Name: Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen In Vitro / In Silico Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Lernen Sie ein kombiniertes 3D-Lungentumormodell mit Kollagenscaffold und In-Silico-Vorhersagen kennen. Diese Methode optimiert die Vorhersage der Arzneimittelwirksamkeit bei NSCLC basierend auf spezifischen Mutationshintergründen.

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Diese Forschung wurde durch das Zentrum für Interdisziplinäre Klinische Forschung (IZKF, Zuschuss BD247) der Universitätsklinik Würzburg und der Bayern Fit-Programm (erteilt Heike Walles) gefördert.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir haben eine in vitro kombiniert etabliert / in silico Tumortestsystem für die Biomarker-gestützte Behandlung Vorhersagen. Die in - vitro - Modell bewertet verschiedene wichtige Aspekte der Verbindung Maßnahmen wie beispielsweise Veränderungen der Tumorzellproliferation und Apoptose auf einer spezifischen Mutations Hintergrund, der auch 17 in silico simuliert werden können. Hier präsentieren wir das standardisierte Protokoll für die 3D - Tumormodell Erzeugung und...

Die pharmazeutische Industrie steht vor hohen Ausfallraten von bis zu 95% im Bereich der Krebstherapie in der klinischen Phase verursacht enorme Kosten 1-5. Ein Grund für diesen Mangel ist die Tatsache, dass zur Zeit die Wirksamkeit von potentiellen neuen Verbindungen bewertet wird in großem Maßstab Screenings auf 2D-Zellkulturen von Krebszelllinien, oder in Tiermodellen. Tiermodelle haben eine höhere Komplexität , aber es gibt entscheidende Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen 6,7. In den letzten zehn Jahren Modelle 3D Krebs verschiedene Ansätze wurden erzeugt , um die Lücke zwischen 2D - Kultur von Krebszelllinien und einem Komplex in vivo Tumor 6,8,9 zu überbrücken. Die Auswirkungen der 3D - Umgebung auf die Zelldifferenzierung und auch Signalisierung in mehreren Studien wurde Jahren gezeigt (z. B. durch Mina Bissell) 10,11. Heute sind viele 3D - Zellkulturmodelle zur Verfügung, wie Sphäroid - Kulturen, Hydrogele oder Mikrofluidik - Chips 12-16. Obwohl these-Modelle Komplexität im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kultursystemen zu verbessern, sie eine Gewebemikroumgebung meist fehlen, die bekannt ist, Tumor-tragenden Effekte und hat auch Auswirkungen auf die Arzneimittelwirksamkeit zu haben. Um dieses Problem zu beheben, haben wir einen ein 3D - Modell Tumor auf der Basis eines biologischen Gerüst SISmuc (small-Darm-Submukosa + Schleimhaut) genannt , die von einem dezellularisierter Schweine Jejunum abgeleitet wird. Dadurch werden die Gewebearchitektur und wichtige Komponenten der ECM wie verschiedene Kollagene sowie der Basalmembran Struktur 17 erhalten. Diese einzigartige Funktion ist für die Tumormodellgeneration von Karzinomen von entscheidender Bedeutung, die von Epithelien und umfassen etwa 80% von soliden Tumoren entstehen. Darüber hinaus wird die Proliferationsrate in unserem Tissue-Engineering-Tumormodell reduziert im Vergleich zu den künstlich hohen Raten in 2D-Kultur erreicht. Wie Proliferation bei der Beurteilung der Wirksamkeit von Medikamenten ist ein wichtiger Parameter, Drogentests ist in unserem Modell ermöglicht in ähnlicherBedingungen in vivo Tumoren 17. Um das Potenzial unseres Modells zu bewerten Biomarker-abhängige Wirksamkeit von Medikamenten , korrekt vorherzusagen, wir hier vorliegenden Daten für zwei verschiedene Lungenkrebszelllinien , die in ihrem EGFR -biomarker Status unterscheiden. Dieser Mutationsstatus hat begonnen routinemßig in NSCLC-Patienten bestimmt werden. Gezielte Behandlungen mit TKI wie der EGFR -Inhibitor Gefitinib gegen Tumoren eine aktivierende EGFR - Mutation zeigen hervorragende Ergebnisse tragen im Vergleich zu denen mit einer platinbasierten Chemotherapie 18-21. Wir stellten verschiedene Techniken Auslesen, die zur Bewertung der Wirksamkeit Verbindung relevant sind. Weiterhin wird nach TGF-beta-1 - Stimulation sind wir in der Lage Verbindung Aktionen in Tumorzellen zu untersuchen, die die EMT - Prozess gestartet, der angenommen wird , ein wichtiger Schritt in der malignen Transformation 22,23 zu sein , und die mit dem Drogen resistan verbunden istce 24. Das 3D-Modell Tumor ermöglichen die Überwachung zellspezifische Antworten auf gezielte Behandlungen, Chemotherapie oder Medikamentenkombinationen mit guten Kontrasten. Zur weiteren Verbesserung und Drogen-Screening zu beschleunigen und Widerstand zu begegnen, wird dies durch eine in silico Simulation ergänzt. Basierend auf einigen Versuchen kann der Tumor - Antwort in silico vorhergesagt werden , in Bezug auf das Ergebnis für eine breite Palette von Medikamenten und deren Kombinationen.

