispiel: Plaque-Assay <ol><li> Abrufen von virushaltigen Proben und Kontrollvirus vom Lagerort von Hand und auftauen Materialien in einem Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Beschriften Sie die Vertiefungen der 6-Well-Platten verwendet werden nach den Virus Verdünnungen geplant. Markieren Sie die Deckel und Körper der Platten erfolgreich geprüft, um sicherzustellen, wenn die Deckel und Körper getrennt sind. </li><li> Bringen Sie Materialien aus den Schritten 3.1-3.2 in die Klasse II BSC. Legen Sie alle Gegenstände, die nicht oder nicht in Kontakt kommen mit dem Virus auf einer Seite ( &quot;sauberen Seite&quot;) und Abfall auf der anderen Seite haben ( &quot;schmutzigen Seite&quot;). Wenn möglich, &quot;saubere Produkte&quot; mindestens 30 cm von &quot;schmutzigen Elemente&quot; während der Aerosolschaffenden Tätigkeiten 11. </li><li> Arbeiten Sie so nahe an der Innen Mitte der Klasse II BSC wie möglich wird , da die Mitte der effektivste Position zu sein , ist entworfen , um sich schützen 11. </li><li> Entfernen Sie 50 ul Virusprobe und Kontrollvirus aufnehmen und in 450 ul Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 2% fötalem Rinderserum. Gehen Sie mit der Herstellung Reihenverdünnungen so weit als nötig (3A). </li><li> Während der Verdünnungen, mischen mindestens 5-mal die Virusproben mit einer Pipettenspitze langsam und vorsichtig beim Versuch, Luftblasenbildung in den Proben zu minimieren. Ändern Sie Pipettenspitzen nach jeder Zugabe zum Brunnen neben Verdünnung. </li><li> In der letzten Verdünnung, nachdem die Probe 5 mal Mischen verwerfen 50 ul Virusprobe in Abfallbehälter gleiche Volumina von Verdünnungen zu gewährleisten. </li><li> Wenn der Spitzen Entsorgung spülen jede Spitze mit Desinfektionslösung aus dem Abfallbehälter, die innerhalb und außerhalb der Spitze zu dekontaminieren, bevor Expelling Spitze in den Abfallbehälter. </li><li> Sobald die Verdünnungen hergestellt sind, stellen den Verdünnungs Vertiefungen zur Seite und beginnen Medien aus den Vertiefungen von Zellkulturplatten Ansaugen einer Platte mit 6 Vertiefungen in jeder Vertiefung 500 ul Medien verlassen. </li><li> Wenn mit der Pipettenspitze, aspirieren Desinfektionslösung aus dem Abfallbehälter an die Spitze der Pipette mit einem manuellen, einstellbare Lautstärke beendet, Tast- Pipettor, korrekte Dekontamination von der Innenseite der Pipette zu gewährleisten. Lassen Sie die Spitze in den Abfallbehälter bis zum Ende des Experiments. </li><li> Nachdem die Medien von den Platten entfernt wurden, werden 100 &amp; mgr; l der richtigen Probe in die richtige gut in den voretikettierten Platten in doppelter Ausführung, Tipps jeweils für jede Probe zu ändern. </li><li> Nach Abschluss der Testimpfungen Plaque, abspritzen behandschuhten Hände mit der Desinfektionslösung und ein Papiertuch mit Desinfektionslösung, die außerhalb aller Platten angefeuchtetes zu wischen, bevor die Platten wieder in den Inkubator mit der Hand legen. ReTorf diesen Vorgang, bis alle Platten wieder in den Inkubator sind. </li><li> Schaukeln Sie die Platten in einer 8 Bewegung richtige Streuung der Probe über die Zellen für 1 Stunde alle 15 Minuten zu gewährleisten. </li><li> Nach Abschluss der Schwingplatten, Rückplatten in die Klasse II BSC zusammen mit einem Gemisch von 2 x Eagle minimal essential Medium und 1,6% Tragacanth, einer halbfesten Überlagerung, die als Agarose leichter zu handhaben ist, für die Überlagerung des Plaque-Assay verwendet. </li><li> 2 ml des Overlay-Mischung in jede Vertiefung in einer 6-Well-Platte und Rock wieder in einer Figur-8-Bewegung für eine gleichmäßige Verteilung des Overlay über die gesamte Oberfläche des Brunnens. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis auch jeder verwendet wird, mit dem Overlay Mischung überlagert. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Spitze der serologischen Pipette keine Flüssigkeit in den Vertiefungen berührt eine Kreuzkontamination zu vermeiden, wenn das Overlay-Verfahren durchführen. </li></ol> 4. Entsorgung und Reinigung der Instrumente und die biologische Sicherheit Kabinett &lt;ol&gt; <li> Völlig überschwemmen alle Abfallmaterial in 5% Desinfektionslösung in den Abfallbehälter für eine Kontaktzeit von mindestens 10 min. Desinfizieren Pipettenspitzen, serologischen Pipetten und andere Abfälle wie oben beschrieben. Darüber hinaus sprühen, um die Abfallbehälter (innen und außen) mit 5% Desinfektionslösung lassen Sie die Lösung bleiben in Kontakt mit dem Abfallbehälter für eine Kontaktzeit von 10 min. </li><li> Während der Kontaktzeit warten auf den Abfall verstreichen, ein Papiertuch mit 5% Desinfektionslösung einweichen, wischen Sie Instrumente wie Mikropipetten, und sie von der BSC zu entfernen. Spray behandschuhten Hände mit 5% Desinfektionslösung vor behandschuhten Händen aus der Klasse II BSC zu bringen. <ol><li> Nachdem die Mikro von der BSC zu entfernen, wischen Sie sie mit einem separaten Papiertuch mit 70% Ethanollösung klebrigen Ablagerungen auf den Instrumenten zu vermeiden. Spray alle Instrumente, die nicht effektiv abgewischt werden unten mit 5% Desinfektionsmittel kann und in Kontakt mit der Lösung in der BSC für 10 Minuten verlassen. </li></ol></li><li> Nach einer ausreichenden Kontaktzeit, entfernen Sie alle Elemente aus der BSC. Nehmen Sie Gegenstände, einschließlich Abfall Eimer mit Abfallmaterialien, zum Waschbecken. Spülen Sie Gegenstände, die Desinfektionsmittel Rückstände zu entfernen wiederverwendet werden kann. Zurück alle Einzelteile zu ihren Lagerplätzen. </li><li> Reinigen Sie die Klasse - II - Arbeitsfläche des BSC, Schrankseiten und zurück, alle Möbel aus Glas, und Flügel 1 mit 5% Desinfektionslösung von 70% Ethanol - Lösung. </li><li> Herausziehen und entleeren Sie die serologischen Pipetten aus den Abfallbehälter und Ort oberflächen desinfiziert serologischen Pipetten in separate Pipettenschalen für Autoklaven (serologischen Pipetten eine sharps Gefahr darstellen kann und reißen kann durch den Müllsack. Legen Sie diese Pipetten in einem Hartschalenbehälter vor Autoklavierung). </li><li> Gießen Sie den Inhalt der Abfallbehälter in einem Sieb im Boden des Beckens platziert. </li><li> Bringen Sie ein Biohazard Abfallbehälter, die mit einem roten Biohazard-Tasche zum Waschbecken und Dump den Inhalt der straine ausgekleidetr in den roten biohazard Tasche. Nicht in das Sieb gelangen, um Mikropipettenspitzen zu entfernen, die an der Innenseite des Siebes haften. Hit das Sieb entlang der Innenseite des Abfallbehälters, bis alle Spitzen entfernt werden, oder eine Pinzette verwenden, um Tipps aus dem Sieb zu entfernen. </li><li> Spülen Sie den Abfallbehälter und den Ort aus auf dem Gestell neben dem Waschbecken zu trocknen. </li></ol> 5. Autoklavierung Abfall <ol><li> Entfernen Sie die BIOHAZARD Beutel aus dem Biohazard Abfallbehälter und in einem Autoklaven Tablett auf einem Wagen. </li><li> Lassen Sie Biohazard Taschen öffnen und legen Sie ein Stück Autoklaven Klebeband über die Außenseite des Beutels, die Seiten des Autoklaven Tablett verbindet die Tasche in der Schale gesichert zu halten. </li><li> Legen Sie zwei Stücke von Autoklaven Klebeband auf der serologischen Schale für Pipettenspitzen und beschriften Sie sie mit eigenen Initialen und das Datum. Legen Sie die serologische Pipette Tablett auf dem Wagen mit dem Autoklaven Fach. </li><li> Öffnen Sie den Autoklaven. Schließen Sie das mitgelieferte Autoklaven Laden / Entladen cart in den Autoklaven und bringen die versenkbare Autoklaven Plattform auf dem Wagen zur Ruhe aus. </li><li> Entfernen Sie die Metallstange aus dem Autoklaven und oben offen. Legen Sie einen biologischen Indikator Fläschchen Sporen von Geobacillus stearothermophilus in den Metallstab enthält , um zu überprüfen , dass der Autoklav Sterilisationszyklus erfolgreich abgeschlossen wurde. </li><li> Platzieren Sie den Metallstab in die Mitte des Abfallbeutel im Autoklaven Fach aber sicher, dass die Metallstange noch leicht zugänglich ist. </li><li> Legen Autoklav Fach gefüllt mit Abfall und serologische Pipette Tablett auf den versenkbaren Autoklaven Plattform und schieben Sie es wieder in den Autoklaven. </li><li> Nehmen Sie den Autoklaven Laden / Entladen Wagen