Name: Auslassen von Multi-Exon-Verwendung Cocktail Antisense-Oligonucleotiden in der Canine X-chromosomal-Muskeldystrophie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Erfahren Sie mehr über Multi-Exon-Skipping mit Cocktail-Antisense-Oligonukleotiden im Hundemodell der Duchenne-Muskeldystrophie. Diese Methode zeigt systemische Dystrophin-Rettung ohne signifikante Toxizität.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Fakultät für Medizin und Zahnmedizin der University of Alberta, dem Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, dem HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, der Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), den Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse's Journey - The Foundation for Gene and Cell Therapy, und das Forschungsinstitut für Frauen- und Kindergesundheit (WCHRI).

Die Open-Access-Gebühren für diesen Artikel wurden von Gene Tools, LLC zur Verfügung gestellt.

Exon-Skipping ist eine vielversprechende therapeutische Technik zur Behandlung von DMD. Sowohl in vitro und in vivo Versuche haben gezeigt , dass die Multi-Exon - Skipping führbar ist. Hier wird die Verwendung des CXMD Hundemodell diskutiert. Zunächst wurden AONs entwickelt , um die Rettungs ESE und ESEfinder Programme mit Dystrophin - Exons 6 bis Ziel - 8. Die 2&#39;OMePS AON Chemie für CXMD Myoblasten Transfektion und Morpholin AON Rückgrat Chemie wurde für In - vivo - Experimente ausgewählt verwendet wurde. vPMOs sind effizienter als unmodifizierte PMOs aber aufgrund ihrer höheren Toxizität sind sie für die systemische Injektionen nicht geeignet. RNA-Extraktion, RT-PCR und cDNA-Sequenzierung wurden auf den CXMD Myoblasten durchgeführt. Hunde mit dem PMO Cocktail injiziert waren klinisch abgestufter keine Besserung der klinischen Symptome zu bewerten. Nachdem die Hunde artgerecht eingeschläfert wurden, wurden Muskelproben und für Kryo-Schnitte vorbereitet genommen. Die Halbwertszeit von Dystrophin-Protein, induziert durch AONs wird angenommen, dass etwa 1 zu sein - 2 Monaten. Junge erwachsene Hunde wurden in dieser Studie verwendet wurden, obwohl diese Versuche mit neugeborenen Hunden und älteren Hunden durchgeführt werden (&gt; 5 Jahre). Vorbereitete Muskelabschnitte wurden verwendet , Histopathologie zu bewerten und Dystrophin - Protein Rettung durch Western Blotting und Immunhistochemie 48 beurteilen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Volumen der Lösung vor der PMO-Injektionen korrekt ist; haben so erhebliche Auswirkungen auf die Ergebnisse zu tun, andernfalls wird. Während intramuskuläre Injektionen wird ein ausreichender Druck erforderlich, um die Muskelfasern zu gelangen. Die Überwachung der Hundegesundheit und Inspektion der Operationsstelle sind wichtig für die Fehlerbehebung. Um die Tiergesundheit, wöchentliche Bluttests überwachen und mit einem Gewicht durchgeführt werden sollte. Nach Euthanasie der Tiere und Herstellung von Muskelproben, Empfindlichkeit ein kritischer Schritt für die Gewährleistung Dystrophin-Protein bei der Erkennung sowohl des Tris-Acetat-Gel und halbtrockenen Blotting-Verfahren zu verwenden,während der Western-Blot-Verfahren. Wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt, behandelt Myoblasten mit Ex6A, Ex6B, Ex8A, und der Cocktail (mit Ex6A, Ex6B, Ex8A und Ex8B) im Rahmen DMD Produkte hergestellt. Da keine Ex8B Exon-übersprungenen Produkte produziert, wurde es nicht in den nachfolgenden in vivo Experimenten verwendet. cDNA-Sequenzierung ergab, dass die Exons 6 - 9-Skipping aufgetreten und Immunzytochemie mit DYS-2-Färbung zeigten Dystrophin-Expression in behandelten Proben wiederhergestellt. AON-behandelten Hunden zeigten eine signifikante Zunahme der Dystrophin-positive Fasern. Dies zeigt, dass die Exons 6 bis 8 wurden übersprungenen und ein verkürztes Protein wurde hergestellt. Die Menge an Dystrophin-positiven Fasern erhöht, wenn ein Cocktail von AONs verwendet wurde, und war zu AON Dosierung proportional. Immunoblots zeigten Dystrophin-Expression in systemischen morpholino-behandelten Hunden erhöht. Der Skelettmuskel hatte variable Mengen an Dystrophin-Fasern; jedoch morpholino-behandelten Herzgewebe zeigte wenigVerbesserung der Dystrophin-Expression. Da Dystrophin mit hohem Molekulargewicht (427 kDa) hat der Nachweis von geringen Mengen des Eiweißes kann schwierig sein. Für die besten Ergebnisse, Tris-Acetat-Gel und die halbtrockenen Transferverfahren verwendet wurden. HE-Färbung zeigte verbesserte Histopathologie in den Morpholino-behandelten Hunden. Zentral-nukleiert Fasern (CNF) sind ein Zeichen für ungesunde Muskel und Zyklen von Muskeldegeneration und Regeneration darstellen. Morpholino behandelten CXMD Hunde zeigten eine Abnahme des Anteils der CNFs im Vergleich zu nicht behandelten CXMD Hunden. Klinische Einstufung ergab eine Verbesserung der Symptome, wie erhöhte Geh- und Lauffähigkeit, in morpholino-behandelten Tiere. Die Härte der Muskeln wird angenommen , dass Muskelatrophie zu reflektieren, damit es in der Benotungsskala 59 aufgenommen wurde. Die Härte des Oberschenkels (Hinterschenkel) Muskeln bewertet wurde; jedoch ausgeschlossen wir Schädel Schneidermuskel Muskeln, weil sie Hypertrophie zeigen neigen eher als Atrophie in CXMD. Die behandelten Hunde zeigened niedrigere Einstufung Partituren und hatte eine bessere Zeit auf der 15 m Lauftest. Verbesserte Mal auf der 15 - m - Prüfung sind ein Anzeichen für eine verbesserte Muskelfunktion 40. Höhere Gesamt Einstufung Werte zeigen schlechte Gesundheit und eine erhöhte Muskelatrophie. Während diese Ergebnisse vielversprechend sind, präsentiert Multi-Exon-Skipping noch viele Herausforderungen, die überwunden werden müssen, bevor die Technik klinische Anwendbarkeit hat. Herzgewebe zeigt noch verminderte Aufnahme von AONs, wahrscheinlich aufgrund der Differenz in der zellulären Handel zwischen Herz- und Skelettgewebe. Keine toxischen Wirkungen wurden bei Tieren unter den gegenwärtigen Dosierungsschemata beobachtet; jedoch muss mehr getan werden, die Langzeittoxizität zu bewerten, bevor die Verwendung von AON-Cocktails zu klinischen Studien bewegen kann. Es ist schwierig, die Genehmigung für AON Cocktail Drogen zu gewinnen, weil jede Regulierungsagentur AON-Sequenz als ein einzigartiges Medikament definieren. Dies bedeutet, dass jede Sequenz in einem Cocktail individuell müssten für Safet getestet werdeny, mehr Zeit und mehr Geld erfordern. Ein weiteres Hindernis für den Einsatz von Multi-Exon-Skippings in einer klinischen Umgebung ist eine große Menge an Zwischenproteinprodukte mit unbekannten Funktionen erzeugt. Diese Proteine ​​können potenziell führen zu unvorhersehbaren Nebenwirkungen in Abhängigkeit von der einzelnen Mutation 22. Darüber hinaus sind die Mutation Muster innerhalb von aktuellen dystrophischen Hund Modelle begrenzt. Es gibt nur wenige natürlich vorkommende Mutationen, und nicht alle Mutationen sind nützlich zur Untersuchung von Multi-Exon-Skipping. Die dystrophischen Schweinemodell verspricht eine gute Alternative für die zukünftige DMD Exon - Skipping - Studien 33, 34 zu sein. Die DMD Hund Modelle haben einige Vorteile gegenüber anderen DMD-Modelle. Als ein größeres Tiermodell, klinische Sortier- und MRT sind möglich, für eine detailliertere Analyse zu ermöglichen. Da Hunde große Tiere sind, sind sie auch geeignet für Toxikologiestudien und enger die menschliche Krankheit im Vergleich zu dem Maus-Modell darstellen. Hund modelle haben auch Sequenzen DMD - Gen , das ähnlicher zu 23 Menschen sind, 34, 45. Obwohl technisch anspruchsvoll , das Multi-Exon - Skipping Ansatz letztlich profitieren könnten&gt; 90% der DMD - Patienten 24. Dies macht es eine viel bessere Alternative zu Single-Exon-Skipping, als Single-Exon-Skipping nur für einen kleinen Teil der Patienten ist. Darüber hinaus wird Multi-Exon-Skipping ermöglichen es uns, die Löschmuster auszuwählen, die die Funktionalität der verkürzten Dystrophin-Proteine ​​zu optimieren. Zum Beispiel das Löschen von DMD Exons 45 - 55 mit außergewöhnlich milde Symptome oder asymptomatischen Personen 14,19,60-63 verbunden ist. Die Multi-Exon - Skipping des Exons 45 bis 55 bereits in einem Mausmodell der DMD mit einem Exon 52 Deletion (mdx52) unter Verwendung systemische Injektionen von vPMOs 22,26 nachgewiesen. Die Verwendung von Cocktails vPMOs wurde auch in anderen Formen von Muskeldystrophie gezeigt worden, wie beispielswie Fukuyama kongenitale Muskeldystrophie (FCMD). FCMD durch Exon-Trapping verursacht, in denen aberrante mRNA Splicing durch Retrotransposon Insertion verursacht wird. vPMOs wurden 64 das Splicing - Muster in sowohl einem FCMD Mausmodell und in menschlichen Zelllinien zu retten gezeigt. Next-Generation AON Chemien höhere Wirksamkeit und eine geringere Toxizität aufweisen würde die effektive Umsetzung des Multi-Exon-Skipping-Ansatz in die klinische Anwendung zu erleichtern. Zusätzlich könnte Multi-Exon - Skipping potentiell auf andere genetische Erkrankungen angewendet werden, wie beispielsweise die dysferlinopathies 24, 65.

