Name: Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Überwachung von Gallensäure-Dynamiken in lebenden Zellen mit einem genetisch kodierten FRET-Sensor. Diese Methode ermöglicht direkte Beobachtungen ohne Markierung und liefert wertvolle Einblicke in den Stoffwechsel.

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Diese Arbeit wurde durch ERC Starting Grants (ERC-2011-StG 280255 und ERC-2013-StG 337479) und durch die niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung (Vidi 91713319) unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines neuen genetisch codierten Gallensäuresensor zur Überwachung des raumzeitlichen Dynamik der Gallensäure-Transport in lebenden Zellen. Dieser Biosensor besteht aus cerulean und Citrin fluoreszierende Proteine, die FXR-LBD verschmolzen werden, wodurch ein FRET-Gallensäuresensor (BAS) bilden. Die Gallensäure-Sensor ist relativ einfach und bequem im Einsatz, wenn mit grundlegenden Erfahrungen mit Zellkultur und FACS oder (konfo...

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist weit verbreitet, um ein besseres Verständnis der Zellfunktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung 1 zu gewinnen. FRET wird Energie von einem angeregten Donor-Fluorophor mit einem Akzeptor-Fluorophor übertragen. FRET-Effizienz hängt stark von der Entfernung zwischen dem Donor und dem Akzeptor-Fluorophor und deren Ausrichtung und damit eine empfindliche Auslesen von Konformationsänderungen, welche die beiden Fluorophore beeinflussen. Dieses Phänomen wird genutzt, um FRET-Biosensoren für die Bildgebung von kleinen Molekülen zu erzeugen. Änderungen in deren Konzentration überwacht werden erhöht / verringert sich im Verhältnis der Emissionsintensität des Akzeptors gegen Donorfluorophors 2. Zum Beispiel ermöglichen eine schnelle und stabile Erfassung von freien Calciumkonzentrationen in lebenden Zellen 3 FRET-basierten Biosensoren Calcium. Weitere Vorteile der FRET-Biosensoren sind in einzelnen lebenden Zellen Bildgebung, tErben Nichtinvasivität, ihrer Fähigkeit, an verschiedenen Zelltypen und Zellkompartimente 4 ausgerichtet sein. Viele Aspekte der intrazellulären Gallensäure Dynamik noch weitgehend unverstanden. Zum Beispiel ist wenig über den Mechanismus zugrunde liegende Regelung von konjugierten und nicht konjugierten Gallensäure-Transport bekannt. Bestehende Techniken zur Überwachung dieser Transport vor allem nutzen Luciferase-basierte Reportern, radioaktiv markierte Gallensäuren oder fluoreszierenden Gallensäure-Analoga. Letztere erfordert eine Modifikation der Gallensäuren, gegebenenfalls deren Eigenschaften zu beeinflussen. Luciferase-basierte Reporter haben schlechte Zeitauflösung. Außerdem führen diese Techniken zu einem Verlust der Probe und nicht anwendbar für die Bildgebung in einzelnen Zellen. Daher wäre es von Vorteil, um Methoden, die Live-Single-Cell-Imaging von Speditionstätigkeit ermöglichen mit FRET Biosensoren nutzen, zumal es beinhaltet den Vorteil, ratiometrische Detektion 5, 6. Während Varianten von CFP / YFP Form am häufigsten verwendeten FRET-Paare, neue Strategien durch MORANGE und mCherry tragenden Selbstassoziation induzierenden Mutationen zu einer Ausdehnung des FRET-Toolbox mit neuartigen Sensoren, einschließlich eines rotverschoben Gallensäuresensor 7 geführt. Wir eine genetisch kodierte FRET Gallensäuresensor (BAS), das aus einem Donor-Fluorophor (himmel) und einem Akzeptor-Fluorophor (Citrine), die mit dem Farnesoid X-Rezeptor (FXR) Liganden-Bindungsdomäne fusioniert sind, besteht eine zuvor (FXR-LBD) und ein Peptid, das ein LXXLL-Motiv 8. Dieses Peptid assoziiert mit dem FXR-LBD in einem Gallensäure-abhängige Weise. Nach FXR-Aktivierung wird die Distanz zwischen Citrin und cerulean ändern aufgrund einer Konformationsänderung. In Säugetierzelllinien, FXR-Aktivierung führt zu einer deutlich spürbaren Erhöhung der Citrine / cerulean Verhältnis, während das gereinigte Sensor arbeitet in entgegengesetzter Richtung und führt zu einer verringerten FRET Verhältnis auf FXR-Aktivierung. Dieser Sensor (CytoBAS)ermöglicht die Überwachung von zytosolischen Gallensäure-Dynamik. Durch Carboxy-terminale Addition von subzellulären Targeting-Motive kann der BAS-Konstrukts in den Zellkern (NucleoBAS) und Peroxisomen (PeroxiBAS) ausgerichtet werden, so dass Messungen der Gallensäure-Konzentrationen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Obwohl die Zugabe des peroxisomalen Targeting-Motiv nicht seiner Anpassungsfähigkeit an Gallensäuren zu beeinträchtigen, hat zellpermeablen FXR-Liganden induziert jedem Bund Änderungen PeroxiBAS Inneren Peroxisomen 8. Wie die Natur dieser Diskrepanz nicht bekannt ist, das Protokoll unten auf CytoBAS und NucleoBAS konzentriert. Die Verwendung dieser genetisch kodierte FRET Sensor wurde kürzlich in den Zellen der Leber-Gallensäure-Transporter Na + / Taurocholat co-transportierenden Polypeptids (NTCP) und gelöstem organischen Stoff transporter alpha / beta (OSTαβ) 8, enthaltend gezeigt. NTCP ist der Hauptlebergallensäure Importeur und OSTαβ ist eine basolaterale Darm-Galle-Transporter, die sowohl als Importeur und Exporteur von der elektrochemischen Gallensäure Konzentrationsgradienten 9, 10 funktionieren kann. Neuere Daten zeigen, dass bei der Gallensäure-Transport durch NTCP und / oder OSTαβ, robusten und schnellen Reaktionen in FRET-Verhältnis infolge der Ligand-FXR-LBD Wechselwirkung beobachtet werden. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für Methoden zur FRET zu messen, wie die konfokale mikroskopische Analyse und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), markieren wichtige Schritte, potenzielle Probleme anzugehen und alternative Methoden zu diskutieren. Mit dieser genetisch kodierte FRET-Sensor, können Gallensäure Interaktion mit FXR-LBD quantifiziert und direkt in lebenden Zellen überwacht werden und bietet eine schnelle und einfache Methode zur Visualisierung Gallensäuretransport und Dynamik in Echtzeit. Säuger-Expressionsplasmiden CytoBAS und NucleoBAS kodieren, sind im Handel erhältlich. Daher kann diese Biosensor weiter auf die beitragenVerständnis der Gallensäure-Transporter oder Verbindungen, die FXR aktivieren und einen tieferen Einblick in Gallensäure Biologie und Signalisierung.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgen</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NukleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifizierte Eagles-Medien (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Hohe Glukose ohne L-Glutamin</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Streptomycin)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (10x)</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Zellkulturflasche</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td>Lamininbeschichtete</td></tr><tr><td>T-175 Zellkulturflasche</td><td>VWR international</td><td>392-0238</td><td>Lamininbeschichtete</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>VWR international</td><td>734-0229</td><td>Poly-L-Lysin und Laminin beschichtete</td></tr><tr><td>10-cm-Schale</td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Laminin beschichtet</td></tr><tr><td>Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (Geneticin) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Klonierungszylinder (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz Kulturmedium</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Ohne Phenolrot</td></tr><tr><td>Polystyrol Rundbodenröhrchen (5 ml) Facs Röhrchen</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>ohne Verschluss, unsteril</td></tr><tr><td>Falcon 2.063 Röhrchen (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Schnappverschluss, steril</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8 Well Deckglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Aktivkohlegefiltert FBS</td><td>Life Technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Sonstige Chemikalien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit-Überwachung von intrazellulären gallensäure dynamics mit hilfe eines genetisch kodierte fret-gallensäure-sensor

