Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen

Das übergeordnete Ziel dieses kombinierten In Vitro/In Silico Lungenkrebsmodells besteht darin, die Sensitivität von nicht-kleinzelligen Lungenkrebstherapien zu untersuchen und die Wirksamkeit neuer Substanzen vorherzusagen. Dieses 3-D-Modellsystem ermöglicht die Überwachung zellspezifischer Reaktionen auf gezielte Behandlungen oder direkte Kombinationen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die in Silico abgedeckten Vorhersagen die präklinische Arzneimittelprüfung in einer physiologisch relevanteren Umgebung erleichtern können.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie verschiedener Tumorentitäten, da sie zur Optimierung der Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente auf der Grundlage spezifischer Mutationshintergründe verwendet werden kann. Vorführen wird das Verfahren von Franziska Schmitt, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus unserem Labor. Um eine dynamische Kultur einzurichten, kultivieren Sie das Tumormodell zunächst unter statischen Kulturbedingungen in einer Zellkrone bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in einem herkömmlichen Inkubator.

Nach drei Tagen bauen Sie einen autoklavierten Bioreaktor zusammen und setzen Sie ein ausgesätes, biologisches Dünndarm-Submukoso- und Schleimhautgerüst in das System ein. Geben Sie anschließend 45 Milliliter RPMI, ergänzt mit der entsprechenden Menge FCS, in einen Kolben und verbinden Sie das nadelfreie Probenahmegerät mit dem Schlauchsystem zwischen dem Bioreaktor und dem Kolben mit dem Medium. Setzen Sie den Bioreaktor in den Inkubator ein und schließen Sie ihn an die Pumpe an, um das Tumormodell für weitere 14 Tage mit einem konstanten Medienfluss von drei Millilitern pro Minute zu kultivieren.

Um ein statisches Tumormodell mit Gefitinib am 11. Tag der Kultur im konventionellen Inkubator zu behandeln, verwenden Sie zunächst eine Pasteurpipette, um das alte Medium aus den Vertiefungen zu entfernen. Geben Sie dann einen Milliliter frisch zubereitetes RPMI, ergänzt mit FCS und Gefitinib, auf die Innenseite jeder Zellkrone und 1,5 Milliliter auf den Boden jeder Vertiefung. Um Elisas Proben aus einer dynamischen Kultur zu entnehmen, befestigen Sie an den Kulturtagen 11 bis 14 die Spritze an dem Probenahmegerät und entfernen Sie einen Milliliter Medium aus dem Bioreaktorsystem.

Lagern Sie die Proben dann bei minus 80 Grad Celsius, bis die Elisa durchgeführt wird. Um die Anzahl der Ki67-positiven Zellkerne zu bestimmen, verwenden Sie zunächst ein inverses Mikroskop, um fünf DAPI- und fünf Ki67-Färbefluoreszenzbilder von 2D-Kulturen mit einer 20-fachen Vergrößerung jeder Bedingung aus nicht überlappenden Abschnitten der Probe zu erhalten. Um die positiven Ki67-Kerne manuell zu zählen, öffnen Sie das entstandene Bild in Fidschi und wählen Sie Plugins und Zellzähler aus, klicken Sie dann auf Initialisieren, wählen Sie einen Zählertyp aus und klicken Sie auf jeden positiven Ki67-Kern.

Die Anzahl der angeklickten Zellen wird neben dem ausgewählten Indikatortyp angezeigt. Um die Gesamtzahl der Zellkerne in den 2D-Bildern automatisch zu zählen, starten Sie den Makrorekorder, öffnen Sie ein DAPI-Bild, klicken Sie auf Bild, Typ und 8-Bit, klicken Sie dann auf Kontrast verbessern, legen Sie den Parameter "Gesättigt" auf eins fest und normalisieren Sie ihn. Um das Bild zu schärfen, stellen Sie die Unschärfemaske mit einem Radius von eins und einer Maske von 60 ein.

Um das Bild zu binden, klicken Sie auf "Automatischer Schwellenwert" und wählen Sie die Methode "Reny/Entropie" mit weißen Objekten auf schwarzem Hintergrund. Klicken Sie dann auf Plugins, gefolgt von BioVoxxel und watershed irregular feature, mit einem Erosionsradius von fünf, um die Zellen zu trennen. Klicken Sie auf Analysieren und Partikel analysieren, legen Sie die Größe auf 02 unendlich fest und aktivieren Sie Zusammenfassen.

Die Anzahl der Zellen wird in der Übersichtstabelle als Anzahl angezeigt. Klicken Sie dann auf Erstellen, um das Makro für die automatische Zählung von Zellkernen in weiteren 2D-Zellkulturbildern zu speichern. Nachdem Sie Know-Datenbanken zum Generieren eines Tumornetzwerks verwendet haben, öffnen Sie die entsprechende Netzwerkanalysesoftware, klicken Sie auf Datei und neu und geben Sie Jove-Tumormodelle ein.

Klicken Sie auf ok, um ein neues Netzwerk zu erzeugen, dann auf Quadrat Nahaufnahme Norden und ok, um den Rezeptor in einer Doppelmembran zu visualisieren. Um die Knoten als Rechtecke zu visualisieren, klicken Sie auf generisches Protein, dann auf EGFR und dann auf Ok.To beschriften Sie die Knoten im Netzwerk, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Farbe und Form zu ändern, und legen Sie die Knotenfarbcodes wie angegeben fest. Um die Ausleseparameter als Sechsecke zu visualisieren, wählen Sie aus, phänotypisieren, geben Sie proliferation ein und klicken Sie auf OK.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie erneut Farbe und Form ändern aus, um den Farbcode auf 255, 204, 204 festzulegen. Um die Kanten von Knoteninteraktionen zu visualisieren, klicken Sie auf Zustandsübergang für Aktivierungspfeile und auf Inhibition für abgestumpfte Inhibitionspfeile. Klicken Sie dann auf Datei und Speichern unter und speichern Sie das generierte Signalnetzwerk als Jove Tumor models.xml.

