Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 3. Aerobiologie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, ein allgemeines Verständnis der Verfahren für Laboraerosole in Tier-Biosicherheitslaboratorien der Stufe IV unter Verwendung von Sicherheitswerkbänken zu vermitteln, die die Sicherheit der Laborforscher gewährleisten. Die Visualisierung dieses Protokolls verdeutlicht die Komplexität und die Sicherheitsaspekte gegenüber Gesundheitsadministratoren, die den Entwurf ähnlicher Gebäude in Erwägung ziehen, sowie gegenüber externen Kooperationspartnern, die an Studien zu hochgradig gefährlichen Krankheitserregern beteiligt sind. Der entscheidende Vorteil dieser Technik, bei der druckabsenkende Sicherheitswerkbänke der Klasse III für Aerosol-Experimente verwendet werden, liegt darin, dass das Laborpersonal sicher aerobiologische Forschung betreiben kann, ohne Druckanzüge mit positivem Druck tragen zu müssen.

Als leitender Aerobiologe werde ich das Verfahren gemeinsam mit Kyle Bohannon, dem Aerosolingenieur aus unserem Labor, demonstrieren. Überprüfen Sie die Funktionsfähigkeit des Schnelltransportsystems (RTP) und der an aerobiologischen Verfahren beteiligten Ausrüstung, einschließlich der Türen des Transportwagens und des RTP, das den Transportwagen durch die Wand mit dem Biosicherheitswerkbank der Klasse III (BSC) verbindet. Verriegeln Sie das RTP an seiner Position.

Überwachen und dokumentieren Sie alle physikalischen Manipulationen, Verabreichungen oder routinemäßigen Verfahren in den Aufzeichnungen für jeden nichtmenschlichen Primaten (NHP). Falls zusätzliche Anästhesie erforderlich ist, stellen Sie sicher, dass alle entfernten Kappen, verwendeten Nadeln, Kanülen und Spritzen in einem geeigneten Behälter für spitze Gegenstände entsorgt werden. Setzen Sie keine Nadeln nach der Verwendung erneut auf.

Transportieren Sie anästhesierte NHPs in durchsichtigen Behältern, die mit einem Verschluss an dem Deckel der Transportbox gesichert sind. Stellen Sie die Transportbehälter auf einen mobilen Wagen, um vollständig verkleideten Forschern die freie Bewegung unter Verwendung von Atemluftschläuchen durch luftdruckbeständige Türen zu ermöglichen. Nach Abschluss einer Aerosol-Belastung wird das NHP in den Transportwagen gestellt und in den Heimkäfig zurückgebracht.

Gleichzeitig mit der von Mitarbeitern der vergleichenden Medizin durchgeführten Tiervorbereitung die Funktionsfähigkeit des dekontaminierten Sicherheitswerksprüfen. Überprüfen, ob der Unterdruck im Sicherheitswerk der Klasse III innerhalb des vorgegebenen Bereichs aufrechterhalten wird. Das Sicherheitswerk der Klasse III auf mögliche Lecks oder Risse untersuchen.

Überprüfen Sie die synthetischen Gummihandschuhe und O-Ringe an der dekontaminierten Klasse-III-BSC auf Schwachstellen, Risse, Einrisse oder Trockenfäule. Zu diesem Zeitpunkt ist der Biosicherheitswerkbank der Klasse III nicht kontaminiert. Ersetzen Sie beschädigte synthetische Gummihandschuhe und/oder O-Ringe der Klasse-III-BSC.

Überprüfen Sie den Tauchbehälter und stellen Sie sicher, dass er bis zur markierten Höhe mit Desinfektionsmittel gefüllt ist, entweder drei Zoll über der Eintauchblende oder bis zu einer markierten Linie im Inneren des Tauchbehälters. Stellen Sie mithilfe eines Leitfähigkeitsmessgeräts sicher, dass die Konzentration des Desinfektionsmittels im Tauchbehälter mindestens 3.500 Mikrosiemens oder 3,5 Millisiemens beträgt. Stellen Sie sicher, dass die Sicherheitswerkbank der Klasse III funktionsfähig ist, um kontaminierte Abfälle und Geräte nach Abschluss des Experiments aufzunehmen, oder um Geräte, die für das Experiment einmalig benötigt werden, vom Autoklav-Portal in die Sicherheitswerkbank der Klasse III zu befördern.