Duchenne - Muskeldystrophie (DMD) ist eine X-chromosomal - rezessiv Muskelerkrankung , die durch progressive Muskelschwäche gekennzeichnet, beschrieben zuerst von Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD ist eine gemeinsame etwa 1 in 3500 Jungen beeinflussen genetische Erkrankung weltweit, mit rund 20.000 betroffenen Kinder pro Jahr geboren 2,3. Die motorische Entwicklung verzögert und Gangstörungen sind in der frühen Kindheit 4, gefolgt von Rollstuhlabhängigkeit bei etwa den frühen Teenager gesehen. Der Tod tritt in der Regel im Alter zwischen 20 und 30 aufgrund von Atemwegs- oder Herzversagen 5-8. Es gibt derzeit keine Heilung für DMD. Behandlung mit Glucocorticoiden kann das Fortschreiten der Muskeldegeneration zu einem gewissen Grad verlangsamen aber mit erheblichen Nebenwirkungen, wie Adipositas und Diabetes mellitus 2,7,8 assoziiert ist. DMD resultiert aus Mutationen im Dystrophin (DMD) -Gen, mit einem Verlust von funktionellen Dystrophin protei führendenn. DMD ist ein extrem großes Gen mit über 2 Millionen Basenpaaren und 79 Exons 9,10. Löschen, Blödsinn und Vervielfältigung Mutationen führen zu Out-of-frame-Mutationen sind die häufigste Ursache für die DMD-Phänotyp. Die Regionen der Exons 3 bis 9 und Exons 45-55 sind &quot;Mutation Hotspots&quot; bezeichnet , da die meisten Patienten Deletionsmutationen innerhalb dieser Abschnitte des Gens, was zu einer nichtfunktionellen Dystrophin in DMD - Patienten 3,9,11-16. Dystrophin Funktionen innerhalb des Dystrophin-Glykoprotein-Komplex (DGC), die eine wichtige Rolle bei der Muskelmembranstabilisierung aufweist. Die N- und C-Termini sind die wichtigsten Bereiche für die Funktion, während der zentrale Stab Domäne eine weniger wichtige Rolle spielt 3,9,17. Die Einhaltung eines milden Phänotyp im Zusammenhang mit Becker - Muskeldystrophie (BMD), die vor allem ergibt sich aus in-frame - Mutationen innerhalb des DMD - Gens, inspiriert die Anwendung von Exon zur Behandlung von DMD - Skipping. BMD-Patienten haben eine verkürzte, aber functional, Dystrophin - Protein , die beide Enden 3,6,18 hält. Exon - Skipping, in der Theorie kann das Leseraster wiederherstellen, was zu einer verkürzten , aber funktionelle Dystrophin - Proteine ​​ähnlich denen in BMD 3,19 gesehen. Mehrere Arten von Antisense-Oligonukleotide (AON) wurden in klinischen Studien, einschließlich 2&#39;O- methyliert Phosphorothioate (2&#39;OMePS) und Phosphordiamidat Morpholino-Oligomere (PMOs) getestet. Auslassen von Exons 51 und 53 diese AONs verwendet wurde geprüft und während Ergebnisse vielversprechend sind, hat Single-Exon - Skipping Anwendbarkeit begrenzt, da es mutationsspezifischen 3, 19, 20,21, 22-26. Fragen bleiben auch über die Stabilität der resultierenden verkürzten Dystrophin - Proteine ​​produziert von Single-Exon 22,23 überspringen. Zusätzlich erfordern einige Patienten mehr als ein einziges Exon , um den Leserahmen 3 zur Wiederherstellung übersprungen werden. Während technisch schwieriger, ist Multi-Exon-Skipping eine Methode, dieAdresse konnte diese Probleme 3,19. Multi-Exon - Skipping hat in dystrophen Hunde- und menschlichen Zelllinien in vitro gezeigt , vorher. Zusätzlich studiert mdx52 Maus und Hunde - X-chromosomal - Muskeldystrophie (CXMD) Hundemodelle für in vivo verwendet wurden , 22, 24-27. Canine X-chromosomal - Muskeldystrophie Japan (CXMD J) Beagles hier verwendet wurden, da der Leserahmen von CXMD J kann durch Multi-Exon - Skipping des Exons 6 und 8, oder zusätzliche Exons (zB Exons 3 bis 9) wiederhergestellt werden (Abbildung 1). Beagle-basierte CXMD teilt die gleiche Mutation Muster wie die Golden Retriever - Muskeldystrophie (GRMD) Modell, aber Beagles sind kleiner und billiger zu halten aufgrund ihrer Körpergröße, wodurch ein nützliches Modell für DMD 28,29 bereitstellt. CXMD Hunde imitieren stärker den menschlichen DMD - Phänotyp als kleinere Tiermodellen, wie Nagetieren und sind zuverlässiger für die toxikologische Bewertung 3,22,30,31 </snach oben&gt; (Abbildung 2). CXMD Hunde zeigen progressive Muskel Verfall, Gangstörungen und Herz-und Atemprobleme ähnlich wie bei DMD gesehen. Verglichen mit Einzel-Exon-Skipping, ist Multi-Exon-Skipping zu einem viel größeren Anteil der Patienten anwendbar. Unter den drei häufigsten Mutationstypen (Deletionen, Unsinn, und Doppelungen), 80 bis 98% der Patienten , Multi-Exon - Skipping werden könnte 14,32,33 behandelt durch, während 45% aller DMD - Patienten von speziell Skipping Exons profitieren könnten 45 - 55 3,19,22,34. Mit der Entwicklung von modifizierten Morpholinos, die Effizienz der AON-Cocktails auf Exon-Skipping zu erleichtern hat sich verbessert. Arginin-reichen zellpenetrierendes Peptid-konjugierte PMOs (PPMOs) und vivo-Morpholinos (vPMOs) sind AON Chemien , die deutlich zellpenetrierendes Fähigkeit und Stabilität 3,35-38 verbessert haben. Sorge bereitet weiter langfristige AON Toxizität; jedoch erhebliche Fortschritteist gemacht worden. Chemische Modifikationen an Morpholinos stark Nebeneffekte zu verringern und präklinischen Studien haben keine signifikanten toxischen Wirkungen 3,22,39,40 berichtet. Eine verbleibende Herausforderung für Multi-Exon - Skipping ist der Strombedarf für jeden einzelnen AON für Toxizitäts allein getestet werden, als ein einziges Medikament, statt zusammen als ein Cocktail 3,19,22,41,42. In DMD Studien sowohl Einzel- als auch Multi-Exon-Beteiligung an das Herz gezielt Skipping, hat es wenig Verbesserung in der dystrophischen Herzgewebe gewesen. Die Wirksamkeit von Morpholinos im Herzen wird vermutet, gering zu sein wegen der schlechten zellpenetrierendes Fähigkeit. Peptid-konjugiertes PPMOs haben die Fähigkeit von AONs verbesserte Herzzellen eindringen, um die Menge an funktionellen Dystrophin - Protein im Herzen 3,19,38 gerettet erhöht. Hier unsere AON Cocktail Ansatz wird ausführlich diskutiert, einschließlich der Gestaltung von AON - Sequenzen mit ESEfinder Software 43. Protocols für Hunde Experimente mit Skipping Multi-Exon werden ebenfalls beschrieben. CXMD J Beagles wurden für die Exons 6 und 8 Überspringen Experimente verwendet. Multi-Exon in dem CXMD Hundemodell Überspringen zeigt vielversprechende Ergebnisse, aber Herausforderungen bleiben, dass müssen überwunden werden, bevor sie klinisch anwendbar sind.