<table><tbody><tr><td>Bioreaktoren</td><td>Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, W&uuml; rzburg (D)</td><td></td><td>Bioreaktor-Aufbau</td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fidschi)</td><td>Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkronen</td><td>Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, W&uuml; rzburg (GER)</td><td></td><td>für statische 3D-Kultur</td></tr><tr><td>CellDesigner</td><td>http://www.celldesigner.org/</td><td>-</td><td>Diese Software wurde zum Zeichnen des Netzwerks verwendet.</td></tr><tr><td>Citrat-Pufferlösung (10x)</td><td>Eigenproduktion</td><td></td><td>42 g/l Zitronensäure-Monohydrat, 17,6 g/l Natronlauge-Pellets in entionisiertem Wasser, pH 6,0, gelagert bei RT.</td></tr><tr><td>Citrat-Puffer-Arbeitslösung</td><td>in der Eigenproduktion</td><td></td><td>10%ige Citrat-Pufferlösung in demineralisiertem Wasser, gelagert bei RT.</td></tr><tr><td>Zitronensäuremonohydrat</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>1002441000</td><td>wird für den Citratpuffer verwendet</td></tr><tr><td></td><td>Deckgläser VWR, Darmstadt (GER)</td><td>631-1339</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-GTM</td><td>SouthernBiotech, Birmingham (USA)</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Datenbanken wie KEGG, HPRD und QIAGEN (Gene & Pathways)</td><td>http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/</td><td>-</td><td>Verschiedene bekannte Literaturdatenbanken wurden für die Generierung der Netzwerktopologie verwendet.</td></tr><tr><td>Weibliches Luer Lug Style T-Shirt</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>FTLT-1</td><td>Bioreaktor-Setup</td></tr><tr><td>Weiblicher Luer-Gewinde-Stil mit 5/16" Sechskant auf 1/4-28 UNF Gewinde</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>SFTLL-J1A&nbsp;</td><td>Aufbau des Bioreaktors</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Bio& VERKAUFEN, Feucht (GER)</td><td>FCS. ADD.0500</td><td>nicht wärmeinaktiviert</td></tr><tr><td>Gefitinib</td><td>Absource Diagnostics GmbH, M&uuml; nchen (GER)</td><td>S1025-100 mg</td><td>100 mM Stammlösung mit DMSO</td></tr><tr><td>Glaskolben (Schott, GER) mit Glasschlauchanschluss versehen</td><td>Weckert, Kitzingen (GER)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4% (Paraformaldehyd)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>P087.1</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchkupplung</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>CC-9</td><td>Bioreaktor Aufbau</td></tr><tr><td>Inkubator für Bioreaktoren</td><td>Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, W&uuml; rzburg (GER)</td><td></td><td>Aufbau des Bioreaktors</td></tr><tr><td>M30 CytoDeathTM ELISA</td><td>Peviva, Bromma (SWE)</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Männlicher Luer Integral Lock Ring</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>MTLL230-J1A</td><td>Bioreaktor setup</td></tr><tr><td>Feuchtigkeitskammer</td><td>nach Maß</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus anti Pan-Cytokeratin</td><td>Sigma-Aldrich, München (GER)&nbsp; &nbsp;</td><td>C2562-2ML</td><td>Klon C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3
+M20+A53-B/A2, verwendet 1/100 für Immunfluoreszenz</td></tr><tr><td>Nadelfreies Tupferventil Weibliches</td><td>Luer Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>NVFMLLPC</td><td>Bioreaktoraufbau, für Probenahme, gammasterilisiert</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 10 rot 37 x 3 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>21444</td><td>O-Ring groß, Bioreaktoraufbau</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 70 rot 27 x 2,5 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>19170</td><td>O-Ring klein, Bioreaktoraufbau</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Dako, Hamburg (GER)</td><td>S002</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER)</td><td></td><td>Aufbau des Bioreaktors</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich, München (GER)&nbsp; &nbsp;</td><td>D8537-6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pumpenschlauchkassette</td><td>Ismatec, Wertheim (GER)</td><td>IS 3710</td><td>Bioreaktor Aufbau</td></tr><tr><td>Kaninchen anti Ki67</td><td>Abcam, Cambridge (UK)</td><td>ab16667</td><td>Klon SP6, verwendet für 1/100 für IF</td></tr><tr><td>Kaninchen anti Vimentin</td><td>Abcam, Cambridge (UK)</td><td>ab92547</td><td>gebraucht 1/100 für IF</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Life technologies, Darmstadt (GER)</td><td>61870-044</td><td>warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)</td><td>HC66.1</td><td>Bioreaktoraufbau</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich, M&uuml; nchen (GER)</td><td>30620-1KG-R</td><td>für den Citratpuffer</td></tr><tr><td>SQUAD</td><td></td> <td>http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Diese</td> <td>Software wurde für die Durchführung der semiquantitativen Simulationen verwendet.</td></tr><tr><td>Sterilluftfilter, Porengröße 0,2 &Mikro; m</td><td>Sartorius Stedium Biotech, G&ouml; ttlingen (GER)</td><td>16596-HYK</td><td>Bioreaktoraufbau</td></tr><tr><td>Spritze Luer Lok 5 ml</td><td>BD Biosciences, Heidelberg (GER)</td><td>309649</td><td>für die Probenahme von Bioreaktoren</td></tr><tr><td>Gewebekultur-Testplatten: 6-,&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 12-, 24-, 96- Bohrloch</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)</td><td>92006, 92012, 92024, 92048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Transformierender Wachstumsfaktor-beta 1 (TGF-&beta; 1) mit Carrier</td><td>Cell Signaling, Frankfurt (GER)</td><td>8915LC</td><td>Stammlösung in sterilem Citratpuffer pH 3,0</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, M&uuml; nchen (GER)</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich, M&uuml; nchen (GER)</td><td>P7949-500ml</td><td>zum Waschen von Puffern aus Immunfluoreszenzfärbungen</td></tr></tbody></table>

