Name: Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 3. Aerobiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie Aerobiologie-Verfahren in einem BSL-4-Labor zur sicheren Aerosolforschung mit nicht-humanen Primaten. Diese Methode ermöglicht Forschern die Untersuchung hochgefährlicher Pathogene unter maximalen Sicherheitsbedingungen.

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Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des US-Gesundheitsministeriums (DHHS) oder der Institutionen und Unternehmen wider, die mit den Autoren verbunden sind. Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Hauptvertrag des Battelle Memorial Institute mit dem US-amerikanischen National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) unter der Vertragsnummer finanziert. HHSN272200700016I. J.K.B., K.J., M.R.H., D.P., L.B. und J.W. führten diese Arbeit als Angestellte des Battelle Memorial Institute aus. Subunternehmer des Battelle Memorial Institute, die diese Arbeiten ausgeführt haben, sind: J.H.K., ein Angestellter von Tunnell Government Services, Inc.; und M.G.L., ein Mitarbeiter des Lovelace Respiratory Research Institute.

Dieses Protokoll hält sich an die folgenden Tierpflege-Richtlinien. Die Tiere wurden in einer Einrichtung untergebracht von der Association akkreditiert für Evaluierung und Akkreditierung von Labor Animal Care International. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Nationalen Institut für Allergie und Infektionskrankheiten, Abteilung für klinische Forschung, Tierpflege und Use Committee und waren in Übereinstimmung mit den Tierschutzgesetz Vorschriften, Public Health Service Politik und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung genehmigt Laboratory Animals Empfehlungen. 1. Aerobiologie: Animal Biosafety Level 4 (ABSL-4) Anzug Labor <ol><li> Laborherstellung <ol><li> Füllen Sie die ABSL-4 Anzug Labor Zulassungsverfahren (dargelegt im Detail in 8). </li><li> Testen Sie die Funktionalität aller Geräte (zB Plethysmografie Ausrüstung, Laptop, biogefährdendes Mülleimern, biogefährdendes Kanülenabwurfbox, vorbehaltlich Überwachungseinrichtungs) in aerobiology Verfahren beteiligt innerhalb der ABSL-4 Anzug Labor auftretenden gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Sicherstellen, dass der Transferwagen biologisch sauber vor ist, um die Prüfung der Funktionalität des Rapid Transfer Port (RTP), die den Transportwagen durch die Wand der Klasse III BSC) verbindet. </li><li> Griff und verdünnen Erreger nur in zertifizierten BSCs. Bereiten Sie die Erreger in der entsprechenden Formulierung innerhalb einer Klasse-II-BSC, die geeignete Desinfektionsmittel enthält. Transportieren Sie den Erreger in einem luftdichten Sekundärbehälter mit einem Biogefährdungsymbol markiert auf nassem Eis in dem Transportwagen. Übergeben Sie die Erreger durch die RTP in die Klasse III BSC in der ABSL-4 Schrank Labor, Abbildung 1. </li></ol></li></ol> 2. Plethysmographie: Animal Biosafety Level 4 (ABSL-4) Anzug Labor <ol><li> Plethysmographie Einrichtung und Kalibrierung <ol><li> Bestimmen Sie, welche Methode der Plethysmographie Erwerb(Kopf-out-Plethysmographie oder respiratorischen Induktivität Plethysmografie [RIP]) verwendet werden und Anlagenkomponenten miteinander zu verbinden. </li><li> Kalibrieren des Plethysmographen vor dem Experiment unter Verwendung von Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Plethysmographie Acquisition <ol><li> Wenn NHPs Handhabung, don Handschuhe ein externes Paar Latex oder Nitril Handschuhe über Top-Modell der Anzug eine Kreuzkontamination zu vermeiden und eine sichere Praktiken fördern. Beim Umgang mit nichtmenschlichen Primaten fertig ist, ziehen diese zusätzlichen Handschuhe und in der biogefährdendes Mülleimer im Raum zu verwerfen. </li><li> Wenn Kopf-out-Plethysmographie verwenden, fügen Sie eine neue Gummi / Rubberdams an der Vorderseite des Zylinders. Schneiden Sie ein kleines Loch in den Damm für den Kopf des NHP durch den oberen Teil des Zylinders zu passen. Im Sitzen schafft der Damm eine Dichtung um den Hals des NHP. </li><li> Wenn RIP verwenden, prüfen Sie, dass die RIP-Bands richtig um die Brust und Bauch des NHP ausgestattet sind und die elektronischen Verbindungen werden geschnappt tightly. </li><li> Senden Sie alle von der Plethysmographie Verfahren gewonnenen Daten an die Forscher in der ABSL-4 Schrank Labor. Exportieren des Atemvolumens und der Minutenvolumendaten für jedes Tier durch ein kompatibles Programm zur Verwendung während der Aerosolverfahren. </li></ol></li></ol> 3. Nonhuman Primas Transport und Handhabung: Tier Biosafety Level 4 Anzug Labor <ol><li> NHP Handhabung <ol><li> Überwachung und Aufzeichnung keine physikalische Manipulationen, Verwaltungen oder Routineverfahren in Diagrammen für jeden NHP. </li><li> Wenn ein Aerosol Herausforderung abgeschlossen ist, stellen Sie den NHP in den Transportbehälter und zurück NHP, um den Käfig zu Hause im Tierhalteraum. </li><li> Wenn ein lebendes Tier Handhabung, folgen Sie der obligatorischen Regel, dass zwei Mitarbeiter erfordert anwesend sein. </li></ol></li><li> NHP Transport <ol><li> Bestimmen Sie die Art der Anästhesie, die Dauer der Anästhesie (deckt Transport, Plethysmographie acquisitIon und der Aerosol-Provokation) und entsprechende Dosis der Anästhesie vor der Verabreichung. Fully anästhesieren das NHP basierend auf den Prozess, durch den Comparative Medicine Personal ausgewählt. Wenn eine zusätzliche Betäubung erforderlich ist, sicherzustellen, dass alle Nadeln, spitze oder scharfe Gegenstände, Spritzen und Kappen in einem dafür vorgesehenen Behälter in