Name: Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Überwachung von Gallensäure-Dynamiken in lebenden Zellen mit einem genetisch kodierten FRET-Sensor. Diese Methode ermöglicht direkte Beobachtungen ohne Markierung und liefert wertvolle Einblicke in den Stoffwechsel.

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Diese Arbeit wurde durch ERC Starting Grants (ERC-2011-StG 280255 und ERC-2013-StG 337479) und durch die niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung (Vidi 91713319) unterstützt.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines neuen genetisch codierten Gallensäuresensor zur Überwachung des raumzeitlichen Dynamik der Gallensäure-Transport in lebenden Zellen. Dieser Biosensor besteht aus cerulean und Citrin fluoreszierende Proteine, die FXR-LBD verschmolzen werden, wodurch ein FRET-Gallensäuresensor (BAS) bilden. Die Gallensäure-Sensor ist relativ einfach und bequem im Einsatz, wenn mit grundlegenden Erfahrungen mit Zellkultur und FACS oder (konfo...

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist weit verbreitet, um ein besseres Verständnis der Zellfunktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung 1 zu gewinnen. FRET wird Energie von einem angeregten Donor-Fluorophor mit einem Akzeptor-Fluorophor übertragen. FRET-Effizienz hängt stark von der Entfernung zwischen dem Donor und dem Akzeptor-Fluorophor und deren Ausrichtung und damit eine empfindliche Auslesen von Konformationsänderungen, welche die beiden Fluorophore beeinflussen. Dieses Phänomen wird genutzt, um FRET-Biosensoren für die Bildgebung von kleinen Molekülen zu erzeugen. Änderungen in deren Konzentration überwacht werden erhöht / verringert sich im Verhältnis der Emissionsintensität des Akzeptors gegen Donorfluorophors 2. Zum Beispiel ermöglichen eine schnelle und stabile Erfassung von freien Calciumkonzentrationen in lebenden Zellen 3 FRET-basierten Biosensoren Calcium. Weitere Vorteile der FRET-Biosensoren sind in einzelnen lebenden Zellen Bildgebung, tErben Nichtinvasivität, ihrer Fähigkeit, an verschiedenen Zelltypen und Zellkompartimente 4 ausgerichtet sein. Viele Aspekte der intrazellulären Gallensäure Dynamik noch weitgehend unverstanden. Zum Beispiel ist wenig über den Mechanismus zugrunde liegende Regelung von konjugierten und nicht konjugierten Gallensäure-Transport bekannt. Bestehende Techniken zur Überwachung dieser Transport vor allem nutzen Luciferase-basierte Reportern, radioaktiv markierte Gallensäuren oder fluoreszierenden Gallensäure-Analoga. Letztere erfordert eine Modifikation der Gallensäuren, gegebenenfalls deren Eigenschaften zu beeinflussen. Luciferase-basierte Reporter haben schlechte Zeitauflösung. Außerdem führen diese Techniken zu einem Verlust der Probe und nicht anwendbar für die Bildgebung in einzelnen Zellen. Daher wäre es von Vorteil, um Methoden, die Live-Single-Cell-Imaging von Speditionstätigkeit ermöglichen mit FRET Biosensoren nutzen, zumal es beinhaltet den Vorteil, ratiometrische Detektion 5, 6. Während Varianten von CFP / YFP Form am häufigsten verwendeten FRET-Paare, neue Strategien durch MORANGE und mCherry tragenden Selbstassoziation induzierenden Mutationen zu einer Ausdehnung des FRET-Toolbox mit neuartigen Sensoren, einschließlich eines rotverschoben Gallensäuresensor 7 geführt. Wir eine genetisch kodierte FRET Gallensäuresensor (BAS), das aus einem Donor-Fluorophor (himmel) und einem Akzeptor-Fluorophor (Citrine), die mit dem Farnesoid X-Rezeptor (FXR) Liganden-Bindungsdomäne