ein kombiniertes 3d-gewebezüchtungen<em&gt; in vitro</em&gt; /<em&gt; in silico</em&gt; lungentumormodell für hintergründe in bestimmten mutations drug wirksamkeit vorhersagen

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In der vorliegenden Studie, kombiniert wir ein in vitro - 3D - Lungentumormodell mit einem in silico - Modell Vorhersagen der Arzneimittelreaktion zu optimieren basierend auf einem bestimmten Mutations - Hintergrund. Das Modell ist auf einem dezellularisierter Schweine Gerüst erzeugt, die gewebespezifische Eigenschaften in Bezug auf extrazelluläre Matrix-Zusammensetzung und Architektur einschließlich der Basalmembran wiedergibt. Wir standardisiert ein Protokoll, das innerhalb von 14 Tagen mit drei Tagen der medikamentösen Behandlung künstlichen Tumorgewebe Generation ermöglicht. Unser Artikel stellt einige detaillierte Beschreibungen von 3D - Auslese Screening - Techniken wie die Bestimmung des Proliferationsindex Ki67 - Färbung der Apoptose von Überständen von M30-ELISA und Beurteilung von epithelialen zu mesenchymale Transition (EMT), die hilfreiche Werkzeuge sind für die Bewertung der Wirksamkeit von therapeutischen Verbindungen. Wir konnten zeigen, eine Reduktion der Proliferation in unserem 3D-Tumormodell in 2D-Kultur verglichen, die relat isted der klinischen Situation. Trotz dieser geringeren Proliferation prognostiziert das Modell EGFR -targeted Droge Antworten korrekt entsprechend dem Status von Biomarkern wie durch einen Vergleich der Lungenkarzinomzelllinien HCC827 (EGFR -mutated, KRAS - Wildtyp) und A549 (EGFR Wildtyp - KRAS - mutiert mit der Tyrosin-Kinase - Inhibitor (TKI) Gefitinib behandelt). Um Drogen Antworten von fortgeschrittenen Tumorzellen zu untersuchen, wir EMT durch langfristige Behandlung mit TGF-beta-1 induziert, wie durch Vimentin / pan-Zytokeratin Immunfluoreszenzanfärbung beurteilt. Ein strömungs Bioreaktor wurde verwendet Kultur physiologischen Bedingungen einzustellen, die Gewebebildung verbessert. Darüber hinaus zeigen wir die Integration von Drogen Antworten auf Gefitinib Behandlung oder TGF-beta-1 - Stimulation - die Apoptose, Proliferationsindex und EMT - in ein Boolean in silico - Modell. Darüber hinaus erläutern wir, wie Arzneimittelreaktionen von Tumorzellen mit einem bestimmten Mutations-Hintergrund und Zählungerstrategies gegen Widerstand vorhergesagt werden. Wir sind zuversichtlich , dass unsere 3D - In - vitro - Ansatz vor allem mit seinen in silico Expansion für die präklinische Drogentests in realistischer Bedingungen als in 2D - Zellkultur einen zusätzlichen Wert liefert.