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS Transfektion von Hundemyoblasten&nbsp; </stark</td></tr><tr><td>>3 ml 6-Well-Platten</td><td>IWAKI</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectin&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18292-011</td><td>Gesamtvolumen von 100 ml in opti-MEM Medien im Verhältnis 2:1 für Lipofectin. 10 ml Lipofectin für 5 mg RNA.</td></tr><tr><td>2' OMePS</td><td>Eurogentec&nbsp;</td><td></td><td>Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU) und Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&nbsp;</td></tr><tr><td>Pferde-Serum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>2%</td></tr><tr><td>Streptomycin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Morpholino-Transfektion von Hundemyoblasten 
Sämtliches Material aus der MePS-Transfektion von Hundemyoblasten zur Kultivierung von</td></tr><tr><td>Antisense-Morpholinos&nbsp;</td><td>Genwerkzeuge</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; In opti-MEM Medien auf ein Endvolumen von 100 l verdünnen. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg Morpholinos à 32 mg/ml in Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Genwerkzeuge</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/plate</td></tr><tr><td colspan="4">RNA-Extraktion und Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)</td></tr><tr><td>guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp; ml/Platte</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 &#956; l&nbsp;</td></tr><tr><td>1,5 ml Tuben&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman-Schar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% Ethanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>UV-Spektrometer&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer im Exon 5&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; L 10 &#956; M</td></tr><tr><td>Reverse Primer im Exon 10&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTCTGTCAATG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; L 10 &#956; M</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Einstufiges RT-PCR-Kit&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">komplementäre DNA (cDNA)-Sequenzierung&nbsp; </td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terminator v3.1 Zyklus-Sequenzierungs-Kit&nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme&nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Intramuskuläre Injektionen oder offene Muskelbiopsie</td></tr><tr><td>Chirurgische Werkzeuge</td><td></td><td></td><td>Schere, Skalpell, Nadel, chirurgischer Faden&nbsp;</td></tr><tr><td>Tierarzt Salbe&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodophoren&nbsp;</td><td>Webtextilien</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidin</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>OP-Abdecktücher&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scrubs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gesichtsmaske&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP-Handschuhe&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kopfbedeckung&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiopental-Natrium&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott Laboratorien&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Antisense-Morpholinos&nbsp;</td><td>Genwerkzeuge</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; In opti-MEM Medien auf ein Endvolumen von 100 l verdünnen. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; 200 mg/kg Morpholinos bei 32 mg/ml in Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>27&nbsp; G Nadeln</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>Nr. SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Spritze</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin Hydrochlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zungenspatel &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cephalexin</td><td></td><td>15 bis 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td></td><td>15 bis 30 mg/kg&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin&nbsp;</td><td></td><td>0,01 mg/kg</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphinhydrochlorid</td><td>0,02 mg/kg</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Systemische Injektionen</td></tr><tr><td>Spritzen-Infusionspumpe&nbsp;</td><td>Muromachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&nbsp; G Verweilnadeln</td><td>TERUMO</td><td>SG3-2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27&nbsp; G Nadeln&nbsp;</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>Nr. SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Spritze</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Ohtsuka-Pharmazie</td><td>28372<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Klinische Einstufung von Hunden</td></tr><tr><td>Videokamera&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stoppuhr&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Magnetresonanztomographie (MRT)&nbsp; </stark</td></tr><tr><td>>3 Tesla MRT l&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 cm Durchmesser/18 cm Länge Spirale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> der menschlichen Extremität<td colspan="4">Muskelprobenahme und -aufbereitung (Autopsie)</td></tr><tr><td>Thiopental-Natrium&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott Laboratorien&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>2-3%</td></tr><tr><td>Tragantfleisch</td><td></td><td></td><td>10-20 ml</td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Korkscheiben</td><td>Iwai-kagaku&nbsp;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>Trockeneispinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin&ndash; beschichtete Objektträger</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat Mikrosystem&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>cm1900&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>Immunhistochemie</stark>&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>1:150 Verdünnungen&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS2&nbsp;</td><td>Verdünnungen 1:150</td></tr><tr><td>Alexa 594 Antimaus für Ziegen IgG1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:2.500 Verdünnungen</td></tr><tr><td>Alexa 594 Antimaus für Ziegen IgG2&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>1:2.500 Verdünnungen</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Enthält das Eindeckmittel</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td>15%</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feuchtigkeitskammer</td><td>Wissenschaftliches Entwicklungslabor&nbsp;</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>Kammer-Schlitten&nbsp;</td><td>Lab-tek&nbsp;</td><td></td><td></td>154453</tr><tr><td>Deckgläser&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophober Barrierestift</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td></td><td></td><td>594 nm bei 20-facher Vergrößerung.</td></tr><tr><td colspan="4">Western Blotting&nbsp; </stark></td></tr><tr><td>Distillwasser&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hand-Homogenisator&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2& mal; Laemmli SDS-Ladepuffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0,1 M Tris&ndash; HCl (pH 6,6), 2% (w/v) SDS, 2% (0,28&nbsp; M) Beta-Mercaptoethanol, 20 % Glycerin, 0,01 % Bromphenolblau&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS-Gele&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-1210</td><td>5% auflösende</td></tr><tr><td>SDS-Gele</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Invitrogen, WG1601BOX</td><td>3-8%</td></tr> <tr><td>PVDF-Membran &nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laufpuffer (10-fach;)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris-Base, 1.920 mM Glycin</td></tr><tr><td>Laufpuffer (1&fach;)</td><td></td><td></td><td>10% 10-facher Puffer, 20% Methanol&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 % PBS/Tween 20 (PBST) &nbsp;</td><td></td><td></td><td>2.000 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3&fach; 200 ml zum Waschen von</td></tr><tr><td>PBST/5% Milchpulver&nbsp;</td><td></td><td></td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protein Assay Kit</td><td>BCA</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetat</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Lade-/Probenpuffer für Western Blotting</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Cocktail-Hemmer</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Kathodenpuffer</td><td></td><td></td><td>0,025 M Tris-Basis + 40&nbsp; mM 6-Aminocapronsäure + 20 % Methanol</td></tr><tr><td>Anodenpuffer</td><td></td><td></td><td>0,03 M Trisbase + 20 % Methanol</td></tr><tr><td>konzentrierter Anodenpuffer</td><td></td><td></td><td>0,3 M Tris Base + 20 % Methanol</td></tr><tr><td>Desmin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>1:150 Verdünnungen&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ Software (Englisch)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