einem der Tierversuchsräume angeordnet werden verworfen. Verwenden Sie keine Nadeln nach dem Gebrauch rekapitulieren. </li><li> Transport narkotisiert NHPs in klaren Behältern, die durch einen Riegel auf dem Deckel der Transportkiste befestigt sind. </li><li> Lasttransportbehälter auf einem mobilen Wagen zu ermöglichen , voll geeignet Forscher frei mit Atemluftleitungen und durch den Luftdruck beständig (APR) Türen, Abbildung 1 zu bewegen. </li><li> Da keine zusätzliche Atemluft für den NHP zu dem Transportbehälter zugeführt wird, die Transportzeit zu minimieren. </li></ol></li></ol> 4. Aerobiologie: ABSL-4 Cabinet Laboratory <ol><li> Klasse III BSC - Setup <ol><li>Gleichzeitig mit Tiervorbereitung durchgeführt von Vergleichende Medizin Personal, bereiten Sie die Klasse III BSC. überprüfen Sie visuell, ob Unterdruck in der Klasse III BSC wird im angegebenen Bereich gehalten (125 Pa oder -0,5 in Wassersäule (wg) Minimum; 250 Pa oder -1,0 in wg empfohlen). Überprüfen Sie die Klasse III BSC für eventuelle Lecks oder Risse (siehe Abbildung 1). </li><li> Körperlich und Sichtprüfung der Klasse III BSC synthetische Gummihandschuhe und O-Ringe in die Klasse III BSC angebracht für Schwachstellen, Risse, Risse oder trockene Fäulnis. Tauschen Sie die beschädigte Klasse III synthetische Gummihandschuhe und / oder O-Ringe unmittelbar vor der Verwendung. An diesem Punkt ist die Klasse III BSC nicht kontaminiert. </li><li> Wenn ein Leck auftritt, während die Klasse III BSC kontaminiert ist, identifizieren die Position der Verletzung und Alarm Facility-Management und die biologische Sicherheit Personal. Wenn ein Gerät der Klasse III BSC integriert Handschuh gerissen oder gebrochen, ersetzen Sie die beschädigte Handschuh sofort durch die gut ausgebildeten Technik folgende und internal Klasse III BSC Standardverfahren. </li><li> Um einen integrierten Handschuh ändern, um einen kleinen Riss oder Bruch während einer Belichtung enthält, zuerst den Tränen Sprüh- oder Verletzung übermäßig mit der entsprechenden Konzentration eines dual quaternären Ammonium (n-alkyl Dimethyl benzyl-ammoniumchlorid, n-Alkyl-dimethyl ethyl benzyl-ammoniumchlorid) Desinfektionsmittel . Machen Sie keine übermäßige Bewegungen während dieser Zeit, dass eine Erhöhung der Luftstrom erzeugen. </li><li> Vorsichtig entfernen Sie die äußeren O-Ringe (2 davon) an die Klasse des beschädigten integrierten Handschuh verlassen angebracht noch III BSC. bewegen Sie leicht die beschädigte integrierte Handschuhmanschette vom Hafen entfernt, während die integrierte Handschuh Dichtung intakt bleibt gewährleistet. Wenn die Dichtung beeinträchtigt wird, ertönt ein Alarm die Prozedur anzeigt, wurde nicht richtig gemacht. Die integrierte Handschuh Manschette sollte mit dem Port verbunden bleiben, nachdem der zweite O-Ring aus der Klasse III BSC entfernt wird. </li><li> Legen Sie eine neue Klasse III BSC synthetischen Gummihandschuh über der alten Handschuh in gleiche Ausrichtung. Dieses neue Handschuh vollständig über den Hafen in ähnlicher Weise auf die anderen Klasse III BSC Gloveports. </li><li> Ersetzen Sie den O-Ring am nächsten an der Klasse III BSC über den neuen integrierten Handschuh. Mit Hilfe eines benachbarten integrierten Handschuh-Anschluss, ziehen Sie vorsichtig die beschädigte Klasse III BSC synthetischen Gummihandschuh in der Klasse III BSC. Die neue Klasse III synthetische Gummihandschuh wird als Barriere wirken Haltung aufrecht zu erhalten. Sobald der andere beschädigte Klasse III synthetischen Gummihandschuh entfernt wird (nach innen gezogen), ersetzen Sie die andere äußere O-Ring und weiter zu arbeiten. </li><li> Notieren Sie alle Details über die Handschuhreiß / Bruch in der spezifischen Klasse III BSC Logbuch. Wenn die beschädigte integrierte Handschuh entfernt wird oder ein Bruch in Haltung auftritt, hält die kompromittiert integrierte Handschuh / Hafen noch einen nach innen gerichteten Luftstrom von 0,47 m 3 / sec. Diese innere Luftstrom ist der gleiche Luftstrom mit einer Klasse-II-BSC verwendet, wodurch die Konsistenz beibehalten zwischen Klasse II und Klasse III BSCs. </li><li> Überprüfen Sie dunk Tank undüberprüfen, ob der dunk Tank mit einem Desinfektionsmittel auf die markierte Ebene innerhalb des dunk Tank, Abbildung 1. Überprüfen Sie die Konzentration des Desinfektionsmittels in den dunk Tank gefüllt wird , ist ein Minimum von 3500 uS ein Leitfähigkeitsmessgerät verwenden. Diese Leitfähigkeit ist auf 5% Konzentration des Desinfektionsmittels äquivalent. </li><li> Sicherstellen , dass die Klasse III BSC Autoklav ist Funktions- und Betriebs so alle kontaminierten Abfällen und Geräte sterilisiert werden kann, Bild 1. Autoklav nur Geräte bekannt , die Strapazen des Sterilisationsprozesses aufrecht zu erhalten. </li><li> Testen Sie die Funktionalität anderer aerobiology Ausrüstung (zB AAMP Komponenten, Laptop) und Luft und Vakuum in dem Experiment beteiligten Linien, Abbildung 2. </li><li> Setzen Sie Zeichen auf der Klasse III BSC die den aktuellen Verschmutzungszustand des Gerätes. </li></ol></li><li> Montage und Einrichtung des Systems von NHP Head-nur Belichtungskammer <ol><li> Bauen Sie ein 16-l NHP Kopf-only Exposition chaMBER durch die Edelstahl - Lieferung Einsetzen und Abgasleitungen, Bild 2. Konfigurieren Sie die Kammer in einem Push / Pull, dynamische Konfiguration durch die entsprechenden Luft, Vakuum verbinden und Druckleitungen zum AAMP. Schließen Sie den AAMP an eine Stromquelle in der Klasse III BSC und einem Laptop - Computer über einen hermetisch dichten Anschluss auf der Oberseite der Klasse III BSC (Abbildung 1). </li><li> Untersuchen