Auslassen von Multi-Exon-Verwendung Cocktail Antisense-Oligonucleotiden in der Canine X-chromosomal-Muskeldystrophie

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wirksamkeit und Toxizität des multiplen Exon-Überspringens unter Verwendung von Cocktail-Antisense-Oligonukleotiden oder AONs in einem Hundemodell der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der translationalen Forschung der Antisense-Exon-Skipping-Therapie zu beantworten, z. B. ob Antisense-Oligonukleotide in einem Großtiermodell multiples Exon-Skipping induzieren und die Dystrophie-Expression zerstören können. Der Hauptvorteil der Verwendung des Hundemodells in einer Studie besteht darin, dass therapeutische Ergebnisse bei größeren Tieren zuverlässiger auf DMD-Patienten extrapoliert werden können.

Obwohl das Exon-Skipping eine sehr vielversprechende Therapie für DMD ist, kann es auch bei anderen genetischen Erkrankungen wie der angeborenen Muskeldystrophie und der Muskeldystrophie des Gliedmaßengürtels angewendet werden. Die Demonstration der In-vitro-Experimente wird von Dr. Yoshitsugu Aoki, unserem Laborleiter, durchgeführt, und die Demonstration der In-vivo-Experimente wird von Dr. Mutsuki Kuraoka, einem Postdoktoranden aus meiner Abteilung, durchgeführt. Nach dem Entwerfen von AONs gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie 6-Well-Platten, um ein- bis fünfmal 10 bis ein Drittel pro Quadratzentimeter CXMD-Myoblasten in drei Milliliter DMEM mit 10 % FBS und 1 % Pen-Streptokokken zu säen.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, bis sie zu 60 bis 80 % konfluent sind. Wenn die Zellen die gewünschte Konfluenz erreichen, verwenden Sie ein reduziertes Serummedium, um ein kationisches Liposomentransfektionsreagenz auf ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu verdünnen, und lassen Sie die Mischung 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Verdünnen Sie dann die AONs mit reduziertem Serummedium auf ein Endvolumen von 100 Mikrolitern.

Kombinieren Sie das verdünnte Transfektionsreagenz mit den verdünnten AONs und inkubieren Sie es 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit das Medium von den Zellen entfernen und die Zellen mit frischem Medium dreimal waschen. Fügen Sie dann 0,8 Milliliter Medium zur Transfektionsmischung hinzu und geben Sie dann die gesamte Lösung in die frisch gewaschenen Zellen.

Drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie dann Differenzierungsmedium (DM) zu den Zellen und inkubieren Sie bis zu 10 Tage lang, damit die Differenzierung stattfinden kann. Beginnen Sie mit dem dritten Tag, prüfen Sie, ob es sich unterscheidet.

Um eine Morpholino-Transfektion von Hunde-Myoblasten durchzuführen, kultivieren Sie CXMD-Myoblasten, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Cocktail-Morpholinos bei 65 Grad Celsius 10 Minuten erhitzen. Fügen Sie dann ein Peptidabgabereagenz hinzu und stellen Sie das Morpholino auf eine Endkonzentration von drei bis sechs Mikromolaren ein.

Als nächstes verwenden Sie DM, um das Medium in den Myoblasten zu ersetzen, und fügen Sie das Morpholino in jeder Vertiefung in einer Endkonzentration von einem Mikromolaren hinzu. 16 bis 18 Stunden inkubieren. Um die Zellen für die RNA-Extraktion zu sammeln, fügen Sie den Zellen dann einen Milliliter Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform hinzu, um sie von der Platte zu lösen.

Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, werden die Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie 200 Mikroliter Chloroform in jedes Röhrchen und inkubieren Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur, bis drei separate Schichten zu sehen sind, die RNA-Schicht, die Proteinschicht und die DNA-Schicht. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 g und vier Grad Celsius für 15 Minuten.

Entfernen Sie dann die oberste Schicht des Überstands und geben Sie sie in ein Röhrchen mit 500 Mikrolitern Isopropanol. Drehen Sie die Überstandsröhrchen, bevor Sie den Überstand entfernen und das RNA-Kügelchen aufbewahren. Verwenden Sie Ethanol, um das Pellet zu waschen, und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 8.000 g und vier Grad Celsius.

Drehen Sie das Röhrchen 15 Minuten lang um, um das restliche Ethanol zu verdampfen, bevor Sie 15 bis 30 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzufügen. Verwenden Sie dann die UV-Vis-Spektroskopie bei 260 Nanometern, um die RNA zu quantifizieren. Um die RT-PCR durchzuführen, mischen Sie die folgenden Reagenzien zusammen und fügen Sie Wasser bis zu einem Endvolumen von 25 Mikrolitern hinzu.