auslassen von multi-exon-verwendung cocktail antisense-oligonucleotiden in der canine x-chromosomal-muskeldystrophie

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Duchenne - Muskeldystrophie (DMD) ist eine der häufigsten tödlichen genetischen Krankheiten weltweit, verursacht durch Mutationen im Dystrophin (DMD) Gen. Exon-Skipping beschäftigt kurze DNA / RNA-ähnliche Moleküle, so genannte Antisense-Oligonukleotide (AON), die den Leserahmen wiederherzustellen und produzieren kürzer, aber funktionelle Proteine. Allerdings Exon-Skipping-Therapie steht vor zwei großen Hürden: begrenzte Anwendbarkeit (bis zu nur 13% der Patienten können mit einem einzigen AON Medikament behandelt werden), und unsichere Funktion der verkürzte Proteine. Diese Fragen wurden mit einem Cocktail AON Ansatz adressiert. Während etwa 70% der DMD-Patienten durch einzelne Exon-Skipping (alle Exons kombiniert) behandelt werden können, könnte man möglicherweise mehr als 90% der DMD-Patienten zu behandeln, wenn multiple Exons unter Verwendung von Antisense-Medikamenten Cocktail Überspringen realisiert werden kann. Der Eckzahn X-chromosomal-Muskeldystrophie (CXMD) Hundemodell, dessen Phänotyp ist ähnlich dem menschlichen DMD-Patienten wurde verwendet, um die systemische effic zu testenACY und Sicherheit des Überspringens Multi-Exon der Exons 6 und beherbergt 8. CXMD Hundemodell zu einem Mangel an Exon 7 in Dystrophin - mRNA eine Spleißstelle Mutation in Intron 6, führt. Zur Wiederherstellung erfordert das Leseraster in CXMD Multi-Exon-Skipping der Exons 6 und 8; Daher ist CXMD ein gutes mittelgroße Tiermodell die Wirksamkeit und Sicherheit von Skipping Multi-Exon zum Testen. In der aktuellen Studie, ein Cocktail von Antisense-Morpholinos Targeting Exon 6 und Exon 8 wurde entwickelt, und es restauriert Dystrophin-Expression in Körper-weiten Skelettmuskulatur. Verfahren zur Transfektion / Injektion von Cocktail-Oligos und Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Multi-Exon-Skipping im CXMD Hundemodell vorgestellt.