Sie den montierten NHP Kopf nur Belichtungskammer auf Lecks oder Risse, und sicherzustellen, dass die Kammer ordnungsgemäß zusammengebaut ist. </li><li> Schließen Sie einen Aerosolgenerator und der aerodynamischen Partikelgröße Lesegerät an den NHP Kopf nur Belichtungskammer. </li><li> Öffnen Sie die Luft und Vakuumquelle an den AAMP. </li><li> Starten Sie das Aerosol-Protokoll-Software auf dem Laptop-Computer. Geben Sie die entsprechende NHP Kopf nur Belichtungskammer, Aerosolgenerator und biosampler Flussrate und administrative Informationen in die Software-Menüs. </li><li> Berechnen Sie die Aerosol-HerausforderungZeit aus den Daten während der Plethysmographie-Prozedur, Schritt 2.2.4. Wenn der Kopf-out-Plethysmographie verwenden, berechnen Sie die Dosis vor der Aerosolexposition. Wenn RIP, die Berechnung der Dosis gleichzeitig während der Aerosolexposition. </li><li> Füllen Sie den Aerosolgenerator mit dem Erreger. </li><li> Durch die Aerosol Software, schalten Sie den Aerosolgenerator &quot;auf&quot; und das Innere des Kopf nur NHP Spray Belichtungskammer mit der Herausforderung Material für 10 min. </li><li> Drehen Sie den Aerosolgenerator aus, leeren Sie die Herausforderung an Material, und entsorgen Sie die Herausforderung Material in einen biogefährdendes Müllsack innerhalb der Klasse III BSC befindet. </li></ol></li><li> NHP Head-Exposure nur <ol><li> Bringen Sie einen biosampler an den NHP Kopf nur Belichtungskammer, füllen Sie die biosampler mit Mappen Medien, und befestigen Sie die entsprechende Vakuumleitung an den biosampler. </li><li> Prüfen Sie die Tiefe der Anästhesie des NHP. Wenn die Tiefe der Narkose wird als ausreichend angesehen ( <em&gt; zB nicht mehr reagiert auf äußere Reize, Muskeltonus, stabile Atmung, und Herzfrequenz), die narkotisierten NHP durch den schnellen Transfer Port (RTP) in die Klasse III BSC passieren. Wenn die Tiefe der Narkose nicht ausreicht, zu verwalten zusätzliche Anästhesie über IV, Direkteinspritzung, oder durch ein Anästhetikum Pumpe vor dem NHP durch die RTP (Vergleichende Medizin Personal im Anzug Labor) zu übergeben. Führen Sie zusätzliche Betäubungsmittel liefert durch den RTP. </li><li> Legen Sie die NHP in Rückenlage auf die NHP Belichtungsrampe. </li><li> passieren sanft den Kopf des NHP durch die Gummi / Rubberdams an dem Kopf Portal des NHP Kopf nur Belichtungskammer. Der Gummi / Rubberdams sorgt für eine Dichtung um die während der Aerosolexposition Hals des NHP erstellt wird. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die NHP Vital visuell und mit einem tragbaren Gegenstand Monitor stabil sind. </li><li> Geben Sie die Zeit Aerosol Herausforderung berechnet aus Schritt 4.2.6. und notwendige Ausrüstung Kennungen pronent zu jedem Aerosol in die Aerosol Software ausführen und die Aerosol Herausforderung beginnen. </li><li> Stellen Sie sicher, Partikelgröße Daten während jedes Aerosollauf mit der Aerosolpartikelgrößenmessgerät die gewünschte Partikelgrößenverteilung erreicht wird, um sicherzustellen. Führen Sie diese Überprüfung kontinuierlich oder mit Unterbrechungen während des gesamten Belichtung. </li><li> Sobald die Aerosol Herausforderung abgeschlossen ist, entfernen Sie die NHP aus dem Kopf-nur Belichtungskammer und das Gesicht / Kopf mit dem geeigneten Desinfektions des NHP wischen mögliche Kontamination zu Laborpersonal zu reduzieren. </li><li> Spülen Sie die Aerosolkammer oder in der Luft waschen die verbleibenden und hinken Partikel für 5 Minuten durch Luft und Vakuum durch die Kammer verläuft. Dieses Verfahren wird &quot;reinigen&quot; und Restpartikel aus der Aerosol-Belichtungskammer für nachfolgende NHP Aerosol Belichtungen zu entfernen. </li><li> Übergeben Sie die NHP zurück durch den RTP der Forscher innerhalb des ABSL-4 aerobiology Anzug Labor befindet sich auf. </li><li> Entsorgen Sie alle sharps used innerhalb der Klasse III BSC in einem dafür vorgesehenen Container bestimmt ist, die in der BSC bleibt. Wenn der Behälter für spitze Gegenstände ¾ voll ist, legen Sie in den Biohazard Müllsack. </li><li> Leeren Sie den Aerosolgenerator und einem der verbleibenden Herausforderung Material in den biogefährdendes Müllbeutel mit Müll, Einweg-Geräte und / oder ¾-Voll Behälter für spitze Gegenstände, falls zutreffend. </li><li> Leeren Sammlung Medien aus dem Aerosol biosampler in die entsprechend gekennzeichneten Sammelröhrchen und auf nassem Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.13, bis alle geplanten Testpersonen in Frage gestellt wurden. </li><li> Geben Sie alle Aerosol biosampler Proben durch den RTP der Forscher für die Quantifizierung und Rücktitrationen von Aerosoldosis. </li><li> Platzieren Sie den Müll und Ausrüstung aus der Aerosol - Provokation in den Pass-Through - Autoklaven an der Klasse III BSC und wählen Sie einen gültigen Sterilisationszyklus (Abbildung 3). </li><li> Zerlegen Sie den NHP Kopf-only chamber und dekontaminieren die Kopf nur Kammer und der Klasse III BSC mit einem Zyklus Paraformaldehydgas mit biologischen Indikatoren validiert. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir skizzieren die aerobiology Verfahren auf der IRF-Friedrich verwendet für mit hochgefährlichen (Risikogruppe 4) Erregern arbeiten. Ein Zweck der Bioaerosol Verfahren der Visualisierung ist es, die Sicherheit der Mitarbeiter zu betonen, wenn eine Klasse III BSC während des Experimentierens mit solchen Erregern mit Labor erworbene Infektionen zu vermeiden. Klasse III BSCs halten einen nach innen gerichteten Richtungsluftstrom, der in Doppel HEPA - Filter erschöpft , um sicherzustellen , dass Krankheitserreger im Labor ...