Auf der Grundlage des SISmuc Gerüst (2A bis C), haben wir ein standardisiertes Betriebsprotokoll für die Erzeugung, Stimulierung und Behandlung eines Testsystems 3D - Tumor (2D). Dieses Modell ermöglicht die Bestimmung des Proliferationsindex und die Quantifizierung der Apoptose unter Verwendung von M30-ELISA , wie jeweils in Figur 1 und Figur 3 gezeigt. 3 zeigt repräsentative H &amp; E - Färbung von A54...

Wir präsentieren ein dreidimensionales (3D) Lungenkrebsmodell, das auf einem biologischen Kollagengerüst basiert, um die Empfindlichkeit gegenüber nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)-zielgerichteten Therapien zu untersuchen. Wir demonstrieren verschiedene Auslesetechniken zur Bestimmung des Proliferationsindex, der Apoptose und des epithelial-mesenchymalen Übergangsstatus (EMT). Die gesammelten Daten werden in ein in silico-Modell zur Vorhersage der Arzneimittelsensitivität integriert.

Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Das übergeordnete Ziel dieses kombinierten In Vitro/In Silico Lungenkrebsmodells besteht darin, die Sensitivität von nicht-kleinzelligen Lungenkrebstherapien zu untersuchen und die Wirksamkeit neuer Substanzen vorherzusagen. Dieses 3-D-Modellsystem ermöglicht die Überwachung zellspezifischer Reaktionen auf gezielte Behandlungen oder direkte Kombinationen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die in Silico abgedeckten Vorhersagen die präklinische Arzneimittelprüfung in einer physiologisch relevanteren Umgebung erleichtern können.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie verschiedener Tumorentitäten, da sie zur Optimierung der Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente auf der Grundlage spezifischer Mutationshintergründe verwendet werden kann. Vorführen wird das Verfahren von Franziska Schmitt, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus unserem Labor. Um eine dynamische Kultur einzurichten, kultivieren Sie das Tumormodell zunächst unter statischen Kulturbedingungen in einer Zellkrone bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in einem herkömmlichen Inkubator.Nach drei Tagen bauen Sie einen autoklavierten Bioreaktor zusammen und setzen Sie ein ausgesätes, biologisches Dünndarm-Submukoso- und Schleimhautgerüst in das System ein. Geben Sie anschließend 45 Milliliter RPMI, ergänzt mit der entsprechenden Menge FCS, in einen Kolben und verbinden Sie das nadelfreie Probenahmegerät mit dem Schlauchsystem zwischen dem Bioreaktor und dem Kolben mit dem Medium. Setzen Sie den Bioreaktor in den Inkubator ein und schließen Sie ihn an die Pumpe an, um das Tumormodell für weitere 14 Tage mit einem konstanten Medienfluss von drei Millilitern pro Minute zu kultivieren.Um ein statisches Tumormodell mit Gefitinib am 11. Tag der Kultur im konventionellen Inkubator zu behandeln, verwenden Sie zunächst eine Pasteurpipette, um das alte Medium aus den Vertiefungen zu entfernen. Geben Sie dann einen Milliliter frisch zubereitetes RPMI, ergänzt mit FCS und Gefitinib, auf die Innenseite jeder Zellkrone und 1,5 Milliliter auf den Boden jeder Vertiefung. Um Elisas Proben aus einer dynamischen Kultur zu entnehmen, befestigen Sie an den Kulturtagen 11 bis 14 die Spritze an dem Probenahmegerät und entfernen Sie einen Milliliter Medium aus dem Bioreaktorsystem.Lagern Sie die Proben dann bei minus 80 Grad Celsius, bis die Elisa durchgeführt wird. Um die Anzahl der Ki67-positiven Zellkerne zu bestimmen, verwenden Sie zunächst ein inverses Mikroskop, um fünf DAPI- und fünf Ki67-Färbefluoreszenzbilder von 2D-Kulturen mit einer 20-fachen Vergrößerung jeder Bedingung aus nicht überlappenden Abschnitten der Probe zu erhalten. Um die positiven Ki67-Kerne manuell zu