Für eine stationäre Analyse des Systemgleichgewichts öffnen Sie die SQUAD-Software, klicken Sie auf Netzwerk laden und laden Sie die models. xml Datei des Jupitertumors hoch. Klicken Sie auf, Analyse ausführen.

Um ein Simulationsprotokoll zu schreiben, klicken Sie auf Erweitert und dann auf Pertubator und dann auf Protokoll bearbeiten, um die Anit-EGFR-Resistenz zu simulieren. Klicken Sie anschließend auf Pertubation und wählen Sie den Standard-Anfangszustand gleich stationärem Zustand vier aus. Klicken Sie auf Hinzufügen, um den neuen konstanten Impuls hinzuzufügen, wählen Sie dann den Statusparameter aus und setzen Sie das Ziel auf FLIP, die Zeit auf Null und den Wert auf 4.

Klicken Sie auf OK und legen Sie die Zustände für c-MET und Gefitinib auf die gleiche Weise fest. Um einen Statuswert auf den aktiven EGFR-Knoten festzulegen, klicken Sie auf Aktiver Knoten und dann auf Bearbeiten. Legen Sie den Status auf 8 fest, und klicken Sie auf OK.

Klicken Sie auf OK, um das Protokoll zu speichern. Um die spezifischen Kurven anzuzeigen, wählen Sie im Optionsfeld EGF-EGFR, Stern EGF-EGFR, Stern Mek, Caspasen, PI3K, Gegitinib, Apoptose, Proliferation, MEk-Inhibitor und PI3K-Inhibitor. Klicken Sie dann auf Initialisieren und ausführen, um eine vollständige Simulation der Systemantwort zu starten.

Um eine kombinierte Behandlung mit PI3K- und Mek-Inhibitoren zu simulieren, klicken Sie auf Protokoll bearbeiten. Klicken Sie anschließend mit demselben Knotenparameter wie gerade gezeigt auf Pertubation, gefolgt von Hinzufügen, um einen neuen konstanten Impuls hinzuzufügen. Wählen Sie dann einen Statusparameter aus, setzen Sie das Ziel auf PI3K-Inhibitor, die Zeit auf Null und den Wert auf eins, und klicken Sie auf OK.

Klicken Sie erneut auf Hinzufügen, um einen weiteren neuen konstanten Impuls hinzuzufügen, und setzen Sie unter dem Parameter state das Ziel auf Mek-Inhibitor, setzen Sie die Zeit auf Null und den Wert auf eins und klicken Sie auf OK, gefolgt von erneut OK, um das Protokoll zu speichern. Klicken Sie im Optionsbereich unter Verwendung der gleichen Knoten für die grafische Darstellung wie gerade gezeigt auf Initialisieren und ausführen, um eine vollständige Simulation der Systemantwort zu starten. Um die Simulation abzuschließen, klicken Sie dann auf Zurücksetzen.

Dieses 3D-Tumortestsystem erleichtert die Bestimmung des Proliferationsindex. Und die Quantifizierung der Apoptose mit M30 Elisa. In diesem repräsentativen Experiment reagierten beispielsweise nur EGFR-mutierte HCC827-Tumorzellen, die unter statischen Kulturbedingungen inkubiert wurden, auf die Hemmung des epidermalen Wachstumsfaktors.

Durch den Tyrosin-Kinase-Inhibitor Gefitinib, wie die im Tumormodellsystem HCC827 beobachtete Zunahme der Apoptose zeigt. Hier werden repräsentative Bilder von statischen 3D-Tumormodellen mit oder ohne Epithel-Mesenchym-Übergangsinduktor, TGF-beta-1-Simulation, gezeigt. Beachten Sie die Zunahme der Vimentin-Expression in den behandelten Tumorzellkulturen.

Unter dynamischen Bedingungen übt Gefitinib eine robuste Wirkung auf EGFR-mutierte HCC827-Zellen aus, was sich in der Abnahme gewebeähnlicher Strukturen in Gegenwart des Tyrosin-Kinase-Inhibitors im Vergleich zur unbehandelten kontrollierten Kultur zeigt. In diesem Diagramm wird die Simulation des bekannten Antriebs in der Mutation, der EGFR- und c-MET-Koaktivierung sowie einer erhöhten Proliferationsrate und einer verringerten Apoptoserate in HCC827-Zellen im Laufe der Zeit beobachtet, was eine Gefitinib-induzierte Resistenz widerspiegelt, die mit der Aktivierung von MEK und PI3K korreliert. Tatsächlich führt die Modellierung der kombinierten PI3K- und MEK-Inhibitoren zu einer Umkehrung des Anti-EGFR-Resistenzeffekts, einer Verringerung der Proliferation und der Induktion von Apoptose.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blot oder durchgeführt werden, um nachgeschaltete Signalwege zu untersuchen. Darüber hinaus können Co-Kultursysteme mit verschiedenen Zelltypen auch verwendet werden, um die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zellen in der Mikroumgebung des Tumors zu analysieren. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung den Weg, die Wirksamkeit von Medikamenten in Silico zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wirksamkeit von Medikamenten in stratifizierten Patientengruppen vorhersagen können, indem Sie Signalveränderungen simulieren und die resultierenden Systemreaktionen bei verschiedenen Mutationen und Hintergründen analysieren.