Autoklavieren Sie nur die Geräte, die dafür bekannt sind, die Belastungen des Verfahrens zu überstehen. Prüfen Sie die Funktionsfähigkeit anderer Aerobiologie-Geräte, zum Beispiel die elektronischen Anschlüsse und Steckdosen.

Legen Sie die mit Handschuhen bedeckten Hände in die an den Sicherheitswerkbank der Klasse III angebrachten synthetischen Gummihandschuhe. Bauen Sie die für NHPs bestimmte Kopf-Expositions-Kammer, das Konditionierungsrohr und die Aerosol-Managementsystemplattform zusammen. Befestigen Sie einen Aerosolgenerator am Konditionierungsrohr und den aerodynamischen Partikelgrößenmesser an der für NHPs bestimmten Kopf-Expositions-Kammer.

Ziehen Sie die behandschuhten Hände aus den befestigten synthetischen Gummihandschuhen zurück. Entsorgen Sie die persönlichen Handschuhe jedes Mal als biohazardöse Abfälle, wenn die behandschuhten Hände aus den befestigten synthetischen Gummihandschuhen entfernt werden. Starten Sie danach die Aerosol-Protokoll-Software auf dem Laptop.

Geben Sie die geeignete NHP-Kopfexpositions-Kammer, das Aerosol-Generator- und Biosampler-Durchflussvolumen sowie administrative Informationen in die Softwaremenüs ein. Nehmen Sie den bereits vorbereiteten Erreger über den Schnelltransfertansport entgegen und füllen Sie den Aerosol-Generator mit dem Erreger. Der Biosicherheitsschrank der Klasse III ist nun kontaminiert.

Über die Aerosol-Software den Aerosolgenerator einschalten. Der Erreger aus dem Aerosolgenerator füllt die Expositions­kammer. Nach dem Ausschalten des Aerosolgenerators das Herausforderungs­material entleeren und in einen gefährlichen Abfallbeutel entsorgen, der sich innerhalb des Biosicherheits­schrankes der Klasse III befindet.

Füllen Sie als Nächstes den Biosampler mit Sammelmedium und befestigen Sie den gefüllten Biosampler an der für NHPs vorgesehenen Kopf-Expositions-Kammer. Schließen Sie die geeignete Vakuumleitung an den Biosampler an. Überprüfen Sie, ob die Anästhesietiefe des NHP ausreichend ist, wie durch Unempfindlichkeit gegenüber äußeren Reizen, Muskeltonus sowie stabile Atem- und Herzfrequenzen gezeigt wird.

Führen Sie das anästhetisierte NHP durch das RTP in den BSC der Klasse III ein. Legen Sie das NHP in Rückenlage auf die Expositionsrampe. Überprüfen Sie visuell und mit einem tragbaren Tiermonitor, ob die Vitalzeichen des NHP stabil sind.

Kalibrieren Sie die Ateminduktionsplethysmographie, oder RIP, vor dem Experiment gemäß der Anleitung des Herstellers. Legen Sie die Ateminduktionsplethysmographie-Bänder um Bauch und Brust des NHP an. Überprüfen Sie, ob diese Bänder richtig sitzen und die elektronischen Verbindungen fest eingerastet sind.

Als Nächstes platzieren Sie die Numatech-Kalibrierungsmaske über der Schnauze des NHP. Überprüfen Sie anschließend, ob eine Dichtung um die Schnauze des NHP herum gebildet wird. Kalibrieren Sie die RIP-Bänder mit einer Numatech-Kalibrierungsmaske unter Verwendung von Computer-Software.

Nach Abschluss des Vorgangs die Kalibrierungsmaske entfernen. Die Atemparameter aufzeichnen und die Atemdaten für jedes Tier über ein kompatibles Programm exportieren. Den Kopf des nichtmenschlichen Primaten vorsichtig durch die am Kopfport des Kopf-benannt-belichtungsgefäßes befestigte Gummizahnseide führen.

Stellen Sie sicher, dass der gummiartige Zahnhalter während der Aerosolexposition eine Abdichtung um den Hals des nichtmenschlichen Primaten (NHP) bildet. Geben Sie das Zielvolumen der akkumulierten Aerosolmenge und die erforderlichen Gerätekennungen, die für jeden Expositionsansatz relevant sind, in die Software ein und starten Sie das Aerosolverfahren. Sobald der NHP das Zielvolumen der akkumulierten Aerosolmenge eingeatmet hat, schaltet sich das System ab.