fusioniert sind, besteht eine zuvor (FXR-LBD) und ein Peptid, das ein LXXLL-Motiv 8. Dieses Peptid assoziiert mit dem FXR-LBD in einem Gallensäure-abhängige Weise. Nach FXR-Aktivierung wird die Distanz zwischen Citrin und cerulean ändern aufgrund einer Konformationsänderung. In Säugetierzelllinien, FXR-Aktivierung führt zu einer deutlich spürbaren Erhöhung der Citrine / cerulean Verhältnis, während das gereinigte Sensor arbeitet in entgegengesetzter Richtung und führt zu einer verringerten FRET Verhältnis auf FXR-Aktivierung. Dieser Sensor (CytoBAS)ermöglicht die Überwachung von zytosolischen Gallensäure-Dynamik. Durch Carboxy-terminale Addition von subzellulären Targeting-Motive kann der BAS-Konstrukts in den Zellkern (NucleoBAS) und Peroxisomen (PeroxiBAS) ausgerichtet werden, so dass Messungen der Gallensäure-Konzentrationen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Obwohl die Zugabe des peroxisomalen Targeting-Motiv nicht seiner Anpassungsfähigkeit an Gallensäuren zu beeinträchtigen, hat zellpermeablen FXR-Liganden induziert jedem Bund Änderungen PeroxiBAS Inneren Peroxisomen 8. Wie die Natur dieser Diskrepanz nicht bekannt ist, das Protokoll unten auf CytoBAS und NucleoBAS konzentriert. Die Verwendung dieser genetisch kodierte FRET Sensor wurde kürzlich in den Zellen der Leber-Gallensäure-Transporter Na + / Taurocholat co-transportierenden Polypeptids (NTCP) und gelöstem organischen Stoff transporter alpha / beta (OSTαβ) 8, enthaltend gezeigt. NTCP ist der Hauptlebergallensäure Importeur und OSTαβ ist eine basolaterale Darm-Galle-Transporter, die sowohl als Importeur und Exporteur von der elektrochemischen Gallensäure Konzentrationsgradienten 9, 10 funktionieren kann. Neuere Daten zeigen, dass bei der Gallensäure-Transport durch NTCP und / oder OSTαβ, robusten und schnellen Reaktionen in FRET-Verhältnis infolge der Ligand-FXR-LBD Wechselwirkung beobachtet werden. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für Methoden zur FRET zu messen, wie die konfokale mikroskopische Analyse und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), markieren wichtige Schritte, potenzielle Probleme anzugehen und alternative Methoden zu diskutieren. Mit dieser genetisch kodierte FRET-Sensor, können Gallensäure Interaktion mit FXR-LBD quantifiziert und direkt in lebenden Zellen überwacht werden und bietet eine schnelle und einfache Methode zur Visualisierung Gallensäuretransport und Dynamik in Echtzeit. Säuger-Expressionsplasmiden CytoBAS und NucleoBAS kodieren, sind im Handel erhältlich. Daher kann diese Biosensor weiter auf die beitragenVerständnis der Gallensäure-Transporter oder Verbindungen, die FXR aktivieren und einen tieferen Einblick in Gallensäure Biologie und Signalisierung.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgen</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NukleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifizierte Eagles-Medien (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Hohe Glukose ohne L-Glutamin</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen/Streptomycin)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (10x)</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Zellkulturflasche</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td>Lamininbeschichtete</td></tr><tr><td>T-175 Zellkulturflasche</td><td>VWR international</td><td>392-0238</td><td>Lamininbeschichtete</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>VWR international</td><td>734-0229</td><td>Poly-L-Lysin