aus dem Autoklaven und schließen Sie den Autoklaven Tür. </li><li> Starten Sie den Autoklaven. </li><li> Sie nicht den Autoklaven verlassen, bis der Zyklus begonnen hat. Der Betriebsbildschirm des Autoklaven wird die verbleibende Zeit für diesen Lauf an. </li><li> Nachdem der Autoklav Lauf beendet ist, entfernen Sie die biologische indicator und auf Wachstum durch Erhitzen in einer angegebenen Inkubator bewerten. Wenn das Wachstum auf dem biologischen Indikator erkannt wird, wieder laufen, den Müll in den Autoklaven und zu beurteilen, neu Indikator. Wenn kein Wachstum festgestellt wird, entfernen Sie den Müll aus der Anlage. </li></ol> 6. Beispiel: Fixierung und Färbung von Plaque-Assays <ol><li> Nach der entsprechenden Anzahl von Tagen (die auf das Virus abhängt verwendet) verstrichen ist, wieder zurück ins Labor und führen Sie die Schritte aus den Abschnitten 1 und 2 wieder. </li><li> Plaque-Assay-Platten aus dem in Schritt abgeschlossen Inkubator 3.1.2, aufnehmen und in der Klasse II BSC mit der Hand vorsichtig entfernen. </li><li> Pipette aus allen Medien und Overlay - Material und verzichtet in Desinfektionslösung Behälter und ersetzen mit einem Gemisch aus 10% neutral gepuffertem Formalin und 0,8% Kristallviolett 12,13. Lassen Sie die Mischung auf den Platten für 30 min bleibt das Virus auf den Platten zu inaktivieren. </li><li> Nach der Inaktivierung entfernen Sie vorsichtig die neutralgepuffertem Formalin / Kristallviolett-Gemisch und in einem separaten Abfallbehälter werden vor der Entsorgung neutralisiert. </li><li> Spray behandschuhten Hände mit Desinfektionsmittel und wischen Sie die Außenseite der Platten vor ihnen aus der Klasse II BSC vorbei, wie oben beschrieben. </li><li> Fahren Sie mit dem Waschbecken, Spülen Sie die Platten überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und dann legen die Platten auf einem Wagen, um zu trocknen. </li><li> Sobald die Platten vollständig trocken sind, verwenden Sie eine Lichtbox die Plaques zu zählen. Aufzeichnen alle Zählungen und Virustiter aus der Standardgleichung (3B) berechnen. </li></ol> 7. Entnahme von Proben aus dem BSL-4-Labor <ol><li> Inactivate alle Proben, die unter BSL-2 Laborbedingungen werden manipuliert werden. Folgen einem von zwei durch das interne Biosicherheit Büro anerkannten Methoden an der IRF-Frederick mit 10% neutral-gepuffertes Formalin (NBF) oder Trizol LS (phenol, Guanidinisothiocyanat, Ammoniumthiocyanat, Natriumacetat, Glycerol) 1,14. Transfer samples auf ein neues sauberes Röhrchen oder Platte außerhalb der BSC vor der Verpackung zur Entnahme aus der BSL-4-Labor. </li><li> Heißsiegel inaktivierten Proben in Röhren oder Platten in Heißsiegel Beutel mit ausreichend 5% Desinfektionsmittel oder Fixierungslösung in das Innere des Beutels und die Außenseite der Probenröhrchen Übertragung aus dem Labor BSL-4 unterzogen zu desinfizieren. Dieses Beutel in einen anderen Beutel folgende gleiche Verfahren. </li><li> Verschließen Sie den zweiten Beutel und legen Sie die heißgesiegelten Beutel in einen dunk Tank mit 5% Desinfektionslösung für mindestens 10 Minuten, um die Außenseite des wärmeversiegelt Beutel zu desinfizieren. </li><li> Füllen Sie einen Dunk Tank Logbuch in das Labor aus, indem Sie die Anzahl und Größe der Rohre Abgrenzen, das Volumen in den Rohren, Mittel verwendet wird, Inaktivierungsverfahren verwendet, und Raum, wo Proben werden übertragen. </li><li> Koordinieren Sie sich mit einem Kollegen auf der Außenseite des BSL-4 Labor den Beutel aus dem dunk Tank zu holen und nehmen Proben an das BSL-2 Labor. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Arbeit in einem BSL-4 Labor erfordert viel Zeit und zusätzliche Aufmerksamkeit zum Detail. Jede Art von Arbeit in diesem Umfeld erfordert gut ausgebildete, gründlich und gewissenhaft Einzelpersonen. Die Standard-Virus-Plaque-Test liefert ein genaues Modell eines gemeinsamen Verfahrens für die mit hoher Folge Krankheitserregern in der BSL-4 Labor, wie der Test mehrere wichtige Konzepte beinhaltet, in dem Laborpersonal geschult werden müssen. Die erste große Konzept ist die richtige Verwen...