Lösen Sie die RIP-Bänder und legen Sie sie neben den NHP auf das Bett. Wischen Sie den NHP mit einem mit einer ein- bis zweiprozentigen Chlorhexidinlösung getränkten Mulltuch ab, wobei Sie besonders vorsichtig um die Augen des NHP herum vorgehen sollten. Tupfen Sie den Kopf des NHP ab, um überschüssige Lösung zu entfernen.

Bringen Sie das NHP erneut durch die RTP zu den Forschern im ABSL-4-Aerobiologie-Schutzanzuglabor zurück. Leeren Sie den Aerosolgenerator und jegliches verbleibende Herausforderungsmaterial in den gefährlichen Abfallbeutel, der Abfall, Einwegausrüstung und zu drei Vierteln gefüllte Spitzenbehälter enthält. Geben Sie das Sammelmedium aus dem Aerosol-Biosampler in die entsprechend beschrifteten Sammelgefäße.

Stellen Sie die Sammelgefäße zur Bestimmung einer geschätzten inhalierten Dosis für den entsprechenden Bio-Assay in einen Eimer mit feuchtem Eis. Geben Sie die Probenröhrchen und den Eimer anschließend durch die RTP. Der Biosicherheitsschrank der Klasse III ist ein hermetisch verschlossener Edelstahlschrank unter Unterdruck innerhalb eines Tier-Biosicherheitslabors der Stufe IV.

Materialien werden von Mitarbeitern, die in einem Tier-Biosicherheitslabor der Stufe IV arbeiten, über einen unterhalb des Sicherheitswerkbanks montierten Edelstahltank – einen sogenannten Tauchbecken – in die Biosicherheitswerkbank eingeführt, der eine fünfprozentige Lösung aus dualer quartärer Ammoniumverbindung als Desinfektionsmittel enthält. Da die Sicherheitswerkbank in die Wand integriert ist, die das Kabinettlabor von einem ABSL-4-Anzugslabor trennt, können Materialien, Tiere und virale Pathogene auch von der Seite des Anzugslabors aus mithilfe eines Transportwagens und eines RTP in die Sicherheitswerkbank verbracht werden. Sobald die Türen des Transferwagens zum ABSL-4-Anzugslabor hin geöffnet werden, gilt die Biosicherheitswerkbank der Klasse III als kontaminiert.

Gegenstände innerhalb des Sicherheitswerkbanks können von Mitarbeitern, die verschiedene Arten synthetischer Gummihandschuhe tragen, von außen manipuliert werden. Diese Gegenstände, ausgenommen infektiöse Proben, werden nach der Sterilisation über einen Doppeltürautoklaven oder nach der Desinfektion über den Tauchbehälter aus der Sicherheitswerkbank entfernt. Durch die Überprüfung, ob die Sicherheitswerkbank der Klasse III und die Bio-Aerosol-Ausrüstung ordnungsgemäß funktionieren, wird ein sicherer und korrekt arbeitender Arbeitsbereich aufrechterhalten, der für die Sicherheit des Personals von zentraler Bedeutung ist.

Durch die strikte Einhaltung dieser Verfahren und Praktiken wurden bei der Bioaerosolforschung in der Integrated Research Facility in Frederick keine im Labor erworbenen Infektionen registriert. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie zügig durchgeführt werden, sodass mehrere Expositionen an nichtmenschlichen Primaten an einem Tag möglich sind. Achten Sie während des Verfahrens darauf, eine ausreichende Anästhesietiefe aufrechtzuerhalten.

Ohne eine stabile Sedierung wird die Erfassung mittels Plethysmographie deutlich schwieriger. Mit dieser Vorgehensweise können weitere Aerobiologie-Experimente an kleineren Arten wie Kaninchen und Mäusen durchgeführt werden. Diese Technik ermöglicht es Aerobiologie-Forschern, Variablen, die die Dosimetrie beeinflussen – wie Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit und die Effizienz des Biosamplers – zu kontrollieren, um eine präzise inhalierte Dosis zu verabreichen.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der Biosicherheitsvorkehrungen besitzen, die während aerobiologischer Experimente getroffen werden. Vorkehrungen wie mehrfache Wechsel der persönlichen Handschuhe sollten potenzielle im Labor erworbene Infektionen verringern.