Übertragung von Viren erfolgt in der Regel durch direkten oder physischen Kontakt, aber viele wichtige virale Erkrankungen (zB Masern, Windpocken, Grippe) werden durch Erreger verursacht wird, die durch ein Aerosol oder Atemtröpfchen übertragen werden. Solche Erreger das Potenzial haben , eine Pandemie mit Folgen , die aus weit verbreiteten milde Krankheit mit dem Verlust der Arbeit verbundenen bis hin zu verursachen (zB Erkältungen) schwere Erkrankung mit hoher Letalität (zB Pocken) zu seltener. Hoch Folge Krankheitserreger , die auf natürliche Weise durch Aerosol oder durch absichtliche Freisetzung Aerosol verbreiten (biologische Waffen) sind von besonderem Interesse für Aerobiologie 1. Die Menschen werden könnte mit einigen dieser Erreger durch große Atemtröpfchen oder kleinen Teilchen Kerne und leicht verbreiten diese Erreger auf andere Personen durch Speichelsekret, Husten und Niesen 2 schnell infiziert. In der US Biodefense Gemeinschaft, Hoch Folge Krankheitserreger (zB Filoviren oder andere NIAID Categorie AC Priorität Pathogene und CDC Bioterrorismus - Agenten) stehen im Mittelpunkt der Aerosolforschungsprogramme aufgrund der hohen Letalität von Infektionen im Zusammenhang mit 3,4. Bedeutende wissenschaftliche Fortschritte im Bereich Aerobiologie haben in den letzten zehn Jahren aufgrund der technologischen Fortschritte in der Aerosol - Ausrüstung und hohe Rückhalteeinrichtungen 5,6 erzielt. Forschung an der National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH / NIAID), Integrated Research Facility in Fort Detrick liegt in Frederick, MD, USA (IRF-Frederick) konzentriert sich auf High-Folge neu auftretender Krankheitserreger, die Tier Biosicherheit erfordern Stufe 4 (ABSL-4) Eindämmung. Die gesamte Mission des IRF-Friedrich ist zu bewerten und die Entwicklung von Impfstoffkandidaten und Therapeutika (medizinische Gegenmaßnahmen) erleichtern. Forschung mit hoher Konsequenz Erreger an der IRF-Friedrich wird von strengen Biosicherheit und Tierpflege und Nutzungsanforderungen geregelt. Diese requirements sind in der Biosicherheit in mikrobiologischen und biomedizinischen Laboratorien (BMBL) Handbuch 7 und den Bundestierschutzbestimmungen beschrieben. Diese notwendigen Anforderungen können die Art der Forschung beschränken, die durchgeführt werden können und die allgemeine Studiendesign auswirken. Wie wir bereits in dieser Zeitschrift beschrieben, die alle in einem ABSL-4 - Umgebung durchgeführt Forschung erfordert besondere Vorsicht, hoch spezialisierte Ausbildung und eine robuste und redundante Einrichtung Infrastruktur 8,9. Der Eintritt in die IRF-Frederick ABSL-4 Anzug Labor erfordert Anziehen eine positive Druck Einkapseln Anzug 8. Positiv-Druckanzüge Einkapseln werden zur Eingabe des ABSL-4 Schrank Labor nicht erforderlich. Ein Peeling Anzug, Gummi oder Nitril Handschuhe Donning und nahen Schuhe , die vorne ist angemessen , wenn Risikogruppe 4 infektiösem Material in einem zertifizierten Klasse III Biosicherheit Cabinet (BSC) in einem ABSL-4 Schrank Labor 7 zu manipulieren. An der IRF-Frederick, Aerosol Ausrüstung wurde entwickelt, montiert und in zwei hermetisch abgedichtet, Edelstahl, luftdicht, Unterdruck Klasse III BSCs, Abbildung 1. Der IRF-Frederick Aerobiologie Kern wendet ein automatisiertes Aerosol - Management - Plattform beibehalten ( AAMP) zu steuern und über eine durch~~POS=TRUNC 5 Aerosol Experimentieren innerhalb dieser BSCs, Fig . 2 eine frühere Veröffentlichung , die spezifischen Funktionen der Klasse III BSCs an der IRF-Frederick skizziert und die Verbindung zum Anzug Labor überwachen. Das Verfahren der Klasse III BSC vor dem Experiment vorbereitet ist auf die IRF-spezifisch. Andere Klasse III BSCs an anderen Institutionen verwendet funktionieren ähnlich wie die Klasse III BSC im Einsatz an der IRF, sondern kann verschiedene Mechanismen für den Transport, Zugang oder Docking haben. Um zu verstehen, wie hoch Folge Erreger bleiben ansteckend und verbreiten durch Aerosolübertragung, sichere aein dieser Klasse III BSCs durchgeführt werden nach einem bestimmten Arbeitsablauf Verfahren robiological Experimente müssen. Die Forscher wurden sorgfältig und gründlich geschult diesen Workflow gewährleistet ist, in einer sicheren und konsistenten Art und Weise verfolgt wird. Vor dem nicht-menschlichen Primaten (NHP) Aerosol Herausforderung, mehrere Aerosolcharakterisierung