A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices
One of the authors names was corrected from:
Nicole Joselyn
to:
Nicole Josleyn

A correction was made to the authors section in: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Erratum: Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Als Sicherheit von Hoch Folge Erregern Laborpersonal Handhabung (keine Infektion Prophylaxe noch existieren Behandlungsmöglichkeiten) an erster Stelle steht, hat das US Department of Health and Human Services Richtlinien festgelegt für Anlagenbau und Best Practices für die sichere Durchführung von Arbeiten mit Krankheitserregern in der biomedizinischen und klinische Laboratorien aus einer Biosicherheit Perspektive 1. Durch Gesetze und Vorschriften, haben viele der Praktiken und Verfahren verbindlichen Anforderungen werden, die für die Arbeit mit diesen Erregern befolgt werden müssen. In den USA, Krankheitserreger, die sich leicht von Mensch zu Mensch übertragen werden, führen zu hohen Letalitätsraten und / oder das Potenzial für große öffentliche Gesundheit auswirken und Bioterrorismus haben, werden als National Institute of Health / National Institute of Allergy kategorisiert und Infektions Krankheit (NIH / NIAID) Priorität A Pathogene und oder Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorismus Kategorie A Agents 2. Zusätzlich hIGH-Folge Krankheitserreger werden als Tier - 1 - Agenten auswählen klassifiziert , wenn diese Erreger potenzielle Bioterrorismus Mittel sind, haben das Potenzial für Massenanfall von Verletzten oder verheerende Auswirkungen auf die Wirtschaft, die kritische Infrastruktur oder das Vertrauen der Öffentlichkeit 3. BSL-4-Operationen, einschließlich des Zugangs zu den Instituten mit BSL-4 Laboratorien sind höher gesteuert als BSL-2/3-Schaltungen. Zum Beispiel ist es wesentlich schwieriger, Zugang zu einem BSL-4 Labor zu gewinnen im Vergleich zu einem BSL-2 oder BSL-3 Labor aufgrund erheblicher Anzug Ausbildungsanforderungen, umfangreiche mentorship Anforderungen und zusätzliche medizinische Biosicherheit Voraussetzungen. Darüber hinaus gibt es typischerweise mehrere physische Sicherheitssperren in einem BSL-4 - Anlage im Vergleich zu einem BSL-2 oder BSL-3 - Anlage 4-6. Wie bereits in unserem ersten Artikel über BSL-4 Ein- und Ausstieg beschriebenen Verfahren, durchlaufen Laborpersonal eine umfassende Ausbildung und psychologische Screening für den Eintritt in den BSL-4 Labor 7 zu qualifizieren. Within der BSL-4 Labor, Infektionsrisiko und Fehler werden vermieden oder durch folgende etablierten Verfahren gemildert. Die Forschung muss sorgfältig und bewusst mit minimaler Multitasking oder Ablenkungen gehen. Bücken im Überdruckanzüge ist schwierig, und der Gesichtsschutz Verfahren beschränken, wie Mikroskopie. Sperrige Handschuhe behindern die Leistung der Feinmotorik Aufgaben, wie Umgang mit kleinen Gegenständen oder Kennzeichnung Rohre. Zur Zeit verbrachte in BSL-4 Laboratorien zu minimieren, sollten Laborspezialisten Arbeitsabläufe überprüfen Schritte zu identifizieren, die vor uns in einem BSL-2 Labor durchgeführt werden kann und transportieren dann diese Materialien in die BSL-4 Labor für die Durchführung der Aufgabe (n). Wenn Materialien für die Weiterverarbeitung in BSL-2 Labor entfernen, werden die Materialien festgelegt und von der BSL-4-Labor in einem abgedichteten zweiten Behälter entfernt wird. Beispiele von Proben, die umfassen können entfernt werden müssen: Festplatten oder Rohre aus infiziertem Material, das durch enzyme-linked analysiert werden immunosorbent-Assay (ELISA), Immunfluoreszenztest (IFA), oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Neben der besseren physikalischen durch persönliche Schutzausrüstung auferlegten Beschränkungen erforderlich BSL-4 Laboratorien im Vergleich zu denen in BSL-2 Laboratorien, Verfahren zur Inaktivierung von Hoch Folge Pathogenen in Zellkulturplatten und Entsorgung sind strenger als die für weniger pathogenen Viren benötigt in einem BSL-2 Labor untersucht. Zumindest sollten diese