Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 2. Allgemeine Practices

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, sichere Praktiken bei der Arbeit in einem Labor der Biosicherheitsstufe 4 am Beispiel des Plaque-Assays zu demonstrieren. Dieses Verfahren demonstriert die Modifikationen, die erforderlich sind, um einen Standard-Plaque-Assay in einer Umgebung der Biosicherheitsstufe 4 durchzuführen. Tracey Burdette, eine Technikerin der Integrated Research Facility, demonstriert mit mir das Verfahren.

Reinigen Sie nach Abschluss der täglichen Checkliste für interne Systeme die biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II, indem Sie das Innere, einschließlich des Flügels, mit einer 5%igen vierprozentigen vierteiligen Ammonium-Desinfektionslösung besprühen. Wischen Sie dann den Schrank mit Papiertüchern ab und achten Sie darauf, die Sprühflasche mit der Desinfektionslösung im Schrank zu lassen, um die behandschuhten Hände während und nach Abschluss des Assays zu besprühen. Sprühen Sie 70%ige Ethanollösung in den Schrank und den Flügel, um die klebrige Desinfektionslösung zu entfernen.

Bereiten Sie einen Abfallbehälter für die Biosicherheitswerkbank vor. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration der dualen quartären Ammonium-Desinfektionslösung im Abfallbehälter nicht weniger als 5 % beträgt, wobei zusätzlich zugesetzte Flüssigkeit zu berücksichtigen ist. Stellen Sie den Abfallbehälter mit 5 %iger doppelter quartärer Ammonium-Desinfektionslösung in die Biosicherheitswerkbank der Klasse II.

Führen Sie alle Arbeiten so nah wie möglich an der inneren Mitte der Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch. Die innere Mitte ist so gestaltet, dass sie die affektivste Position ist, um sich selbst zu schützen. Entnehmen Sie 50 Mikroliter der Virusprobe und des Virusbekämpfungsvirus und geben Sie sie in 450 Mikroliter des Modifizierten Eagle-Mediums von Dulbecco mit 2 % fötalem Rinderserum in Verdünnungsvertiefungen.

Fahren Sie mit der seriellen Verdünnung so weit wie nötig fort. Mischen Sie die Virusproben mindestens fünfmal mit einer Pipettenspitze und wechseln Sie die Pipettenspitzen nach jeder Verdünnung. Langsam mischen, um die Bildung von Luftblasen in den Proben zu minimieren.

Stellen Sie nach Fertigstellung die Verdünnungsvertiefungen beiseite. Spülen Sie bei der Entsorgung von Spitzen jede Spitze mit Desinfektionslösung aus dem Abfalleimer aus, um die Innen- und Außenseite der Spitze zu dekontaminieren, bevor Sie die Spitze in den Abfalleimer ausstoßen. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums aus den Vertiefungen der Zellkulturplatten mit sechs Vertiefungen.

Geben Sie 100 Mikroliter der richtigen Probe in zweifacher Ausfertigung in die richtige Vertiefung der vormarkierten Platten. Sprühen Sie nach Fertigstellung die behandschuhten Hände mit der Desinfektionslösung ab. Wischen Sie mit einem mit Desinfektionslösung getränkten Papiertuch die Außenseite aller Platten ab, bevor Sie die Platten von Hand in den Inkubator legen.

Bewegen Sie die Platten in einer 8-Bewegung, um eine Stunde lang alle 15 Minuten eine korrekte Verteilung der Probe über die Zellen zu gewährleisten. Geben Sie zwei Milliliter der Überlagerungsmischung in jede Vertiefung und rocken Sie erneut in einer 8-Figur-Bewegung, um eine gleichmäßige Verteilung der Überlagerung über die Oberfläche der Vertiefung zu erzielen. Tauchen Sie alle Abfälle vollständig in 5%ige Desinfektionslösung in den Abfalleimer für eine Einwirkzeit von mindestens 10 Minuten.

Besprühen Sie die Innen- und Außenseite des Abfalleimers, die Innenseite der Biosicherheitswerkbank der Klasse II, das Äußere der Geräte und die behandschuhten Hände mit einer 5%igen Desinfektionslösung. Lassen Sie die Lösung für eine Einwirkzeit von 10 Minuten im Abfalleimer und auf anderen Oberflächen verbleiben. Nehmen Sie dann die Gegenstände aus der Biosicherheitswerkbank und bringen Sie sie zum Waschbecken.

Legen Sie die gebrauchte Pipette zum Autoklavieren in eine Pipettenablage. Den Inhalt des Abfalleimers in ein Sieb in der Spüle geben. Bringen Sie dann einen Behälter für biologisch gefährliche Abfälle, der mit einem roten Beutel für biologische Gefahrstoffe ausgekleidet ist, zur Spüle und kippen Sie den Inhalt des Siebs in den roten Beutel für biologische Gefahrstoffe.