In - vitro - Experimente Myoblasten wurden mit verschiedenen 2&#39;OMePS Behandlungsbedingungen, um transfizierte die Wirksamkeit der einzelnen AON zu vergleichen. Einzel AON Behandlungen mit 600 nM jeweils Ex6A, Ex6B, Ex8A oder Ex8B wurden durchgeführt, sowie eine Cocktail-Behandlung mit 600 nM jedes aller 4 AON-Sequenzen. RNA-Proben wurden vier Tage nach der Transfektion gesammelt. Nach der RT-PCR wurden Proben für jede Behandlung wurden zusammen mit nicht-behandelten (NT) Proben auf einem Gel laufen gelassen. Bands höher auf dem Gel darstellen out-of-frame DMD Produkte; Diese Banden wurden in NT, Ex8A und Ex8B behandelt Myoblasten gesehen. Ex6A, Ex6B, Ex8A und die Cocktail-behandelten Myoblasten zeigten in-Frame-Produkte. Der Cocktail und Ex6A / B zeigte eine 100% in-frame Produkte, während Ex8A nur 30% in-frame - Produkte (7) gezeigt. Um zu bestätigen, Exon-Skipping und Wiederherstellung vonder Leserahmen wurde cDNA-Sequenzierung durchgeführt; Die Ergebnisse zeigten , dass die Exons 6 bis 9 waren in der Tat (Figur 7) übersprungen worden. Immunhistochemie zeigte , dass AON-behandelten Hunden Dystrophin-positive Fasern im Vergleich zu NT - Proben (8) angestiegen war. In - vivo - Experimente Um die Effizienz der verschiedenen AON Behandlungsbedingungen CXMD dogs vergleichen (0,5 - 5 Jahre alt) wurden in verschiedenen Dosierungen einmal mit 1,2 mg Ex6A oder einem Cocktail aus Ex6A, Ex6B und Ex8A injiziert. Zwei Wochen nach der Injektion, Muskelproben wurden gesammelt und gefärbt mit DYS-1 die Anzahl der Dystrophin-positive Fasern zu vergleichen. Alle Cocktail-behandelten Proben zeigten eine erhöhte Dystrophin-Expression im Vergleich zu NT-Proben. Dystrophin-positiven Fasern erhöht mit AON Dosierung (Abbildung 9). Nach Systemic - Injektion, Wildtyp (WT), NT und Cocktail-behandelten CXMD Muskelproben wurden mit DYS-1 (Abbildung 10) gefärbt. Cocktail-behandelten CXMD Hunde zeigten erhöhte Expression Dystrophin im Vergleich zu NT CXMD Hunde, die beide in der CT und der Herzmuskelproben. Allerdings AON-behandelten Skelettmuskel (CT) zeigte viel höhere Expression von Dystrophin im Vergleich zu behandelten Herzmuskel. Ein Immunoblot führte WT, NT und verschiedene Morpholino Cocktail-behandelten Muskeln zu dem gleichen Ergebnis zu vergleichen. Es gab auch eine große Auswahl an Dystrophin - Expression in den behandelten Skelettmuskelproben (Abbildung 10). Hematoxylin und Eosin (HE) Färbung ergab, dass CXMD behandelt Hunde zeigten verbesserte Histopathologie, mit einer signifikanten Abnahme der zentral nukleierten Fasern (CNF) im Vergleich zu NT CXMD Hunden (Abbildung 11). Dies zeigt an, dass mehr Degeneration / Regeneration ist in dem Hund NT auftritt, ein Zeichen der dystrophischen Muskel Pathologie. Zusätzlich hatte behandelten Hunde schnellerZeiten und eine verbesserte Werte auf der klinischen Bewertungsskala läuft. Behandelte CXMD Hunde zeigten bessere Ergebnisse als NT CXMD Hunde in allen Kategorien (Abbildung 12). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mutationsmuster des CXMD Hund und Exons . 6 - 8 Skipping Strategien Verwendung eines Antisense - Cocktail CXMD Hunde haben eine Punktmutation in Exon 6 führt zu einem Verlust von Exon 7 in dystrophischen Hund mRNA. Dies führt zu der mRNA ist out-of-Frame und Dystrophin-Protein-Produktion verloren. Kurze AON-Sequenzen sind so konzipiert, zu binden, 6 zu Exon und 8, die in mRNA-Spleißen führt effektiv Exons Überspringen 6 - 8. Der graue Balken in den AON-Cocktail-behandelten Hunden kurze AON-Sequenzen darstellt. Exon 9 kodiert für ein Gelenk-Domäne und manchmal spontan mit AONs gegen Exon 6 und 8. Die resultierenden mRNA für Proteine ​​codiert Dystrophin, die kürzer aber Funktion gespleißt outal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die wichtigsten klinischen Symptome einer 1-jährigen Canine X-chromosomal - Muskeldystrophie (CXMD) Tier. Ein 1-jährige Wildtyp - Beagle und ein CXMD Hund gezeigt. Die Beteiligung der proximalen, des Körpers und zeitliche Muskeln sind in der Regel aus Alter von 2 Monaten beobachtet. Gemeinsame Kontraktur und eine Verschiebung des Beckens sind offenkundige 4 Monate alt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> Abbildung 3. Allgemeine Anästhesie für einen Hund. A) Intramuscular Injektionen und Muskelbiopsien werden unter Vollnarkose mit Isofluran durchgeführt. B) Halten des Tieres für systemische Injektionen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Abbildung 4. Magnetic Resonance Imaging (MRI) von Wild-Typ, nicht behandelt CXMD und behandelte CXMD. MRT - Scans des Hinterbein nach 3 Monaten und 5 Monate in WT und NT CXMD Hunde. Zwei Musterbilder von behandeltem CXMD Hinterbein MRIs prä- (1 Woche vor der ersten Injektion) und nach der Injektion von AON gezeigt. 2703MA wurde 7x wöchentlich mit 200 mg / kg Cocktail Morpholinos behandelt. 2001MA wurde mit 5x wöchentlich intravenöse Injektion von 120 mg / kg Cocktail Morpholinos behandelt. Kontrolle und behandelten Hunden waren altersgleichen. Die behandelten Hunde zeigen T2 Signale verringert. Die Bilder sind ADAP<html> ted mit freundlicher Genehmigung von Yokota et al. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Abbildung 5. Muskelbiopsie Verfahren für einen Hund. A) Eine untere Extremität wird für Muskelbiopsie fixiert. B) Mit Hilfe der Zange wird die untere Extremität gehalten. C) Die CT Muskel ausgesetzt ist. Die offene Biopsie-Technik wird verwendet, um Muskelproben von injiziertem Websites erhalten. Themen werden verwendet, Biopsieproben zu halten. D) Muskelproben auf Tragant nach der Sektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6. Halbtrocken - Übertragungsmethode. Eine Darstellung der halbtrockenen Transferverfahren für Western - Blot dargestellt. Drei Papiere getränkt in konzentrierter Anodenpuffer sind an dem negativen Anschluß festgelegt sind; 3 Papiere in Anodenpuffer getränkt sind oben auf dieser gestapelt. Die Mb PVDF Papier wird in Methanol und dann Anodenpuffer getränkt, bevor sie auf der Oberseite der 6 Papiere gelegt werden. Das Gel, das in Kathodenpuffer getränkt worden ist, wird sanft über die PVDF Papier gelegt. Schließlich 3 in Kathodenpuffer getränkte Papiere sind auf der Oberseite des Gels gelegt. Der positive Anschluss ist auf der Oberseite eingestellt. 1 h, 400 mA durch das System ausgeführt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Abbildung 7. Exon - Skipping in CXMD Myoblasten. </strong&gt; CXMD Myoblasten wurden mit Ex6A transfiziert, Ex6B, Ex8A oder Ex8B allein oder einem Cocktail aus allen vier. Insgesamt 600 nM wurde für die einzelnen Sequenzen und für den Cocktail 600 nM jeder Sequenz verwendet wurde, verwendet. A) 2&#39;OMePS Behandlung in CXMD Hund Myoblasten. Ex6A, Ex6B und die Cocktail-behandelten Proben zeigen eine starke Banden bei der erwarteten Position von in-Frame-Exon-übersprungenen Transkripte. Ex8A zeigt ein Zwischenband, Ex8B eine schwache Bande zeigt, und NT nicht zeigt eine Bande bei der in-Frame-Position. B) cDNA-Sequenzierung von Ex6A allein, 4 Tage nach der Transfektion. Bilder angepasst sind , mit freundlicher Genehmigung von Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Abbildung 8. Erhöhte DystropHin Expression in 2&#39;O- methyliert Phosphorothioat (2&#39;OMePS) Transfizierte CXMD Myoblasten. CXMD Myoblasten wurden allein mit Ex6A transfiziert oder mit Cocktail 2&#39;OMePS. DYS-2 (rot) und DAPI (blau) Färbung gezeigt. Die behandelten Myoblasten sind im Vergleich zum Wildtyp (WT) und nicht behandelten (NT) Myoblasten. Die Bilder werden mit freundlicher Genehmigung von Yokota et al angepasst. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="9" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> Abbildung 9. Rettung von Dystrophin Expression mit intramuskuläre Injektionen von Morpholinos in CXMD Hunde. Entweder Ex6A allein oder einem Cocktail aus Ex6A, Ex6B und Ex8A wurden in die CT Muskeln von CXMD Hunden injiziert. Dystrophin (DSY-1) Färbung von Wildtyp(WT), nicht behandelte (NT), und behandelt CXMD Hunde gezeigt. Die Hunde wurden entweder mit 1,2 mg Ex6A allein oder 1,2 mg Cocktail behandelt. Die Bilder werden mit freundlicher Genehmigung von Yokota et al angepasst. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="10" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> Abbildung 10. Erhöhte Dystrophin - Expression nach Systemische Cocktail Morpholino Behandlung in CXMD Hunde. Dystrophin (DYS-1) Färbung wurde verwendet , um Dystrophin - Expression in Wildtyp (WT) (positive Kontrolle), nicht behandelte (NT) (Negativkontrolle) zu vergleichen, und CXMD Hunde mit 120 mg / kg morpholino-Cocktail (40 mg / kg jeder AON) behandelt. Der Morpholino Cocktail enthielt Ex6A, Ex6B und Ex8A. Die Hunde wurden intravenös 5 mal injiziert wirekly mit diesem Cocktail. A) Ein Vergleich der Dystrophin-Expression in Schädel Tibia (CT) Muskeln von WT, NT und behandelten Hunden. B) Ein Vergleich der Dystrophin-Expression im Herzgewebe zwischen NT und Morpholin Cocktail-behandelten Hunden. C) Immunoblot für Dystrophin mit Desmin als Ladekontrolle für WT, NT und morpholino Cocktail-behandelten Hunden gezeigt. Folgende Muskeln sind für die behandelten Hunden gezeigt: Trizeps (TB), Bizeps (BB), Membran (DIA), der Speiseröhre (ESO), CT, Adduktoren (ADD), extensor digitorum longus (EDL), Kaumuskeln (MAS), und Herz. Die Bilder werden mit freundlicher Genehmigung von Yokota et al angepasst. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="11" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> Zahl11. Verbesserte Histopathologie in CXMD Hunde behandelt 7 Wochen mit 240 mg / kg Morpholino Cocktail. CXMD Hunde von einem halben Jahr bis zu fünf Jahren im Bereich intravenös mit 240 mg / kg Morpholin - Cocktail (Ex6A, Ex6B und Ex8A) einmal injiziert Woche 7 Wochen. Vierzehn Tage nach der letzten Injektion wurden Speiseröhre Muskeln aufgenommen und Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung wurde durchgeführt. HE - Färbung der Speiseröhre Muskeln von nicht behandelten (NT) und Morpholin Cocktail-behandelt (behandelt) CXMD Hunde (40X Objektiv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="12" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Abbildung 12. Verbesserte basiert auf klinischen Grading und 15 m Laufzeit nach Morpholino Behandlung. Morpholino-behandelten Hunden wurden im Vergleich zu nicht behandelten (NT) littermates. Die Fehlerbalken in der Grafik zeigen SEM. A) Gesamtpunktezahl auf der klinischen Einstufung Prüfung wurde berechnet, vor und nach der Behandlung und behandelten Tiere wurden im Vergleich zu NT littermates. B) Ein Vergleich von 15 m Laufzeiten der behandelten und NT Hunde. C) Wie B; jedoch wurden jüngere Hunde eingesetzt. Bilder angepasst sind , mit freundlicher Genehmigung von Yokota et al. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antisense - Oligonukleotids </td><td> Nucleotid - Sequenz </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Antisense - Oligonukleotid - Design.