Verfahren CDC Anforderung zu erfüllen. Beispielsweise kontaminierte Zellkulturplatten und anderen Materialien, können mit chemischen Reagenzien, wie neutral-gepuffertem Formalin inaktiviert werden. Behandelten Zellkulturplatten oder Rohre sind in Heißsiegelbeutel gelegt werden, die Formalin und entfernt vom Labor über einen dunk Tank mit einem flüssigen Desinfektionsmittel gefüllt ist. Abfall Eimer mit Desinfektionslösungen gefüllt und Spray Desinfektionsmittel eingesetzt werden zur vorübergehenden Abfall während des Experiments und für disi erzeugt Empfangnfecting Handschuhe, Reinigung Biosicherheitsschrank Flächen und Instrumenten sind. Quartären Ammoniumdesinfektionslösung in der Konzentration aufgeführt ist der Goldstandard für alle US-BSL-4 Laboratorien (Barr J, persönliche Mitteilung, 2015) betrachtet. Feste Abfälle aus einem Abfallbehälter autoklaviert Potential für Verunreinigung zu beseitigen. In einer Anstrengung, um visuell den Arbeitsablauf und die Grenzen der allgemeinen BSL-4-Verfahren zu demonstrieren, verwendeten wir eine Standard viralen Plaque-Assay als ein Beispiel für eine häufig verwendete virale Verfahren. Während der viralen Assay-Verfahren im Allgemeinen beschrieben wird, betonen wir die Biosicherheit Verfahren Sicherheit des Laborpersonals in diesem Protokoll verwendet, um sicherzustellen. Bitte beziehen sich auf frühere klassische Plaque - Assay - Visualisierungen für zusätzliche Hintergrund auf dem Plaque - Assay - Technik 8,9. Die Verfahren präsentiert hier folgen Sie den BMBL umrissenen Spezifikationen von CDC 1. Jedoch sind die vorgestellten Protokollespezifisch für das IRF-Frederick. Jede BSL-4-Anlage verfügt über verschiedene Standardarbeitsanweisungen (SOPs) und Methoden der Operation, die die Durchführung von Experimenten in der BSL-4 Labor auswirken. Alternative Verfahren für die Abfallstrom-Management und Durchführung von Plaque-Assays können auf die Verwaltung und den Betrieb dieser Labors, unterschiedlich sein. Dennoch wird ein allgemeines Verständnis für den Aufbau eines BSL-4-Anzug Labor und Verfahren für die Durchführung der Arbeit mit der Klasse II Schränke im Inneren des BSL-4-Umgebung den Wissenschaftlern helfen, die Einschränkungen und Auswirkungen auf die Sicherheit verstehen, wenn Studien mit hohem Risiko Krankheitserreger betrachten. Eine stärkere Sensibilisierung der externe Mitarbeiter der Schwierigkeiten in einem BSL-4 Labor umgebende Arbeit kann bei der Entwicklung von medizinischen Gegenmaßnahmen in der Forschungsgemeinschaft angepassten Erwartungen und größerer Leichtigkeit führen.

<table><tbody><tr><td>Micro-Chem Plus</td><td>National Chemical Laboratories</td><td>255</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 96-Deep-Well-Platten</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serologische Pipette</td><td>Fisher</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serologische Pipette</td><td>Fisher</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>140675</tr><tr><td>Crystal Violet</td><td></td><td>Sigma HT90132-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>Fisher</td><td>22-050-105</td><td></td></tr><tr><td>Traganth</td><td>Fisher</td><td>50-702-2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>Fisher</td><td>21-402-550</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipettenspitzen</td><td>Fisher</td><td>21-402-561</td><td></td></tr><tr><td>1.000 μmu; l Pipettenspitzen</td><td>Fisher</td><td>21-402-581</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>2x EMEM</td><td>Quality Biological</td><td>115-073-101</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu; l Pipette&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>&nbsp; L-1000XLS+</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipette&nbsp;</td><td>Rainin</td><td>&nbsp; L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>12-Well, Mehrkanal 200 &mu; l Pipettierer</td><td>Rainin</td><td>L12-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>8-Well, Mehrkanal 1.000 μm; l