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Überwachung der Proteinfaltung, -interaktion und -lokalisierung in einzelnen Zellen geworden. Biosensoren, die auf dem Prinzip der FRET basieren, haben die Echtzeit-Visualisierung von subzellulären Signalereignissen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht. Hier beschreiben wir die Anwendung eines genetisch kodierten Gallensäuresensors (BAS), der aus zwei Fluorophoren besteht, die mit der Farnesoid-X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne (FXR-LBD) fusioniert sind, wodurch ein Gallensäuresensor entsteht, der von einer großen Anzahl von Gallensäurespezies und anderen (synthetischen) FXR-Liganden aktiviert werden kann. Dieser Sensor kann auf verschiedene zelluläre Kompartimente ausgerichtet werden, einschließlich des Zellkerns (NucleoBAS) und des Zytosols (CytoBAS), um die Gallensäurekonzentrationen lokal zu messen. Es ermöglicht eine schnelle und einfache Quantifizierung des zellulären Gallensäureeinstroms, des Ausflusses und der subzellulären Verteilung endogener Gallensäuren, ohne dass eine Markierung mit Fluoreszenzmarkierungen oder Radionukleen erforderlich ist. Darüber hinaus können die BAS FRET-Sensoren für die Überwachung der FXR-Ligandenbindung nützlich sein. Schließlich zeigen wir, dass dieser FRET-Biosensor mit der Bildgebung anderer spektral unterschiedlicher Fluorophore kombiniert werden kann. Dies ermöglicht eine kombinierte Analyse der intrazellulären Gallensäuredynamik und i) der Lokalisierung und/oder Häufigkeit von Proteinen von Interesse oder ii) der intrazellulären Signalübertragung in einer einzelnen Zelle.

Die FRET-BAS Sensor enthalten, wird für die Ligandenbindungsdomäne von FXR (LBD-FXR) zwei Fluorophore Citrine und himmel) und ein LXXLL-Motiv angebracht basiert. Dieser Sensor ermöglicht Untersuchungen Gallensäuretransport in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung (Abbildung 1 A). Mutationen in cerulean und Citrin wurden angewendet, um die Bildung der intramolekularen Komplexes (Abbildung</...

Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die Gallensäuredynamik in lebenden Zellen mit einem genetisch kodierten BAS-FRET-Sensor zu untersuchen. Dieser Gallensäuresensor stellt ein einzigartiges Werkzeug zur Untersuchung (Regulierung) des Gallensäuretransports und der FXR-Aktivierung in einer Vielzahl von Zelltypen dar.

Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit einem genetisch kodierten FRET-Gallensäuresensor den Gallensäuretransport und die Dynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung einfach zu visualisieren. Dieser Sensor kann wichtige metabolische Fragen beantworten, wie z. B. die Beziehung von Galle und Dynamik zu Glukose, Lipiden und Energiestoffwechsel. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Gallensäuretransport nun direkt zu einzelnen lebenden Zellen überwacht werden kann, ohne dass Gallensäuren markiert werden müssen.Diese Methode kann Einblicke in den Transport und die Dynamik von Zell- und Gallensäuren geben. Es kann auch verwendet werden, um Effekte oder Aktivierungen und einzelne lebende Zellen zu visualisieren oder um die Bildgebung der Proteinlokalisation und des Gallensäuretransports zu kombinieren. Der genetisch kodierte Gallensäuresensor, im Folgenden der Sensor genannt, besteht aus einem Spender-Cerulean-Fluorophor und einem ausgenommenen Citrin-Fluorophor.Die beiden Fluorophore sind durch die Ligandenbindungsdomäne des FXR-Kerngallensäurerezeptors verbunden, der mit einem FXR-Co-Faktor, dem Peptid, fusioniert ist. Zwei manipulierte Aminosäur

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