oder Schein-Aerosolläufe werden ausgeführt, um die Stabilität und die Lebensfähigkeit eines Mittels zu testen, wenn sie in Aerosolform. Die Aerosol-Charakterisierung Prozess ahmt die tatsächliche Aerosol Herausforderung, und der Forscher wertet die Variablen mit Aerosolstudien verbunden. Ein weiterer Teil des Workflows ist die physikalische Manipulationen, Verwaltung oder Anästhetika oder andere Mittel oder Routineverfahren in Diagrammen für jeden NHP aufzuzeichnen. Diese Themenkarten werden gründlich analysiert Verfahrens Konsistenz und Standardisierung zu gewährleisten. Themen werden vor narkotisiert Exposition gegenüber Aerosol. Beispiel Anästhetika umfassen Tiletamin / Zolazepam, Ketamin / Acepromazin und ketamine. Anästhetika basieren auf der Minimierung der Atemunterdrückung und die Förderung der kontrollierten Steady-State-Atmung gewählt. Zusätzliche Anästhesie Lieferungen werden in den Tierversuchsräume beibehalten und auf dem Transferwagen mit dem NHP an den aerobiology ABSL-4 Schrank Labor transportiert. Innerhalb des ABSL-4 Anzug Labor, durchlaufen NHPs Plethysmografie über eine der beiden Methoden (dh Kopf-out - Plethysmographie, respiratorische induktive Plethysmographie [RIP]) Inspirationsatemvolumen zu bestimmen und bewerten 10-12 ändert sich die Atmung. Diese abgeleiteten Parameter werden für eine genaue Berechnung der geschätzten inhalierten Dosis des Pathogens unmittelbar vor oder während einer Aerosolexposition verwendet. Head-out - Plethysmographie verwendet eine lange, zylindrische Kammer, die die NHP 13 untergebracht ist . Der Druckabfall erzeugt wird, wenn ein Tier in dem Zylinder wird durch einen Pneumotachograph eingefangen, an den Verstärker weitergeleitet, durch den Wechselstrom / Gleich curren verarbeitett-Wandler und integriert in die Software, die oben Lungenparameter abzuleiten. RIP verwendet Sensoren von induktiven Coiled Kupferdrähten, die sich um das Thema der Brust in elastischen Bändern eingebettet sind und Bauch 11,12. Ein induktiver-Kondensator erzeugt ein Magnetfeld in dem Sensor. Atmung ändert das Magnetfeld, und die resultierenden Spannungsänderungen werden von einem Sender neben dem Gummiband zu einem Empfänger in dem Computer über kurzwelligen Ultrahochfrequenz-Funkwellen übertragen. Spezielle Software ermittelt aus insgesamt thorakalen Verschiebungsrate und Atemvolumen zu atmen. Die Minutenvolumen (MV), erhalten durch Plethysmographie wird bei der Berechnung der geschätzten inhalierten Dosis (D) verwendet. Beim Erzeugen und Abtasten eines Aerosols kann die Aerosolkonzentration (AC) wird durch Multiplikation der biosampler Konzentration (BC) durch das Volumen der Medien (V) und dividiert durch Ergebnis der Multiplikation der Flussrate des biosampler (FL) durch die berechnetenBelichtungszeit (T). Die vereinfachte Formel wird als AC = BC x V dargestellt ÷ FL x T. Im Gegenzug für die eigentliche Aerosol Herausforderung in nichtmenschlichen Primaten, wird D berechnet von AC durch MV und die Expositionsdauer (Zeit = T) multipliziert wird. Die vereinfachte Formel wird dargestellt als D = AC x MV x T. Der Zweck dieses Artikels ist es, visuell die gesamte Aerosol-Verfahren zeigen, mit nichtmenschlichen Primaten unter zwei Gesichtspunkten, die ABSL-4 Anzug Laborseite und der ABSL-4 Schrank Labor Seite. Obwohl diese Verfahren für verschiedene Praktiken allgemeiner Natur sein kann, erwähnt, sind sie auf die IRF-Frederick Aerobiologie Kern spezifisch und stellen die tatsächlichen Praktiken bei dieser Einrichtung verwendet. Dieser Artikel konzentriert sich auf die biologische Sicherheit Verfahren benötigt, um sicher ein Aerosol Herausforderung durchführen, nicht die eigentliche Aerosol Herausforderung selbst. Bei diesen Verfahren werden wir die Verwendung eines Dummy-Thema Biosicherheit Praktiken zu zeigen, da das Risiko im Zusammenhang mit einem NHP anesthetizing. Jedoch ist der Prozess der perfoeine Aerosol Herausforderung rming wird in allgemeiner Weise geschrieben, weil das Verfahren das gleiche, unabhängig von hoch Folge Pathogen verwendet wird. Wir wollen über die Unbilden Wissen und Verständnis der Wissenschaftler der Durchführung von Aerosolstudien mit hoher Konsequenz Erreger unter maximaler Einschließungsbedingungen zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>Micro-Chem Plus</td><td>National Chemical