Pipettierer</td><td>Rainin</td><td>LA8-1200XLS</td><td></td></tr><tr><td>Attest</td><td>Express Medical Supplies&nbsp;</td><td></td><td></td>MMM12192</tr><tr><td>Autoklav</td><td>Getinge</td><td>GEB 2404 AMB-2</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaventasche</td><td>Fisher</td><td>01-828E</td><td></td></tr><tr><td>2.000 ml Becher</td><td>Fisher</td><td>02-591-10H</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavenablage</td><td>Fisher</td><td>13-359-20B</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenablage</td><td>Fisher</td><td>13-361-5</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Inkubator</td><td>Fisher</td><td>WU-39321-00</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Dose</td><td>Rubbermaid Commercial</td><td>FG614500 RED</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavenband</td><td>Fisher</td><td>15-903</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavenstange</td><td>Made by IRF</td><td>Facility N/A</td><td></td></tr><tr><td>Light Box</td><td>Fisher</td><td>S11552</td><td></td></tr><tr><td>Heißsiegelgerät</td><td>Fisher</td><td>NC9793612&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Heißsiegelbeutel</td><td>Fisher</td><td>01-812-25H</td><td></td></tr><tr><td>Biohazard Beutel</td><td>Fisher</td><td>01-828E</td><td></td></tr></tbody></table>

sicherheitsvorkehrungen und betriebsverfahren in einem (a) bsl-4-labor: 2. allgemeine practices

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 2. General Practices

Die Arbeit in einem Biosicherheitsstufe 4 (BSL-4) Eindämmung Labor erfordert Zeit und viel Liebe zum Detail. Die gleiche Arbeit, die in einem BSL-2 Labor mit Nicht-Hoch Folge Krankheitserreger wird erheblich länger dauern in einem BSL-4-Einstellung erfolgt. Diese erhöhte Zeitbedarf ist aufgrund einer Vielzahl von Faktoren, die auf den Schutz der Forscher vom Labor erworbenen Infektionen, die Arbeitsumgebung vor möglichen Kontamination und der lokalen Gemeinschaft von möglichen Freisetzung von hoch Folge Krankheitserreger gerichtet sind. Innerhalb Labor wird die Bewegung durch Luftschläuche an die vorgeschriebene Sicherheitsanzüge Ganzkörper befestigt beschränkt. Zusätzlich Desinfektion von jedem Element, das von der Klasse II Biosicherheit Schränke (BSCs) entfernt wird, ist nicht erforderlich. Labor Spezialisten müssen in der Praxis der BSL-4 Labor geschult werden und eine hohe Kompetenz in den Fähigkeiten zeigen, müssen sie durchführen, sind. Der Schwerpunkt dieses Artikels ist die richtige Verfahren und Techniken zu umreißen Labor b, um sicherzustellen,iosafety und experimentelle Genauigkeit eines Standard viralen Plaque-Test als Beispiel Verfahren. Insbesondere arbeiten die richtigen Techniken sicher in einem BSL-4-Umgebung bei der Durchführung eines Experiments wird visuell hervorgehoben werden. Diese Techniken umfassen: die Einrichtung einer Klasse-II-BSC für Experimente, die richtige Reinigung der Klasse II BSC wenn Sie fertig sind Arbeiten, Abfallwirtschaft und sicheren Entsorgung von Abfällen in einem BSL-4 Labor erzeugt, und die Entfernung von inaktivierten Proben aus dem Inneren eines BSL- 4 Labor auf den BSL-2 Labor.

Nach korrekter Verfahren innerhalb der BSL-4 Labor sind von entscheidender Bedeutung für die sichere und effiziente Durchführung von Tests zu gewährleisten. Unter Bezugnahme auf die abgeschlossene tägliche interne Checkliste (Abbildung 1), sicherzustellen , Laborpersonal , dass das Gerät voll funktionsfähig ist. Die richtige Körperhaltung in der Mitte der BSC stellt sicher , dass das Experiment unter optimalen Luftströmungsbedingungen (Figur 2) durchgefü...

Die Durchführung von Virustests in einem BSL-4-Labor ist im Vergleich zur Arbeit in einem BSL-2-Labor aufgrund erforderlicher zusätzlicher Sicherheitsvorkehrungen aufwändiger. Hier präsentieren wir einen Überblick über Praktiken und Verfahren, die in einem BSL-4-Labor verwendet werden, um die ordnungsgemäße Verwendung der Biosicherheitswerkbank der Klasse II, die Abfallwirtschaft/-entsorgung und die Probenentnahme zu veranschaulichen.

Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 2. Allgemeine Practices

Work in a biosafety level 4 (BSL-4) containment laboratory requires time and great attention to detail. The same work that is done in a BSL-2 laboratory ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, sichere Arbeitspraktiken bei der Arbeit in einem Labor der Biosicherheitsstufe 4 mit Schutzanzug anhand des Plaque-Assays als Beispiel zu demonstrieren. Dieses Verfahren zeigt die erforderlichen Anpassungen, um einen standardmäßigen Plaque-Assay in einer Umgebung der Biosicherheitsstufe 4 durchzuführen. Begleiten Sie mich bei der Demonstration dieses Verfahrens Tracey Burdette, eine Technikerin der Integrated Research Facility.Nach Abschluss der täglichen internen Systemkontrollliste säubern Sie den Sicherheitswerkbank der Klasse II, indem Sie die Innenseite, einschließlich des Schiebefensters, mit einer 5 %igen dualen quaternären Ammonium-Desinfektionslösung besprühen. Anschließend wischen Sie die Werkbank mit Papiertüchern ab und stellen sicher, dass die Sprühflasche mit der Desinfektionslösung in der Werkbank verbleibt, um behandschuhte Hände während und nach Abschluss des Assays zu besprühen. Sprühen Sie eine 70%ige Ethanol-Lösung in die Werkbank und auf das Schiebefenster, um die klebrige Desinfektionslösung zu entfernen.Bereiten Sie einen Abbehälter für den Sicherheitswerkbank vor. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration der dualen quaternären Ammonium-Desinfektionslösung im Abbehälter unter Berücksichtigung zusätzlicher Flüssigkeiten, die hinzugefügt werden, mindestens 5 % beträgt. Stellen Sie den Abbehälter, der eine 5 %ige duale quaternäre Ammonium-Desinfektionslösung enthält, in die Klasse-II-Sicherheitswerkbank.Führen Sie alle Arbeiten so nah wie möglich an der inneren Mitte des Biosicherheitswerksatzes der Klasse II durch. Die innere Mitte ist so ausgelegt, dass sie die wirksamste Position zum Eigenschutz darstellt. Entnehmen Sie 50 Mikroliter Virusprobe und Kontrollvirus und geben Sie diese in 450 Mikroliter Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium mit 2 % fetalem Kälberserum in Verdünnungsvertiefungen.Fahren Sie mit der Herstellung von seriellen Verdünnungen so weit wie erforderlich fort. Mischen Sie die Virusproben mindestens fünfmal mit einer Pipettenspitze, wobei Sie nach jeder Verdünnung die Pipettenspitze wechseln. Mischen Sie langsam, um die Bildung von Luftblasen in den Proben zu minimieren.Nach Abschluss die Verdünnungsgefäße beiseite stellen. Beim Entsorgen der Pipettenspitzen jede Spitze mit Desinfektionslösung aus dem Abfalleimer spülen, um das Innere und Äußere der Spitze zu desinfizieren, bevor die Spitze in den Abfalleimer entsorgt wird. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums aus den Vertiefungen von sechsfachigen Zellkulturplatten. 100 µL der entsprechenden Probe in das richtige Well der vorkodierten Platten im Duplikat hinzufügen. Nach Abschluss der Arbeit die behandschuhten Hände mit der Desinfektionslösung besprühen. Die Außenfläche aller Platten mit einem mit Desinfektionslösung getränkten Papierhandtuch abwischen, bevor die Platten manuell in den Inkubator gestellt werden.Schwenken Sie die Platten in einer Acht-Bewegung, um alle 15 Minuten über eine Stunde lang eine gleichmäßige Verteilung der Probe auf den Zellen sicherzustellen. Geben Sie zwei Milliliter der Überzugsmischung in jede Vertiefung und schwenken Sie erneut in einer Acht-Bewegung, um eine gleichmäßige Verteilung des Überzugs über die gesamte Oberfläche der Vertiefung zu gewährleisten. Tauchen Sie das gesamte Abfallmaterial vollständig in eine 5 %ige Desinfektionslösung im Abfallbehälter ein und belassen Sie es dort mindestens 10 Minuten lang.Sprühen Sie die Innenseite und Außenseite des Abfalleimers, die Innenseite des Biosicherheitswerkschutzes der Klasse II, die Außenfläche von Geräten und behandschuhte Hände mit einer 5 %igen Desinfektionslösung ein. Lassen Sie die Lösung 10 Minuten lang im Abfalleimer und auf anderen Oberflächen einwirken. Entfernen Sie anschließend die Gegenstände aus dem Biosicherheitswerk und bringen Sie sie zur Spüle.Legen Sie die verwendete Pipette zur Autoklavierung in ein Pipettentablett. Gießen Sie den Inhalt des Abfallbehälters in ein Sieb im Waschbecken. Bringen Sie anschließend einen Bioabfallbehälter, der mit einer roten Bioabfalltüte ausgekleidet ist, zum Waschbecken und kippen Sie den Inhalt des Siebs in die rote Bioabfalltüte.Stellen Sie den Bioabfallsack auf ein Autoklav-Behältnis auf einem Wagen. Schließen Sie die Autoklavsäcke mit Klebeband locker, sodass