Exon-Skipping ist derzeit vielversprechendsten Therapieoption für Duchenne-Muskeldystrophie (DMD). Um die Anwendbarkeit für DMD-Patienten zu erweitern und die Stabilität / Funktion der resultierenden verkürzten Dystrophin-Proteine, ein Multi-Exon-Skipping-Ansatz Cocktail Antisense-Oligonukleotide wurde zur Optimierung entwickelt und wir zeigten systemische Dystrophin-Rettung in einem Hundemodell.

Auslassen von Multi-Exon-Verwendung Cocktail Antisense-Oligonucleotiden in der Canine X-chromosomal-Muskeldystrophie

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Wirksamkeit und Toxizität eines multiplen Exon-Skippings mithilfe von Cocktail-Antisense-Oligonukleotiden oder AONs in einem Hunde-Modell der Duchenne-Muskeldystrophie oder DMD zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der translationellen Forschung der Antisense-Exon-Skipping-Therapie zu beantworten, beispielsweise, ob Antisense-Oligonukleotide ein multiples Exon-Skipping induzieren und die Dystrophin-Expression in einem großen Tiermodell wiederherstellen können. Der Hauptvorteil der Verwendung des Hunde-Modells in einer Studie liegt darin, dass therapeutische Ergebnisse bei größeren Tieren zuverlässiger auf DMD-Patienten übertragen werden können.Obwohl die Exon-Überspringung eine vielversprechende Therapie für die DMD darstellt, kann sie auch bei anderen genetischen Erkrankungen angewendet werden, wie beispielsweise der angeborenen Muskeldystrophie und der limb-girdle-Muskeldystrophie. Die Demonstration der In-vitro-Experimente wird von Dr. Yoshitsugu Aoki, unserem Laborleiter, durchgeführt, und die Demonstration der In-vivo-Experimente wird von Dr. Mutsuki Kuraoka, einem Postdoktoranden aus meiner Abteilung, durchgeführt. Nachdem die AONs gemäß dem Textprotokoll entworfen wurden, verwenden Sie 6-Loch-Platten, um je ein- bis fünftausend CXMD-Myoblasten pro Quadratzentimeter in drei Milliliter DMEM mit 10 % FBS und 1 % Pen-Strep zu säen.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, bis sie 60 bis 80 % konfluent sind. Wenn die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht haben, verdünnen Sie ein kationisches Liposom-Transfektionsreagenz mit Medium mit reduziertem Serumanteil auf ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern und lassen Sie das Gemisch 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Verdünnen Sie anschließend die AONs mit Medium mit reduziertem Serumanteil auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern.Vermischen Sie das verdünnte Transfektionsreagenz mit den verdünnten AONs und inkubieren Sie die Mischung 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit entfernen Sie das Medium von den Zellen und waschen die Zellen dreimal mit frischem Medium. Geben Sie anschließend 0,8 Milliliter Medium zur Transfektionsmischung und fügen Sie die gesamte Lösung den frisch gewaschenen Zellen hinzu.Ansatz bei 37 Grad Celsius für drei Stunden. Danach Differenzierungsmedium (DM) zu den Zellen hinzufügen und bis zu 10 Tage inkubieren, damit die Differenzierung stattfinden kann. Ab etwa Tag drei die Differenzierung überprüfen.Um eine Morpholino-Transfektion von Hundenmyoblasten durchzuführen, kultivieren Sie CXMD-Myoblasten, wie zuvor in diesem Video gezeigt. Erhitzen Sie die Morpholino-Cocktails auf 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Geben Sie dann ein Peptid-Transportreagenz hinzu und stellen Sie die Morpholino-Konzentration auf einen Endwert von drei bis sechs Mikromolar ein.Als Nächstes verwenden Sie DM, um das Medium in den Myoblasten zu erneuern, und geben das Morpholino in jede Vertiefung mit einer Endkonzentration von einem Mikromolar hinzu. Inkubieren Sie 16 bis 18 Stunden lang. Anschließend, um die Zellen für die RNA-Extraktion zu gewinnen, geben Sie einen Milliliter Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform zu den Zellen, um diese von der Platte zu lösen.Nach der Inkubation der Zellen bei Raumtemperatur für 10 Minuten werden die Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie 200 Mikroliter Chloroform zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten, bis drei separate Schichten sichtbar sind: die RNA-Schicht, die Proteinschicht und die DNA-Schicht. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 × g und vier Grad Celsius für 15 Minuten.Entfernen Sie anschließend die obere Schicht des Überstandes und übertragen Sie sie in ein Gefäß mit 500&nbsp;Mikroliter Isopropanol. Zentrifugieren Sie die Überstandsgefäße, bevor Sie den Überstand entfernen und den RNA-Pellet aufbewahren. Waschen Sie den Pellet mit Ethanol und zentrifugieren Sie bei 8.000 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.Drehen Sie das Gefäß 15 Minuten lang um, um das restliche Ethanol zu verdampfen, bevor Sie 15 bis 30 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzufügen. Anschließend quantifizieren Sie die RNA mittels UV-Vis-Spektroskopie bei 260 Nanometern. Für die Durchführung der RT-PCR mischen Sie die folgenden Reagenzien und geben Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 25 Mikrolitern zu erreichen.Die Proben in einen Thermocycler geben und das folgende Programm durchführen. Nach Beendigung des Programms das Produkt bei vier Grad Celsius oder 20 Grad Celsius lagern. Um eine intramuskuläre Injektion durchzuführen, nachdem das Tier gemäß dem Textprotokoll für die Operation vorbereitet und anästhesiert wurde, mit einem Skalpell die Haut etwa fünf Zentimeter über der kranialen Tibia, oder CT, longitudinal schneiden. Um die Injektionsstellen zu markieren, mit einer chirurgischen Nadel und chirurgischem Faden die tiefe Faszie annähen, indem zwei Markierungsstiche in Abständen von zwei Zentimetern angebracht werden.Es ist sehr wichtig, die Injektionsstelle mit Faden zu markieren, da dies eine genauere Biopsie ermöglicht. Als Nächstes injizieren Sie mithilfe einer 27-Gauge-Nadel die gewünschte Konzentration von AONs in den Muskel und lassen die Nadel eine Minute lang stecken. Danach entnehmen Sie mit einem chirurgischen Skalpell ein Stück Muskelgewebe von etwa zwei Zentimeter Länge aus dem CT-Muskel, um eine offene Muskelbiopsie durchzuführen.Legen Sie die Muskelhaut wieder über den Muskel und verschließen Sie das Gewebe mit einem resorbierbaren Faden der Stärke 000. Anschließend verschließen Sie die Haut mit einem Nylonfaden der Stärke 000. Verabreichen Sie mittels einer Nadel eine intramuskuläre Injektion von 0,02 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphinhydrochlorid.Um einen Cocktail, der gleiche Mengen jedes AON enthält, in eine Gliedmaßenvene zu injizieren, während das Tier gemäß dem Textprotokoll gehalten wird, führen Sie eine intravenöse Dauernadel in eine Vene der Gliedmaße ein. Injizieren Sie mithilfe einer Infusionspumpe oder Spritzenpumpe insgesamt 50 Milliliter mit einer Geschwindigkeit von 2,5 Milliliter pro Minute über einen Zeitraum von 20 Minuten, und befolgen Sie dabei die Anweisungen des Herstellers. Wiederholen Sie die Injektionen wöchentlich oder alle zwei Wochen, da sich die Dystrophin-Expression bei wiederholten Injektionen anreichert.Führen Sie wöchentliche Blutuntersuchungen zur Toxizitätsprüfung durch, indem Sie mit einer Nadel drei Milliliter Blut aus einer der subkutanen Venen des Vorder- oder Hinterbeins entnehmen. Führen Sie gemäß den Herstelleranweisungen die folgenden Bewertungen durch. Führen Sie weitere Analysen gemäß dem Textprotokoll durch.Myoblasten wurden unter Verwendung verschiedener 2'OMePS-Behandlungsbedingungen transfiziert, um die Wirksamkeit der einzelnen AONs zu vergleichen. Das hier gezeigte Gel stellt RT-PCR-Proben von vier Tage nach der Behandlung gewonnener RNA dar. Höher im Gel liegende Banden repräsentieren Out-of-Frame-DMD-Produkte und wurden in nicht behandelten Ex8A- und Ex8B-behandelten Myoblasten beobachtet.Ex6A, Ex6B, Ex8A und die mit dem Cocktail behandelten Myoblasten zeigten korrekt gelesene Produkte. Die cDNA-Sequenzierung bestätigte, dass Exon 6 bis 9 übersprungen worden war. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, zeigte die immunzytochemische Analyse, dass AON-behandelte Hunde-Zellen im Vergleich zu unbehandelten Proben eine erhöhte Anzahl dystrophin-positiver Fasern aufwiesen.Um die Wirksamkeit verschiedener AON-Behandlungsbedingungen zu vergleichen, wurden CXMD-Hunde mit Ex6A oder einem Cocktail aus Ex6A, Ex6B und Ex8A in verschiedenen Dosierungen injiziert. Muskelproben, die mit DYS1 gefärbt wurden, zeigen eine Zunahme der Dystrophin-Expression in behandelten Proben, und die Anzahl dystrophinpositiver Fasern stieg mit der Dystrophin-Dosierung an. Nach systemischen Injektionen wiesen CXMD-Hunde, die mit dem Cocktail behandelt wurden, im Vergleich zu nicht behandelten CXMD-Hunden eine erhöhte Dystrophin-Expression auf, sowohl in CT- als auch in Herzmuskelproben.Jedoch wiesen AON-behandelte Skelettmuskeln einen deutlich höheren Dystrophin-Expression im Vergleich zu behandeltem Herzmuskel auf. Außerdem zeigten behandelte CXMD-Hunde eine verbesserte Histopathologie mit einer signifikanten Abnahme zentralnukleierter Fasern im Vergleich zu unbehandelten CXMD-Hunden. Sobald die Methoden beherrscht sind, können sowohl in-vitro- als auch in-vivo-Experimente innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, den Gesundheitszustand des Hundes sorgfältig zu überwachen. Nach seiner Entwicklung ebnete das systemische Exon-Skipping-Fahren den Forschern auf diesem Gebiet den Weg, klinische Studien an menschlichen Patienten mit DMD zu beginnen. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Hunde mit antisense-Oligonukleotiden behandelt werden.