Laboratories</td><td>255</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Klasse III BSC</td><td>Keimfrei</td><td>DGB-10</td><td></td></tr><tr><td>Integrierte BSC Handschuhe</td><td>Piercan</td><td>10UY2032-9</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Management Platform (AeroMP)</td><td>Biaera Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Head-out Plethysmographie</td><td>Buxco/Data Sciences International</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Repriatorische induktive Plethysmographie</td><td>Data Sciences International</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zentrierter tangentialer Aerosolgenerator (CenTAG)</td><td>CH Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Collison Vernebler</td><td>BGI Inc.&nbsp;</td><td>CN25</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Getinge</td><td>GEB 2404 AMB-2</td><td></td></tr><tr><td>Sperian Überdruckanzug</td><td>Honeywell Safety Products</td><td>BSL 4-2</td><td></td></tr><tr><td>Außenhandschuhe (Latex, Ansell Canners and Handlers)</td><td>Fisher</td><td>19-019-601</td><td></td></tr><tr><td>Außenhandschuhe (Nitril/Gummi, MAPA)</td><td>Fisher</td><td>2MYU1</td><td></td></tr><tr><td>Scrubs</td><td>Cintas</td><td>60975/60976</td><td></td></tr><tr><td>Socken</td><td>Cintas</td><td>944</td><td></td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>Pack-N-Tape</td><td>51131069695</td><td></td></tr><tr><td>Handtücher</td><td>Cintas</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>O-Ringe</td><td>O-Ring Lager</td><td>AS568-343</td><td></td></tr><tr><td>Überschuhe</td><td>Amazon</td><td>B0034KZE22</td><td></td></tr><tr><td>Zip Lube</td><td>Amazon</td><td>B000GKBEJA</td><td></td></tr></tbody></table>

sicherheitsvorkehrungen und betriebsverfahren in einem (a) bsl-4-labor: 3. aerobiologie

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 3. Aerobiology

Aerosol- oder Inhalationsstudien von Krankheitserregern mit hoher Konsequenz haben in letzter Zeit aufgrund der wahrgenommenen Bedrohung durch absichtliche Aerosolfreisetzungen oder unerwartete natürliche Aerosolübertragung zugenommen. Spezielle Labore, die für die Durchführung dieser Experimente konzipiert sind, erfordern enorme technische Kontrollen, um eine sichere Arbeitsumgebung und eine ständige Systemwartung zu gewährleisten, um die Funktionalität aufrechtzuerhalten. Biosicherheitswerkbänke der Klasse III, auch Gloveboxen genannt, sind gasdichte Gehäuse mit nicht zu öffnenden Fenstern. Diese Schränke werden durch doppelte HEPA-gefilterte Abluftsysteme (High Efficiency Particulate-Air) unter Unterdruck gehalten und sind das ideale primäre Containment für die Unterbringung von Aerosolisierungsgeräten. Ein gut geplanter Arbeitsablauf zwischen den Mitarbeitern innerhalb eines Hochsicherheitsbehälters, z. B. von einem Labor der Tierschutzstufe 4 (ABSL-4) bis zum ABSL-4-Schranklabor, ist eine entscheidende Komponente für erfolgreiche Experimente. Für eine reibungslose Durchführung der Studie müssen die Mitarbeiter die Abläufe vor Beginn der Studie sorgfältig planen, um ein Kommunikationsnetzwerk aufzubauen, Geräte und Probanden zu bewegen sowie Geräte einzurichten und zu platzieren. Hier geben wir einen Überblick und eine visuelle Darstellung, wie die aerobiologische Forschung an den National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Integrated Research Facility in Fort Detrick, Maryland, USA, in einer ABSL-4-Umgebung durchgeführt wird.

Die Klasse III Biosicherheitsschrank (BSC) ist eine hermetisch dichte Edelstahl - Gehäuse eine ABSL-4 - Umgebung unter Unterdruck innerhalb eines ABSL-4 Schrank Labor (Abbildung 1) enthält. Die Materialien können in die BSC durch das Personal im Labor ABSL-4 Schrank Arbeits eingeführt werden durch einen Unterschrank montierte Edelstahltank (üblicherweise bezeichnet als &quot;dunk Tank&quot; in ABSL-4 oder BSL-4-Einstellungen), die eine 5 % dual quaternären Ammonium (n-al...

Da Krankheitserreger mit hoher Konsequenz möglicherweise Probanden durch luftgetragene Partikel infizieren können, wird die Aerobiologie zunehmend in der Pathogeneseforschung und der Entwicklung medizinischer Gegenmaßnahmen eingesetzt. Wir präsentieren eine detaillierte visuelle Demonstration aerobiologischer Verfahren während einer Aerosol-Provokation bei nichtmenschlichen Primaten in einer tierischen Biosicherheitsstufe 4 mit maximalem Containment.

Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 3. Aerobiologie

Aerosol or inhalational studies of high-consequence pathogens have recently been increasing in number due to the perceived threat of intentional aerosol ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein allgemeines Verständnis der Verfahren für Laboraerosole in Tier-Biosicherheitslaboratorien der Stufe IV unter Verwendung von Sicherheitswerkbänken zu vermitteln, die die Sicherheit der Laborforscher gewährleisten. Die Visualisierung dieses Protokolls verdeutlicht die Komplexität und die Sicherheitsaspekte gegenüber Gesundheitsadministratoren, die den Entwurf ähnlicher Gebäude in Erwägung ziehen, sowie gegenüber externen Kooperationspartnern, die an Studien zu hochgradig gefährlichen Krankheitserregern beteiligt sind. Der entscheidende Vorteil dieser Technik, bei der druckabsenkende Sicherheitswerkbänke der Klasse III für Aerosol-Experimente verwendet werden, liegt darin, dass das Laborpersonal sicher aerobiologische Forschung betreiben kann, ohne Druckanzüge mit positivem Druck tragen zu müssen.Als leitender Aerobiologe werde ich das Verfahren gemeinsam mit Kyle Bohannon, dem Aerosolingenieur aus unserem Labor, demonstrieren. Überprüfen Sie die Funktionsfähigkeit des Schnelltransportsystems (RTP) und der an aerobiologischen Verfahren beteiligten Ausrüstung, einschließlich der Türen des Transportwagens und des RTP, das den Transportwagen durch die Wand mit dem Biosicherheitswerkbank der Klasse III (BSC) verbindet. Verriegeln Sie das RTP an seiner Position.Überwachen und dokumentieren Sie alle physikalischen Manipulationen, Verabreichungen oder routinemäßigen Verfahren in den Aufzeichnungen für jeden nichtmenschlichen Primaten (NHP). Falls zusätzliche Anästhesie erforderlich ist, stellen Sie sicher, dass alle entfernten Kappen, verwendeten Nadeln, Kanülen und Spritzen in einem geeigneten Behälter für spitze Gegenstände entsorgt werden. Setzen Sie keine Nadeln nach der Verwendung erneut auf.Transportieren Sie anästhesierte NHPs in durchsichtigen Behältern, die mit einem Verschluss an dem Deckel der Transportbox gesichert sind. Stellen Sie die Transportbehälter auf einen mobilen Wagen, um vollständig verkleideten Forschern die freie Bewegung unter Verwendung von Atemluftschläuchen durch luftdruckbeständige Türen zu ermöglichen. Nach Abschluss einer Aerosol-Belastung wird das NHP in den Transportwagen gestellt und in den Heimkäfig zurückgebracht.Gleichzeitig mit der von Mitarbeitern der vergleichenden Medizin durchgeführten Tiervorbereitung die Funktionsfähigkeit des dekontaminierten Sicherheitswerksprüfen. Überprüfen, ob der Unterdruck im Sicherheitswerk der Klasse III innerhalb des vorgegebenen Bereichs aufrechterhalten wird. Das Sicherheitswerk der Klasse III auf mögliche Lecks oder Risse untersuchen.Überprüfen Sie die synthetischen Gummihandschuhe und O-Ringe an der dekontaminierten Klasse-III-BSC auf Schwachstellen, Risse, Einrisse oder Trockenfäule. Zu diesem Zeitpunkt ist der Biosicherheitswerkbank der Klasse III nicht kontaminiert. Ersetzen Sie beschädigte synthetische Gummihandschuhe und/oder O-Ringe der Klasse-III-BSC.Überprüfen Sie den Tauchbehälter und stellen Sie sicher, dass er bis zur markierten Höhe mit Desinfektionsmittel gefüllt ist, entweder drei Zoll über der Eintauchblende oder bis zu einer markierten Linie im Inneren des Tauchbehälters. Stellen Sie mithilfe eines Leitfähigkeitsmessgeräts sicher, dass die Konzentration des Desinfektionsmittels im Tauchbehälter mindestens 3.500 Mikrosiemens oder 3,5 Millisiemens beträgt. Stellen Sie sicher, dass die Sicherheitswerkbank der Klasse III funktionsfähig ist, um kontaminierte Abfälle und Geräte nach Abschluss des Experiments aufzunehmen, oder um Geräte, die für das Experiment einmalig benötigt werden, vom Autoklav-Portal in die Sicherheitswerkbank der Klasse III zu befördern.Autoklavieren Sie nur die Geräte, die dafür bekannt sind, die Belastungen des Verfahrens zu überstehen. Prüfen Sie die Funktionsfähigkeit anderer Aerobiologie-Geräte, zum Beispiel die elektronischen Anschlüsse und Steckdosen.Legen Sie die mit Handschuhen bedeckten Hände in die an den Sicherheitswerkbank der Klasse III angebrachten synthetischen Gummihandschuhe. Bauen Sie die für NHPs bestimmte Kopf-Expositions-Kammer, das Konditionierungsrohr und die Aerosol-Managementsystemplattform zusammen. Befestigen Sie einen Aerosolgenerator am Konditionierungsrohr und den aerodynamischen Partikelgrößenmesser an der für NHPs bestimmten Kopf-Expositions-Kammer.Ziehen Sie die behandschuhten Hände aus den befestigten synthetischen Gummihandschuhen zurück. Entsorgen Sie die persönlichen Handschuhe jedes Mal als biohazardöse Abfälle, wenn die behandschuhten Hände aus den befestigten synthetischen Gummihandschuhen entfernt werden. Starten Sie danach die Aerosol-Protokoll-Software auf dem Laptop.Geben Sie die geeignete NHP-Kopfexpositions-Kammer, das Aerosol-Generator- und Biosampler-Durchflussvolumen sowie administrative Informationen in die Softwaremenüs ein. Nehmen Sie den bereits vorbereiteten Erreger über den Schnelltransfertansport entgegen und füllen Sie den Aerosol-Generator mit dem Erreger. Der Biosicherheitsschrank der Klasse III ist nun kontaminiert.