Dampf in den Sack eindringen kann. Kennzeichnen Sie eines der Autoklav-Klebebänder mit Ihren Initialen und dem Datum.Entfernen Sie die perforierte Metallstange aus dem Autoklaven und öffnen Sie die Abdeckung. Platzieren Sie eine Biologische-Indikator-Flasche mit Sporen von Geobacillus stearothermophilus in die Metallstange, um zu überprüfen, ob der Sterilisationszyklus des Autoklaven erfolgreich abgeschlossen wurde. Stellen Sie das mit Abfall gefüllte Autoklaven-Behältnis in den Autoklaven.Starten Sie den Autoklaven und überprüfen Sie, dass der Zyklus begonnen hat. Auf dem Bedienbildschirm des Autoklaven wird die verbleibende Zeit für diesen Durchlauf angezeigt. Entfernen Sie die Plaque-Assay-Platten nach Ablauf der erforderlichen Inkubationszeit vorsichtig aus dem Inkubator und bringen Sie sie per Hand in den sauberen Biosicherheitswerkbank der Klasse II unter.Entfernen Sie das Medium und das Überzugsmaterial mit einer Pipette und geben Sie es in den Behälter mit Desinfektionslösung. Ersetzen Sie das Medium durch eine Mischung aus 10 % neutral gepuffertem Formalin und 0,8 % Kristallviolett, um das Virus für eine Einwirkzeit von 30 Minuten zu inaktivieren. Nach der Inaktivierung entfernen Sie vorsichtig die Mischung aus neutral gepuffertem Formalin und Kristallviolett und geben sie in einen separaten Abfallbehälter, der vor der Entsorgung neutralisiert werden muss.Spülen Sie die Platten am Waschbecken, um überschüssige Färbung zu entfernen, und stellen Sie die Platten dann zum vollständigen Trocknen in ein Tablett. Zählen Sie die Plaques mit einer Lichtbox. Notieren Sie alle Zählwerte und berechnen Sie die Virus-Titer anhand der Standardgleichung.Um inaktivierte Proben aus dem BSL-4-Labor zu entfernen, bringen Sie die Röhrchen oder Platten in eine Wärmedichtungstasche ein. Sprühen Sie die Innenseite der Tasche mit einer 5%-igen Desinfektions- oder Fixierlösung ein, um die Innenseite der Tasche und die Außenseite der Probengefäße zu desinfizieren. Versiegeln Sie die Tasche anschließend mittels Wärmedichtung.Legen Sie diese Hülle mithilfe desselben Verfahrens in eine weitere Hülle. Versiegeln Sie die zweite Hülle thermisch und geben Sie die doppelt versiegelten Hüllen in einen Tauchbehälter, der mindestens 10 Minuten lang eine 5 %ige Desinfektionslösung enthält, um die Außenseite der Hüllen zu desinfizieren. Füllen Sie das Protokollbuch für den Tauchbehälter im Labor aus, indem Sie die Anzahl und Größe der Röhrchen, das Volumen in den Röhrchen, das verwendete Desinfektionsmittel, das verwendete Inaktivierungsverfahren sowie den Raum angeben, in den die Proben transferiert werden sollen.Die Einhaltung der korrekten Verfahren im Biosicherheitslabor der Stufe 4 ist entscheidend, um die sichere und effektive Durchführung von Assays zu gewährleisten. Mithilfe der abgeschlossenen täglichen internen Checkliste stellen die Labormitarbeiter sicher, dass die Ausrüstung voll funktionsfähig ist. Die Virenprobe wird seriell verdünnt, um Platten zu erhalten, die 30 bis 300 Plaques pro Mulde aufweisen, und um die Virus-Titer zu bestimmen.Eine Reihe von Faktoren beeinflusst die Bildung von Plaques, darunter die Virus-Tropismus für Wirtszelllinien, die Inokulationstechnik, Bedingungen für das Viruswachstum, geeignete Verdünnungsbereiche und die Auswahl der Überlagerung. Der im Sicherheitswerkbankverfahren anfallende Abfall wird zweimal desinfiziert. Der Abfall wird vor dem Entfernen aus der Sicherheitswerkbank ordnungsgemäß einmal desinfiziert.Anschließend wird der Abfall vor dem Verlassen der Tier-Biosicherheitsstufe 4 autoklaviert. Durch die Einhaltung dieser Verfahren wurden bei tierexperimentellen Arbeiten in der Biosicherheitsstufe 4 am Integrated Research Facility in Frederick keine laborbedingten Infektionen registriert. Diese Technik kann, sofern ordnungsgemäß durchgeführt, je nach Anzahl der Proben in drei bis vier Stunden abgeschlossen werden.Während Sie dieses Verfahren durchführen, denken Sie daran, Verdünnungen korrekt durchzuführen, die Plaques entsprechend auszuwerten und alle Sicherheitsvorkehrungen einzuhalten, um ein sicheres und erfolgreiches Experiment zu gewährleisten. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die physischen Einschränkungen haben, die durch Druckschutzanzüge entstehen, sowie für den zusätzlichen Zeitaufwand, der zur Durchführung eines standardmäßigen Plaque-Assays erforderlich ist.

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Research

Forschung

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Immunology and Infection

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