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Research

Forschung

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Medizin

Verschiedenen antisense Oligonukleotide (AONs) haben gezeigt, zu induzieren Exon Aufnahme (Spleiß-Modulation) und SMN Ausdruck für Spinale Muskelatrophie (SMA) zu retten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für AON Lipotransfection, Exon Aufnahme in das SMN2 -gen und die Bewertungsmethoden zu ermitteln, die Wirksamkeit bei SMA Patienten Fibroblasten zu induzieren.

Bewertung der Exon-Aufnahme durch induzierte Splice Switching Antisense Oligonukleotide in SMA Patienten Fibroblasten

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um vorübergehend verbessern Herzfunktion bei Duchenne-Muskeldystrophie Mäusen durch die Transplantation von Exosomen von normalen myogen Vorläuferzellen abgeleitet.

Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen

Hier stellen wir ein Cas9-basiertes Exon23-Löschprotokoll vor, um die Dystrophinexpression in iPSC von Dmdmdx Maus-abgeleiteten Hautfibroblasten wiederherzustellen und iPSCs direkt in myogene Vorläuferzellen (MPC) mit dem Tet-on MyoD Aktivierungssystem zu differenzieren.

CRISPR/Cas9-Technologie zur Wiederherstellung der Dystrophinexpression in iPSC-abgeleiteten Muskelprogenitoren

Hier stellen wir die molekulare Charakterisierung der Dystrophin-38-Expression mit Sanger-Sequenzierung, RT-PCR und Western Blotting in der klinischen Studie vor.

Charakterisierung der Exon-Skipping-Effizienz in DMD-Patientenproben in klinischen Studien mit Antisense-Oligonukleotiden

In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur effizienten Modellierung des Duchenne-Muskeldystrophie-Muskels mit MYOD1-konvertiertenUrin-abgeleiteten Zellen, um die Wiederherstellung von Dystrophin mRNA und Proteinspiegel nach Exon-Skipping zu bewerten.

Exon Springt in direkt umprogrammierten Myotubes aus menschlichen Urin-abgeleiteten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Wir beschreiben eine minimal-invasive und schmerzfreie Methode, Hunde Hinterlauf der Muskelkraft und der Reaktion auf wiederholte exzentrische Kontraktionen zu messen.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

Eine strukturierte Protokoll für ein Assay auf Zellbasis als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose vorher mit Mobil dielektrischen Spektroskopie (CDS) dargestellt. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.

Zellbasierte Assay-Protokoll für die prognostische Prognose der idiopathischen Skoliose Mit Cellular dielektrischer Spektroskopie

Dieses Protokoll beinhaltet detaillierte Verfahren zur Isolierung von Urinzellen von Muskeldystrophie-Patienten; ihre effiziente und schnelle Reprogrammierung durch Sendai-Virus-Transduktion.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Erfahren Sie mehr über Multi-Exon-Skipping mit Cocktail-Antisense-Oligonukleotiden im Hundemodell der Duchenne-Muskeldystrophie. Diese Methode zeigt systemische Dystrophin-Rettung ohne signifikante Toxizität.

Auslassen von Multi-Exon-Verwendung Cocktail Antisense-Oligonucleotiden in der Canine X-chromosomal-Muskeldystrophie

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