zählen, öffnen Sie das entstandene Bild in Fidschi und wählen Sie Plugins und Zellzähler aus, klicken Sie dann auf Initialisieren, wählen Sie einen Zählertyp aus und klicken Sie auf jeden positiven Ki67-Kern.Die Anzahl der angeklickten Zellen wird neben dem ausgewählten Indikatortyp angezeigt. Um die Gesamtzahl der Zellkerne in den 2D-Bildern automatisch zu zählen, starten Sie den Makrorekorder, öffnen Sie ein DAPI-Bild, klicken Sie auf Bild, Typ und 8-Bit, klicken Sie dann auf Kontrast verbessern, legen Sie den Parameter "Gesättigt" auf eins fest und normalisieren Sie ihn. Um das Bild zu schärfen, stellen Sie die Unschärfemaske mit einem Radius von eins und einer Maske von 60 ein.Um das Bild zu binden, klicken Sie auf "Automatischer Schwellenwert" und wählen Sie die Methode "Reny/Entropie" mit weißen Objekten auf schwarzem Hintergrund. Klicken Sie dann auf Plugins, gefolgt von BioVoxxel und watershed irregular feature, mit einem Erosionsradius von fünf, um die Zellen zu trennen. Klicken Sie auf Analysieren und Partikel analysieren, legen Sie die Größe auf 02 unendlich fest und aktivieren Sie Zusammenfassen.Die Anzahl der Zellen wird in der Übersichtstabelle als Anzahl angezeigt. Klicken Sie dann auf Erstellen, um das Makro für die automatische Zählung von Zellkernen in weiteren 2D-Zellkulturbildern zu speichern. Nachdem Sie Know-Datenbanken zum Generieren eines Tumornetzwerks verwendet haben, öffnen Sie die entsprechende Netzwerkanalysesoftware, klicken Sie auf Datei und neu und geben Sie Jove-Tumormodelle ein.Klicken Sie auf ok, um ein neues Netzwerk zu erzeugen, dann auf Quadrat Nahaufnahme Norden und ok, um den Rezeptor in einer Doppelmembran zu visualisieren. Um die Knoten als Rechtecke zu visualisieren, klicken Sie auf generisches Protein, dann auf EGFR und dann auf Ok.To beschriften Sie die Knoten im Netzwerk, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Farbe und Form zu ändern, und legen Sie die Knotenfarbcodes wie angegeben fest. Um die Ausleseparameter als Sechsecke zu visualisieren, wählen Sie aus, phänotypisieren, geben Sie proliferation ein und klicken Sie auf OK.Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie erneut Farbe und Form ändern aus, um den Farbcode auf 255, 204, 204 festzulegen. Um die Kanten von Knoteninteraktionen zu visualisieren, klicken Sie auf Zustandsübergang für Aktivierungspfeile und auf Inhibition für abgestumpfte Inhibitionspfeile. Klicken Sie dann auf Datei und Speichern unter und speichern Sie das generierte Signalnetzwerk als Jove Tumor models.xml.Für eine stationäre Analyse des Systemgleichgewichts öffnen Sie die SQUAD-Software, klicken Sie auf Netzwerk laden und laden Sie die models. xml Datei des Jupitertumors hoch. Klicken Sie auf, Analyse ausführen.Um ein Simulationsprotokoll zu schreiben, klicken Sie auf Erweitert und dann auf Pertubator und dann auf Protokoll bearbeiten, um die Anit-EGFR-Resistenz zu simulieren. Klicken Sie anschließend auf Pertubation und wählen Sie den Standard-Anfangszustand gleich stationärem Zustand vier aus. Klicken Sie auf Hinzufügen, um den neuen konstanten Impuls hinzuzufügen, wählen Sie dann den Statusparameter aus und setzen Sie das Ziel auf FLIP, die Zeit auf Null und den Wert auf 4.Klicken Sie auf OK und legen Sie die Zustände für c-MET und Gefitinib auf die gleiche Weise fest. Um einen Statuswert auf den aktiven EGFR-Knoten festzulegen, klicken Sie auf Aktiver Knoten und dann auf Bearbeiten. Legen Sie den Status auf 8 fest, und klicken Sie auf OK.Klicken Sie auf OK, um das Protokoll zu speichern. Um die spezifischen Kurven anzuzeigen, wählen Sie im Optionsfeld EGF-EGFR, Stern EGF-EGFR, Stern Mek, Caspasen, PI3K, Gegitinib, Apoptose, Proliferation, MEk-Inhibitor und