Geben Sie die Proben in einen Thermocycler und führen Sie das folgende Programm aus. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, lagern Sie das Produkt bei vier Grad Celsius oder 20 Grad Celsius. Um eine intramuskuläre Injektion durchzuführen, schneiden Sie die Haut nach der Vorbereitung des Tieres für die Operation und der Betäubung gemäß dem Textprotokoll mit einem Skalpell etwa fünf Zentimeter in Längsrichtung über dem kranialen Tibia ab oder markieren CT.To Sie die Injektionsstellen mit einer chirurgischen Nadel und einem chirurgischen Faden, um die tiefe Faszie zu nähen, indem Sie zwei Stichmarkierungen im Abstand von zwei Zentimetern machen.

Es ist sehr wichtig, die Injektionsstelle mit einem Faden zu markieren, da dies eine genauere Biopsie ermöglicht. Injizieren Sie anschließend mit einer 27-Gauge-Nadel die gewünschte Konzentration von AONs in den Muskel und lassen Sie die Nadel eine Minute lang drin. Um dann eine offene Muskelbiopsie durchzuführen, verwenden Sie ein chirurgisches Skalpell, um ein etwa zwei Zentimeter langes Stück Muskelgewebe aus dem CT-Muskel zu entfernen.

Legen Sie die Muskelfaszie wieder über den Muskel und verwenden Sie einen resorbierbaren 000er Faden, um das Gewebe zu schließen. Verwenden Sie dann 000 Nylonfaden, um die Haut zu schließen. Verabreichen Sie mit einer Nadel eine intramuskuläre Injektion von 0,02 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphinhydrochlorid.

Um einen Cocktail mit gleichen Mengen jedes AON in eine Gliedmaßenvene zu injizieren, während das Tier gemäß dem Textprotokoll gehalten wird, führen Sie eine venöse Verweilnadel in eine Gliedmaßenvene ein. Injizieren Sie mit einer Infusionspumpe oder einem Spritzentreiber insgesamt 50 Milliliter mit 2,5 Millilitern pro Minute für 20 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wiederholen Sie die Injektionen wöchentlich oder zweiwöchentlich, da sich die Dystrophinexpression bei wiederholten Injektionen ansammelt.

Um wöchentliche Blutuntersuchungen durchzuführen, um die Toxizität zu untersuchen, verwenden Sie eine Nadel, um drei Milliliter Blut aus einer der subkutanen Venen der Vorder- oder Hintergliedmaße zu entnehmen. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers und fügen Sie die folgenden Bewertungen hinzu. Führen Sie weitere Analysen gemäß dem Textprotokoll durch.

Myoblasten wurden mit verschiedenen 2'OMePS-Behandlungsbedingungen transfiziert, um die Wirksamkeit der einzelnen AON zu vergleichen. Das hier gezeigte Gel stellt RT-PCR-Proben von RNA dar, die vier Tage nach der Behandlung entnommen wurden. Banden weiter oben auf dem Gel stellen DMD-Produkte außerhalb des Rahmens dar und wurden bei den unbehandelten Ex8A- und Ex8B-behandelten Myoblasten beobachtet.

Ex6A, Ex6B, Ex8A und die mit Cocktails behandelten Myoblasten zeigten In-Frame-Produkte. Die cDNA-Sequenzierung bestätigte, dass die Exons 6 bis 9 übersprungen worden waren. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, zeigte die Immunzytochemie, dass AON-behandelte Hundezellen im Vergleich zu unbehandelten Proben mehr Dystrophin-positive Fasern aufwiesen.

Um die Wirksamkeit verschiedener AON-Behandlungsbedingungen zu vergleichen, wurde CXMD-Hunden Ex6A oder ein Cocktail aus Ex6A, Ex6B und Ex8A in verschiedenen Dosierungen injiziert. Muskelproben, die auf DYS1 gefärbt wurden, zeigen eine Zunahme der Dystrophin-Expression in mit Cocktails behandelten Proben, und Dystrophin-positive Fasern nahmen mit der Dystrophin-Dosierung zu. Nach systemischen Injektionen zeigten mit Cocktails behandelte CXMD-Hunde im Vergleich zu NT CXMD-Hunden eine erhöhte Dystrophin-Expression, sowohl in CT- als auch in Herzmuskelproben.

AON-behandelte Skelettmuskeln zeigten jedoch eine viel höhere Expression von Dystrophin im Vergleich zum behandelten Herzmuskel. Darüber hinaus zeigten behandelte CXMD-Hunde eine verbesserte Histopathologie mit einer signifikanten Abnahme der zentralkernhaltigen Fasern im Vergleich zu NT-CXMD-Hunden. Einmal gemeistert, können sowohl in vitro als auch in vivo Experimente in ein paar Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, den Gesundheitszustand des Hundes sorgfältig zu überwachen. Nach seiner Entwicklung ebnete das systemische Exon-Skipping den Weg für Forscher auf diesem Gebiet, klinische Studien am Menschen an DMD-Patienten zu starten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Hunde mit Antisense-Oligonukleotiden behandelt werden.