Mit Micro-Computertomographie-zur Beurteilung der Tumorentwicklung und Follow-up der Reaktion auf die Behandlung in einem Maus-Modell von Lungenkrebs

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die Vorteile der Mikro-CT für die Beurteilung der Tumorentwicklung, des Ansprechens auf die Behandlung und anderer Experimente an Mäusemodellen für Lungenkrebs zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet des Lungenkrebses am Mausmodell zu beantworten, z. B. wann Tumore zu wachsen beginnen, wie schnell sie wachsen und wie sie auf therapeutische Eingriffe ansprechen. Diese Technik ermöglicht es uns, zu identifizieren, welche Tiere von unserer Studie ausgeschlossen werden sollten, während wir Veränderungen ihrer Tumorgröße in Echtzeit erkennen.

Die Technik spart Zeit und Mühe und reduziert die Anzahl der Mäuse pro Studiengruppe erheblich. Greifen Sie vom Micro-CT-Scanner aus auf die Computersteuerung zu und öffnen Sie das Softwarepaket mit dem Namen RMCT2. Starten Sie dann den Aufwärmzyklus. Bereiten Sie als Nächstes das Probenbett des Scanners für die Maus vor, indem Sie es in Plastik einwickeln.

Betäuben Sie anschließend die Maus mit Isofluran und bestätigen Sie, dass sie betäubt ist, indem Sie die Haut kneifen. Ein sanftes Kneifen einer kleinen Hautfalte genügt. Tragen Sie anschließend eine Augensalbe auf, um Hornhauttrockenheit zu verhindern.

Legen Sie nun die Maus mit der Rückenseite nach oben auf das Probenbett. Halten Sie den Kopf der Maus fest und ziehen Sie den Körper von den unteren Gliedmaßen nach unten, um den Körper symmetrisch zu dehnen und aufzurichten. Führen Sie dann das Anästhesiegas in die Kammer und positionieren Sie den Gasschlauch neben der Nase des Tieres, um ein kontinuierliches Anästhetikum zu verabreichen.

Wickeln Sie dann die Maus und das Probenbett mit Plastik ein, um die Maus an Ort und Stelle zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Maus sicher ist, da jede Bewegung oder Verdrehung während des Scans zu verschwommenen, unbrauchbaren Bildern führt. Schließen Sie nun die Kammer, stellen Sie das System auf 90 Kilovolt und 160 Mikroampere ein und stellen Sie die Scanzeit auf 4,5 Minuten ein.

Stellen Sie den Bildbereich auf 24 Millimeter ein. Legen Sie dann das System für Heartbeats in den synchronen Modus. Erstellen Sie nun einen neuen Ordner in der Datenbank für die neuen Bilder und starten Sie den Scan.

Bewegen Sie die Maus nach Abschluss des Scans zu einem leeren Käfig und beobachten Sie ihn, bis er wieder zu Bewusstsein kommt. Geben Sie es nicht an seine Mitbewohner zurück, bis es sich vollständig von der Narkose erholt hat. Öffnen Sie die seriellen Mikro-CT-Bilddateien in Bild J.Scrollen Sie durch alle Bilder jeder Maus vom Hals bis zum Bauch oder umgekehrt.

Anhand von Scans naiver Wildtyp-Mäuse kann nun die Dichte verschiedener Bereiche und normaler anatomischer Strukturen in der Brust identifiziert werden. Scrollen Sie nach oben zu den weißlichen Baucheingeweiden und dem Zwerchfell und identifizieren Sie den Bereich durch die Brust bis zum Hals. Achten Sie auf die knöchernen Orientierungspunkte des Brustkorbs, das Brustbein sowie die Wirbel und Rippen.

Identifiziere dann das Herz im vorderen Teil der Brust und die großen Blutgefäße in der Nähe des Herzens und im Mediastinum. Das Tracheallumen ist ein kleiner dunkler Kreis auf Höhe des Halses und der oberen Brust, der sich in die rechte und linke Hauptbronchie gabelt und sich dann weiter in immer kleinere Bronchien verzweigt. Beachten Sie, dass jeder Bronchus eng mit zwei oder drei Blutgefäßen verbunden ist.

Beginnen Sie nun mit der Untersuchung der Scans von nicht induzierten DT-Mäusen und identifizieren Sie das Vorhandensein von Anomalien. Mäuse mit abnormalen Lungenschatten vor der Induktion, wie Knötchen oder emphysematöse Bullae, sind von dem Versuch auszuschließen. Verwenden Sie für dieses Experiment Mäuse mit normalen Lungenscans, die FGF9-induzierte Tumore erzeugen können.

Um die Tumoren zu induzieren, geben Sie Doxycyclin in ihrem Futter mit 200 Teilen pro Million. Führen Sie nach 10 Wochen einen zweiten Mikro-CT-Scan dieser Mäuse durch, um die Entwicklung von Tumorknötchen in ihrer Lunge zu bestätigen. Teilen Sie dann die Mäuse in zwei Gruppen auf.