PI3K-Inhibitor. Klicken Sie dann auf Initialisieren und ausführen, um eine vollständige Simulation der Systemantwort zu starten.Um eine kombinierte Behandlung mit PI3K- und Mek-Inhibitoren zu simulieren, klicken Sie auf Protokoll bearbeiten. Klicken Sie anschließend mit demselben Knotenparameter wie gerade gezeigt auf Pertubation, gefolgt von Hinzufügen, um einen neuen konstanten Impuls hinzuzufügen. Wählen Sie dann einen Statusparameter aus, setzen Sie das Ziel auf PI3K-Inhibitor, die Zeit auf Null und den Wert auf eins, und klicken Sie auf OK.Klicken Sie erneut auf Hinzufügen, um einen weiteren neuen konstanten Impuls hinzuzufügen, und setzen Sie unter dem Parameter state das Ziel auf Mek-Inhibitor, setzen Sie die Zeit auf Null und den Wert auf eins und klicken Sie auf OK, gefolgt von erneut OK, um das Protokoll zu speichern. Klicken Sie im Optionsbereich unter Verwendung der gleichen Knoten für die grafische Darstellung wie gerade gezeigt auf Initialisieren und ausführen, um eine vollständige Simulation der Systemantwort zu starten. Um die Simulation abzuschließen, klicken Sie dann auf Zurücksetzen.Dieses 3D-Tumortestsystem erleichtert die Bestimmung des Proliferationsindex. Und die Quantifizierung der Apoptose mit M30 Elisa. In diesem repräsentativen Experiment reagierten beispielsweise nur EGFR-mutierte HCC827-Tumorzellen, die unter statischen Kulturbedingungen inkubiert wurden, auf die Hemmung des epidermalen Wachstumsfaktors.Durch den Tyrosin-Kinase-Inhibitor Gefitinib, wie die im Tumormodellsystem HCC827 beobachtete Zunahme der Apoptose zeigt. Hier werden repräsentative Bilder von statischen 3D-Tumormodellen mit oder ohne Epithel-Mesenchym-Übergangsinduktor, TGF-beta-1-Simulation, gezeigt. Beachten Sie die Zunahme der Vimentin-Expression in den behandelten Tumorzellkulturen.Unter dynamischen Bedingungen übt Gefitinib eine robuste Wirkung auf EGFR-mutierte HCC827-Zellen aus, was sich in der Abnahme gewebeähnlicher Strukturen in Gegenwart des Tyrosin-Kinase-Inhibitors im Vergleich zur unbehandelten kontrollierten Kultur zeigt. In diesem Diagramm wird die Simulation des bekannten Antriebs in der Mutation, der EGFR- und c-MET-Koaktivierung sowie einer erhöhten Proliferationsrate und einer verringerten Apoptoserate in HCC827-Zellen im Laufe der Zeit beobachtet, was eine Gefitinib-induzierte Resistenz widerspiegelt, die mit der Aktivierung von MEK und PI3K korreliert. Tatsächlich führt die Modellierung der kombinierten PI3K- und MEK-Inhibitoren zu einer Umkehrung des Anti-EGFR-Resistenzeffekts, einer Verringerung der Proliferation und der Induktion von Apoptose.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blot oder durchgeführt werden, um nachgeschaltete Signalwege zu untersuchen. Darüber hinaus können Co-Kultursysteme mit verschiedenen Zelltypen auch verwendet werden, um die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zellen in der Mikroumgebung des Tumors zu analysieren. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung den Weg, die Wirksamkeit von Medikamenten in Silico zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wirksamkeit von Medikamenten in stratifizierten Patientengruppen vorhersagen können, indem Sie Signalveränderungen simulieren und die resultierenden Systemreaktionen bei verschiedenen Mutationen und Hintergründen analysieren.

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Research

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Biotechnik

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Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen In Vitro / In Silico Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen (Video) | JoVE Journal

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