und Laminin beschichtete</td></tr><tr><td>10-cm-Schale</td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Laminin beschichtet</td></tr><tr><td>Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (Geneticin) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Klonierungszylinder (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz Kulturmedium</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Ohne Phenolrot</td></tr><tr><td>Polystyrol Rundbodenröhrchen (5 ml) Facs Röhrchen</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>ohne Verschluss, unsteril</td></tr><tr><td>Falcon 2.063 Röhrchen (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Schnappverschluss, steril</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8 Well Deckglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Aktivkohlegefiltert FBS</td><td>Life Technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Sonstige Chemikalien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit-Überwachung von intrazellulären gallensäure dynamics mit hilfe eines genetisch kodierte fret-gallensäure-sensor

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Überwachung der Proteinfaltung, -interaktion und -lokalisierung in einzelnen Zellen geworden. Biosensoren, die auf dem Prinzip der FRET basieren, haben die Echtzeit-Visualisierung von subzellulären Signalereignissen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht. Hier beschreiben wir die Anwendung eines genetisch kodierten Gallensäuresensors (BAS), der aus zwei Fluorophoren besteht, die mit der Farnesoid-X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne (FXR-LBD) fusioniert sind, wodurch ein Gallensäuresensor entsteht, der von einer großen Anzahl von Gallensäurespezies und anderen (synthetischen) FXR-Liganden aktiviert werden kann. Dieser Sensor kann auf verschiedene zelluläre Kompartimente ausgerichtet werden, einschließlich des Zellkerns (NucleoBAS) und des Zytosols (CytoBAS), um die Gallensäurekonzentrationen lokal zu messen. Es ermöglicht eine schnelle und einfache Quantifizierung des zellulären Gallensäureeinstroms, des Ausflusses und der subzellulären Verteilung endogener Gallensäuren, ohne dass eine Markierung mit Fluoreszenzmarkierungen oder Radionukleen erforderlich ist. Darüber hinaus können die BAS FRET-Sensoren für die Überwachung der FXR-Ligandenbindung nützlich sein. Schließlich zeigen wir, dass dieser FRET-Biosensor mit der Bildgebung anderer spektral unterschiedlicher Fluorophore kombiniert werden kann. Dies ermöglicht eine kombinierte Analyse der intrazellulären Gallensäuredynamik und i) der Lokalisierung und/oder Häufigkeit von Proteinen von Interesse oder ii) der intrazellulären Signalübertragung in einer einzelnen Zelle.

Die FRET-BAS Sensor enthalten, wird für die Ligandenbindungsdomäne von FXR (LBD-FXR) zwei Fluorophore Citrine und himmel) und ein LXXLL-Motiv angebracht basiert. Dieser Sensor ermöglicht Untersuchungen Gallensäuretransport in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung (Abbildung 1 A). Mutationen in cerulean und Citrin wurden angewendet, um die Bildung der intramolekularen Komplexes (Abbildung</...

Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die Gallensäuredynamik in lebenden Zellen mit einem genetisch kodierten BAS-FRET-Sensor zu untersuchen. Dieser Gallensäuresensor stellt ein einzigartiges Werkzeug zur Untersuchung (Regulierung) des Gallensäuretransports und der FXR-Aktivierung in einer Vielzahl von Zelltypen dar.

Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit einem genetisch kodierten FRET-Gallensäuresensor den Gallensäuretransport und die Dynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung einfach zu visualisieren. Dieser Sensor kann wichtige metabolische Fragen beantworten, wie z. B. die Beziehung von Galle und Dynamik zu Glukose, Lipiden und Energiestoffwechsel. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Gallensäuretransport nun direkt zu einzelnen lebenden Zellen überwacht werden kann, ohne dass Gallensäuren markiert werden müssen.Diese Methode kann Einblicke in den Transport und die Dynamik von Zell- und Gallensäuren geben. Es kann auch verwendet werden, um Effekte oder Aktivierungen und einzelne lebende Zellen zu visualisieren oder um die Bildgebung der Proteinlokalisation und des Gallensäuretransports zu kombinieren. Der genetisch kodierte Gallensäuresensor, im Folgenden der Sensor genannt, besteht aus einem Spender-Cerulean-Fluorophor und einem ausgenommenen Citrin-Fluorophor.Die beiden Fluorophore sind durch die Ligandenbindungsdomäne des FXR-Kerngallensäurerezeptors verbunden, der mit einem FXR-Co-Faktor, dem Peptid, fusioniert ist. Zwei manipulierte Aminosäureveränderungen in den beiden Fluorophoren fördern intermolekulare Wechselwirkungen zwischen dem Coelinblau und dem Citrin. Es werden zwei verschiedene Konstrukte verwendet, die den Sensor tragen.In einem Konstrukt enthält der Sensor das c-terminale Kernlokalisierungssignal und reichert sich daher im Zellkern an. Im anderen Konstrukt fehlt dem Sensor jede Zielsequenz und er lokalisiert sich daher im Zytoplasma. Das folgende Videoprotokoll konzentriert sich darauf, wie der Sensor in lebenden Zellen abgebildet werden kann.Das Textprotokoll beschreibt, wie man Zellen entwickelt, die den Sensor exprimieren, und wie man sie anhand von Fakten weiter analysiert. Zur Vorbereitung der Bildgebung der Zellen werden die Zellen, die den Sensor exprimieren, in der gewünschten Dichte in einem sterilen Objektträger mit acht Vertiefungen in einer vollständigen Kulturmedium beschichtet. Wenn die Zellen auf 60 t0 bis 70 Prozent Konfluenz angewachsen sind, fahren Sie mit dem Experiment fort.Waschen Sie die Zellen, die auf dem Kammerobjektträger haften, einmal mit 200 Mikrolitern 1x PBS oder Leibovitz L-15 Kulturmedium. Anschließend wird die Lösung abgesaugt und durch 300 Mikroliter Leibovitz L-15 Kulturmedium ersetzt, so dass keine CO2-Kontrolle erforderlich ist. Wenn DMEM mit Phenolrot anstelle von Leibovitz L-15 verwendet wird, planen Sie ein, den PH-Wert während der Datenerfassung im Auge zu behalten, da der Sensor empfindlich auf PH reagiert. Bereiten Sie als Nächstes Verdünnungen der Verbindungen vor, die im Experiment mit 3- bis 5-fachen Konzentraten, einschließlich GW4064 und TCDCA, verwendet werden sollen.Bereiten Sie sich darauf vor, während der Bildgebung Aliquots von 50 bis 100 Mikrolitern hinzuzufügen, damit die Lösungen in der Objektträgerkammer schnell gemischt werden. Starten Sie nun die Bildgebungssoftware eines konfokalen Mikroskops und schalten Sie den Laser ein. Das Mikroskop muss mit einem 63-fach-Ölobjektiv, einer 37 Grad Celsius heißen Inkubationskammer und einem violetten 405-Nanometer-Laser ausgestattet sein.Passen Sie anschließend die Einstellungen des Mikroskops an. Stellen Sie den Aufnahmemodus auf XYT ein, um eine Zeitrafferaufnahme einer einzelnen Fokusebene zu ermöglichen. Stellen Sie die Bildaufnahmerate auf 20-Sekunden-Intervalle ein, damit während der Pausen Verbindungen hinzugefügt werden können.Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie den Spektralbereich für eine Missionserkennung einstellen. Fokussieren Sie sich mit Hilfe der Durchleuchtung auf die Zellen. Zeichnen Sie dann im Software-Steuerelement Kreise, um die interessierenden Bereiche zu definieren.Wählen Sie Zellen mit ähnlicher Blütenintensität und normaler Größe und Form aus. Zeichnen Sie nicht zu nahe an den Rändern der Zelle. Beginnen Sie dann mit den Messungen.Notieren Sie sich ihren Wert und fahren Sie mit Messungen fort, bis sich die Blütenpracht von Coelinblau und Citrin stabilisiert hat. Sobald die Fluoreszenzstabilität erreicht ist, fügen Sie zu ausgewählten Zeitpunkten während der Messung 50 bis 100 Mikroliter Gallensäuren oder andere Verbindungen hinzu. Vermeiden Sie beim Pipettieren den Rand der Kammer und fügen Sie die Flüssigkeit langsam hinzu.Die korrekte Ausführung dieses Schritts ist entscheidend für das Experiment. Lassen Sie die Blütenpracht wieder stabilisieren, bevor Sie fortfahren. Beenden Sie das Experiment, indem Sie vorsichtig 100 Mikroliter GW4064 für eine Konzentration von fünf bis 10 Mikromolaren hinzufügen.Fahren Sie mit der Aufnahme fort, bis sich die Blütenpracht wieder stabilisiert hat. Speichern Sie dann das Experiment und exportieren Sie die Daten als AVI-Datei. Öffnen Sie die gespeicherten AVI-Dateien in Bild J, indem Sie Plugins, Stacks, Stack Interleaver auswählen.Klicken Sie anschließend auf Bearbeiten, auswählen und zum Manager hinzufügen, um das RLI-Manager-Fenster zu öffnen. Schalten Sie dann die Option Alle anzeigen um. Zeichnen Sie mit dem ovalen Auswahlwerkzeug einige ROIs, die bestimmte Zellen abdecken.Nähern Sie sich nicht den Zellumrandungen, da die Zellen wahrscheinlich eine fokale Drift oder Migration erfahren. Zeichnen Sie außerdem einen Kreis in einen Bereich außerhalb der Zellen, um das Hintergrundsignal zu bestimmen. Es kann auch ein Bereich innerhalb einer Zelle verwendet werden, der den Sensor nicht exprimiert.Wählen Sie nun einen ROI aus und klicken Sie auf Plugins und dann auf Ratio Profiler. Es werden drei Bildschirme angezeigt. RAW-, Verhältnis- und Verhältnisprofil.Das RAW-Fenster zeigt die Zunahme der Intensität von Citrin als blaue Linie und eine Abnahme von Coelinblau als rote Linie, wenn FRET vorhanden ist. Das Verhältnisfenster zeigt Informationen über das Verhältnis von Citrin zu Coelin, das mit zunehmendem FRET zunimmt. Das Verhältnisprofilfenster zeigt die Werte für die Messungen der Fluoreszenzintensität in beiden Kanälen an.Wenn mikroskopspezifische Setup-Dateien verwendet werden, kann die Kanalreihenfolge umgekehrt erscheinen. Kopieren Sie nun die Daten aus dem Verhältnisprofilfenster in eine Tabelle für die statistische Analyse. Fahren Sie dann fort, dasselbe für alle anderen ausgewählten ROIs sowie den ROI im Hintergrund zu tun.Ein auf quantitativer Intensität basierendes FRET-Experiment für lebende Zellen wurde an U2OS-Zellen durchgeführt, die den Sensor exprimieren und denen endogene Gallensäuretransporter fehlen. Die Zellen wurden mit TCDCA behandelt. Daraus ergaben sich keine Veränderungen im FRET.Wenn die Zellen mit GW4064 behandelt wurden, stieg das durchschnittliche Verhältnis von Citrin zu Coelinblau bemerkenswert an. Um zu demonstrieren, dass der Sensor mit anderen Proteinen kombiniert werden kann, wurden U2OS-Zellen, die den Sensor mit NTCP und OST alpha-beta koexprimieren, entwickelt. Sie zeigten einen deutlichen Anstieg des Citrin/Coelin-Verhältnisses nach Zugabe zu TCDCA und GW4064.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Gallensäuredynamik mit dem Gallensäuresensor analysieren können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann leicht erweitert werden, um mehr bildgebende Informationen einzubeziehen, wie z. B. die subzelluläre Lokalisierung des gewünschten Proteins.Solange die Wellenlänge dieses Proteins von der des Sensors abweicht. Um Photobleaching zu verhindern, ist es wichtig, dass der Sensor, der die Zellen exprimiert, so weit wie möglich im Dunkeln bleibt.

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