Verabreichen Sie den FGFR-Blocker AZD4547 über eine Magensonde an eine Gruppe. Tun Sie dies an 6 Tagen pro Woche über 10 Wochen. Geben Sie der anderen Gruppe ein Placebo.

Verfolgen Sie die Veränderungen der knotigen Schatten, indem Sie vier bis fünf Wochen nach Beginn der Behandlung einen dritten Scan durchführen. Später, am Ende der vollen 10-wöchigen Behandlung, führen Sie einen vierten Scan durch. Identifizieren Sie dann dynamische Veränderungen in den Tumorknötchen als Reaktion auf die Behandlung, indem Sie ähnliche Positionen innerhalb der seriellen Scanbilder zu den verschiedenen Zeitpunkten vergleichen.

Achten Sie auf das Erscheinen oder Verschwinden von abnormalen Schatten. Die korrekte Ausrichtung auf die gleiche anatomische Position ist entscheidend für die Interpretation der Ergebnisse. Verwenden Sie leicht identifizierbare anatomische Orientierungspunkte innerhalb des Brustkorbs, wie z. B. die Luftröhre, ihre Bifurkation, die rechte und linke Hauptbronchie, die Aorta und die großen Blutgefäße sowie das Zwerchfell.

Aufgrund der Körperneigung sind Knochen weniger nützliche Orientierungspunkte. Nachdem Sie eine Maus eingeschläfert und Zugang zu Hals und Lunge erhalten haben, schneiden Sie das Herz und die Thymusdrüse ab. Führen Sie eine Pinzette hinter die Luftröhre ein, um sie von der Speiseröhre zu trennen.

Als nächstes wird die Luftröhre mit einer G24-Kanüle kanüliert und die Kanüle durch Verknoten einer Naht um die intertracheale Spitze gesichert. Blasen Sie nun die Lunge auf und fixieren Sie sie mit eiskaltem 4%PFA über die Kanüle mit einer 25cm Säule. Nehmen Sie dann die Kanüle ab und ziehen Sie den Knoten in der Luftröhre fest, um ein Austreten von PFA zu verhindern.

Schneiden Sie nun die obere Luftröhre einschließlich ihrer Befestigung am Kehlkopf ab. Und während Sie die Luftröhre aus dem Nahtfaden ziehen, präparieren Sie die Luftröhre und die Lunge von allen Ansätzen. Entfernen Sie dann die Luftröhre mit der Lunge en blanc.

Geben Sie die Taschentücher in eine 15-ml-Tube mit 5 ml 4%PFA bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Lunge über Nacht in PFA, um eine vollständige Gewebepenetration und -fixierung zu gewährleisten. Verarbeiten Sie dann das Gewebe wie gewohnt.

Bei der Voruntersuchung von 8-12 Wochen alten DT-Mäusen für diese Studie zeigte etwa die Hälfte Lungenanomalien im Mikro-CT-Scan, was sie für die Aufnahme ungeeignet machte. Für die Studie wurde die Tumorinduktion für 10 Wochen aktiviert, gefolgt von einer Behandlung. Mäuse, die den FGFR-Inhibitor AZD4547 10 Wochen lang erhielten, zeigten ein Verschwinden oder eine Verringerung der Größe der Knötchen, die in den Scans vor der Behandlung sichtbar waren.

Auf der anderen Seite zeigten Kontrollmäuse, die Placebo erhielten, entweder keine Veränderung, eine Zunahme der Knötchengröße und/oder das Auftreten neuer Knötchen. Die histologische Endpunktuntersuchung der Lunge bestätigt die Genauigkeit der Befunde mit dem Mikro-CT-Scan. Mäuse, bei denen festgestellt wurde, dass sie tatsächlich eine klare Lunge hatten, hatten eine normale Lungenhistologie.

Mäuse, die Anomalien zeigten, zeigten verschiedene histologische Veränderungen, einschließlich Bullen und Knötchen. Nach 10-12 Wochen Induktion mit Doxycyclin wurden bei allen Tieren multiple Adenokarzinomknötchen mit unterschiedlichen Größen und Positionen beobachtet. Die anschließende Behandlung mit 10-12 Wochen mit einem FGFR-Blocker zeigte weniger und kleinere Knötchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mikro-CT zur Beurteilung der Entwicklung von Tumoren in der Lunge von Mäusen verwenden können. Und um Veränderungen an diesen Tumoren als Reaktion auf verschiedene experimentelle Verfahren zu verfolgen. Nach dem Start der Maus können Scans in weniger als 10 Minuten pro Maus durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Maus unter tiefer Narkose zu halten und sicher mit dem Probenbett zu verbinden, um Bewegungen während der Scans zu minimieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Lungenkrebses und der Krebsstammzellen, um das Ausmaß der Tumorentwicklung, der progressiven Regression und der Durchführung verschiedener Experimente zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Röntgenstrahlen gefährlich sein kann.

Bei der Ausführung dieser Prozedur sollten bei der Ausführung dieser Maschine immer Verfahren durchgeführt werden.