Legen Sie den Biohazard-Beutel auf ein Autoklaventablett auf einem Wagen. Verschließen Sie die Autoklavenbeutel locker mit Klebeband, damit Dampf in den Beutel eindringen kann. Und beschriften Sie eines der Autoklavenbänder mit den Initialen und dem Datum.

Nehmen Sie den perforierten Metallstab aus dem Autoklaven und öffnen Sie den Deckel. Legen Sie ein Durchstechflasche mit biologischen Indikatoren mit Sporen von Geobacillus stearothermophilus in den Metallstab, um zu überprüfen, ob der Sterilisationszyklus im Autoklaven erfolgreich abgeschlossen wurde. Stellen Sie das mit Abfall gefüllte Autoklavenfach in den Autoklaven.

Starten Sie den Autoklaven und überprüfen Sie, ob der Zyklus gestartet wurde. Auf dem Betriebsbildschirm des Autoklaven wird die verbleibende Zeit für diesen Lauf angezeigt. Nachdem die erforderliche Inkubationszeit abgeschlossen ist, nehmen Sie die Plaque-Assay-Platten vorsichtig aus dem Inkubator und legen Sie sie von Hand in die saubere Biosicherheitswerkbank der Klasse II.

Aspirieren Sie das Medium und überlagern Sie das Material mit einer Pipette und geben Sie es in den Behälter für die Desinfektionslösung. Ersetzen Sie das Medium durch eine Mischung aus 10 % neutralem gepuffertem Formalin und 0,8 % Kristallviolett, um das Virus für eine Kontaktzeit von 30 Minuten zu inaktivieren. Entfernen Sie nach der Inaktivierung vorsichtig das neutral gepufferte Formalin/Kristallviolett-Gemisch und geben Sie es in einen separaten Abfallbehälter, um es vor der Entsorgung zu neutralisieren.

Spülen Sie die Platten am Waschbecken ab, um überschüssige Flecken zu entfernen, und legen Sie die Platten dann zum vollständigen Trocknen in ein Tablett. Verwenden Sie einen Leuchtkasten, um die Tafeln zu zählen. Notieren Sie alle Zählungen und berechnen Sie die Virustiter aus der Standardgleichung.

Um inaktivierte Proben aus dem BSL-4-Labor zu entnehmen, legen Sie die Röhrchen oder Platten in einen Heißsiegelbeutel. Besprühen Sie die Innenseite des Beutels mit 5%igem Desinfektionsmittel oder Fixierlösung, um die Innenseite des Beutels und die Außenseite der Probenröhrchen zu desinfizieren. Und dann den Beutel heiß verschließen.

Setzen Sie diesen Beutel in einen anderen Beutel ein, indem Sie auf die gleiche Weise vorgehen. Versiegeln Sie den zweiten Beutel mit Hitze und legen Sie die doppelt versiegelten Beutel für mindestens 10 Minuten in einen Tauchtank mit 5 %iger Desinfektionslösung, um die Außenseite der Beutel zu desinfizieren. Füllen Sie ein Logbuch für einen Tauchtank im Labor aus, indem Sie die Anzahl und Größe der Röhrchen, das Volumen in den Röhrchen, das verwendete Mittel, die verwendete Inaktivierungsmethode und den Raum, in den die Proben übertragen werden, beschreiben.

Die Einhaltung ordnungsgemäßer Verfahren innerhalb des Labors der Biosicherheitsstufe 4 ist entscheidend für die Gewährleistung eines sicheren und effektiven Abschlusses von Assays. Anhand der täglich ausgefüllten internen Checkliste stellen die Labormitarbeiter sicher, dass die Geräte voll funktionsfähig sind. Die Virusprobe wird seriell verdünnt, um Platten mit 30 bis 300 Plaques pro Vertiefung zu erhalten und den Virustiter zu bestimmen.

Eine Reihe von Faktoren beeinflussen die Bildung von Plaques, einschließlich des Virustropismus für Wirtszelllinien, der Inokulationstechnik, der Bedingungen für das Viruswachstum, des geeigneten Verdünnungsbereichs und der Auswahl der Overlays. Abfälle, die während des Eingriffs in der Biosicherheitswerkbank anfallen, werden zweimal desinfiziert. Die Abfälle werden vor der Entnahme aus der Biosicherheitswerkbank einmal ordnungsgemäß desinfiziert.

Anschließend werden die Abfälle autoklaviert, bevor sie die Umgebung der Tierschutzstufe 4 verlassen. Durch die Befolgung dieser Verfahren wurden während der Forschung der Tierschutzstufe 4 an der Integrated Research Facility in Frederick keine im Labor erworbenen Infektionen registriert. Diese Technik kann je nach Anzahl der Proben in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn die Technik richtig durchgeführt wird.

Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, Verdünnungen korrekt durchzuführen, die Plaques entsprechend zu zählen und alle Sicherheitsvorkehrungen einzuhalten, um ein sicheres und erfolgreiches Experiment zu gewährleisten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die körperlichen Einschränkungen haben, die durch Überdruckanzüge auferlegt werden, und die zusätzliche Zeit, die für die Durchführung eines Standard-Plaque-Assays erforderlich ist.