Über die Aerosol-Software den Aerosolgenerator einschalten. Der Erreger aus dem Aerosolgenerator füllt die Expositions­kammer. Nach dem Ausschalten des Aerosolgenerators das Herausforderungs­material entleeren und in einen gefährlichen Abfallbeutel entsorgen, der sich innerhalb des Biosicherheits­schrankes der Klasse III befindet.Füllen Sie als Nächstes den Biosampler mit Sammelmedium und befestigen Sie den gefüllten Biosampler an der für NHPs vorgesehenen Kopf-Expositions-Kammer. Schließen Sie die geeignete Vakuumleitung an den Biosampler an. Überprüfen Sie, ob die Anästhesietiefe des NHP ausreichend ist, wie durch Unempfindlichkeit gegenüber äußeren Reizen, Muskeltonus sowie stabile Atem- und Herzfrequenzen gezeigt wird.Führen Sie das anästhetisierte NHP durch das RTP in den BSC der Klasse III ein. Legen Sie das NHP in Rückenlage auf die Expositionsrampe. Überprüfen Sie visuell und mit einem tragbaren Tiermonitor, ob die Vitalzeichen des NHP stabil sind.Kalibrieren Sie die Ateminduktionsplethysmographie, oder RIP, vor dem Experiment gemäß der Anleitung des Herstellers. Legen Sie die Ateminduktionsplethysmographie-Bänder um Bauch und Brust des NHP an. Überprüfen Sie, ob diese Bänder richtig sitzen und die elektronischen Verbindungen fest eingerastet sind.Als Nächstes platzieren Sie die Numatech-Kalibrierungsmaske über der Schnauze des NHP. Überprüfen Sie anschließend, ob eine Dichtung um die Schnauze des NHP herum gebildet wird. Kalibrieren Sie die RIP-Bänder mit einer Numatech-Kalibrierungsmaske unter Verwendung von Computer-Software.Nach Abschluss des Vorgangs die Kalibrierungsmaske entfernen. Die Atemparameter aufzeichnen und die Atemdaten für jedes Tier über ein kompatibles Programm exportieren. Den Kopf des nichtmenschlichen Primaten vorsichtig durch die am Kopfport des Kopf-benannt-belichtungsgefäßes befestigte Gummizahnseide führen.Stellen Sie sicher, dass der gummiartige Zahnhalter während der Aerosolexposition eine Abdichtung um den Hals des nichtmenschlichen Primaten (NHP) bildet. Geben Sie das Zielvolumen der akkumulierten Aerosolmenge und die erforderlichen Gerätekennungen, die für jeden Expositionsansatz relevant sind, in die Software ein und starten Sie das Aerosolverfahren. Sobald der NHP das Zielvolumen der akkumulierten Aerosolmenge eingeatmet hat, schaltet sich das System ab.Lösen Sie die RIP-Bänder und legen Sie sie neben den NHP auf das Bett. Wischen Sie den NHP mit einem mit einer ein- bis zweiprozentigen Chlorhexidinlösung getränkten Mulltuch ab, wobei Sie besonders vorsichtig um die Augen des NHP herum vorgehen sollten. Tupfen Sie den Kopf des NHP ab, um überschüssige Lösung zu entfernen.Bringen Sie das NHP erneut durch die RTP zu den Forschern im ABSL-4-Aerobiologie-Schutzanzuglabor zurück. Leeren Sie den Aerosolgenerator und jegliches verbleibende Herausforderungsmaterial in den gefährlichen Abfallbeutel, der Abfall, Einwegausrüstung und zu drei Vierteln gefüllte Spitzenbehälter enthält. Geben Sie das Sammelmedium aus dem Aerosol-Biosampler in die entsprechend beschrifteten Sammelgefäße.Stellen Sie die Sammelgefäße zur Bestimmung einer geschätzten inhalierten Dosis für den entsprechenden Bio-Assay in einen Eimer mit feuchtem Eis. Geben Sie die Probenröhrchen und den Eimer anschließend durch die RTP. Der Biosicherheitsschrank der Klasse III ist ein hermetisch verschlossener Edelstahlschrank unter Unterdruck innerhalb eines Tier-Biosicherheitslabors der Stufe IV.Materialien werden von Mitarbeitern, die in einem Tier-Biosicherheitslabor der Stufe IV arbeiten, über einen unterhalb des Sicherheitswerkbanks montierten Edelstahltank – einen sogenannten Tauchbecken – in die Biosicherheitswerkbank eingeführt, der eine fünfprozentige Lösung aus dualer quartärer Ammoniumverbindung als Desinfektionsmittel enthält. Da die Sicherheitswerkbank in die Wand integriert ist, die das Kabinettlabor von einem ABSL-4-Anzugslabor trennt, können Materialien, Tiere und virale Pathogene auch von der Seite des Anzugslabors aus mithilfe eines Transportwagens und eines RTP in die Sicherheitswerkbank verbracht werden. Sobald die Türen des Transferwagens zum ABSL-4-Anzugslabor hin geöffnet werden, gilt die Biosicherheitswerkbank der Klasse III als kontaminiert.Gegenstände innerhalb des Sicherheitswerkbanks können von Mitarbeitern, die verschiedene Arten synthetischer Gummihandschuhe tragen, von außen manipuliert werden. Diese Gegenstände, ausgenommen infektiöse Proben, werden nach der Sterilisation über einen Doppeltürautoklaven oder nach der Desinfektion über den Tauchbehälter aus der Sicherheitswerkbank entfernt. Durch die Überprüfung, ob die Sicherheitswerkbank der Klasse III und die Bio-Aerosol-Ausrüstung ordnungsgemäß funktionieren, wird ein sicherer und korrekt arbeitender Arbeitsbereich aufrechterhalten, der für die Sicherheit des Personals von zentraler Bedeutung ist.Durch die strikte Einhaltung dieser Verfahren und Praktiken wurden bei der Bioaerosolforschung in der Integrated Research Facility in Frederick keine im Labor erworbenen Infektionen registriert. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie zügig durchgeführt werden, sodass mehrere Expositionen an nichtmenschlichen Primaten an einem Tag möglich sind. Achten Sie während des Verfahrens darauf, eine ausreichende Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten.Ohne eine stabile Sedierung wird die Erfassung mittels Plethysmographie deutlich schwieriger. Mit dieser Vorgehensweise können weitere Aerobiologie-Experimente an kleineren Arten wie Kaninchen und Mäusen durchgeführt werden. Diese Technik ermöglicht es Aerobiologie-Forschern, Variablen, die die Dosimetrie beeinflussen – wie Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit und die Effizienz des Biosamplers – zu kontrollieren, um eine präzise inhalierte Dosis zu verabreichen.Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der Biosicherheitsvorkehrungen besitzen, die während aerobiologischer Experimente getroffen werden. Vorkehrungen wie mehrfache Wechsel der persönlichen Handschuhe sollten potenzielle im Labor erworbene Infektionen verringern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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