LC-MS-Analyse von menschlichen Blutplättchen als Plattform für ein Studium Mitochondrial Metabolism
4. April 2016
Hier zeigen wir isolierten menschlichen Blutplättchen kann als zugänglich ex vivo - Modell verwendet werden metabolische Anpassungen in Antwort auf den Komplex I Rotenon Inhibitor zu studieren. Dieser Ansatz beschäftigt Isotopenverfolgung und relative Quantifizierung durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und kann auf eine Vielzahl von Studiendesigns angewendet werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, herauszufinden, wie eine xenobiotische Behandlung oder ein Krankheitszustand den zellulären Stoffwechsel verändert. Diese Methode kann aufzeigen, wie ein Krankheitszustand oder eine applizierte Toxinwirkung den zellulären Stoffwechsel beeinflusst. Und sobald dies bekannt ist, kann unsere Methode zeigen, ob eine Art Intervention den Defekt beheben kann.
Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie nicht auf transformierten Zelllinien basiert, wodurch die Ergebnisse mit größerer Wahrscheinlichkeit direkt auf die menschliche Gesundheit übertragbar sind. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine 10 Millimolar-Stammlösung von Rotenon in Dimethylsulfoxid herstellen. Führen Sie eine serielle Verdünnung der 10 Millimolar-Rotenon-Stammlösung durch, um Lösungen mit Rotenonkonzentrationen im Bereich von einem Nanomolar bis 100 Mikromolar zu erhalten.
Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter jeder Stammlösung zu fünf Millilitern einer zuvor hergestellten angereicherten Tyrode-Pufferlösung hinzu, um Lösungen mit Rotenon-Konzentrationen im Bereich von 10 Pikomolar bis 1 Mikromolar herzustellen. Geben Sie 50 Mikroliter DMSO zu einer der Pufferlösungsproben hinzu, um eine Fahrzeugkontrolle zu erhalten. Um Thrombozyten aus Vollblut zu isolieren, zentrifugieren Sie die Vollblutproben 15 Minuten lang bei 175 × g ohne Bremsung.
Wenn fertig, überführen Sie ein Milliliter der oberen plättchenreichen Plasma-Schicht in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Achten Sie beim Überführen des plättchenreichen Plasmas darauf, die Büffelschicht nicht zu stören, damit der Plättchenpellet nicht durch Lymphozyten kontaminiert wird. Zentrifugieren Sie die Schicht mit plättchenreichem Plasma bei 400 × g für fünf Minuten.
Entfernen Sie anschließend den Überstand. Resuspendieren Sie das Thrombozyten-Pellet unter Verwendung von jeweils mindestens drei biologischen Wiederholungen pro Bedingung in einem Milliliter jeder zuvor hergestellten Rotenon-Lösung. Danach inkubieren Sie die resuspendierten Thrombozyten eine Stunde lang in einem mit Wasser beheizten Kohlendioxid-Inkubator mit 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.
Im Anschluss die Thrombozyten durch Zentrifugation der Proben bei 3000 x g für drei Minuten pelletieren. Nach dem Absaugen des Überstandes das geeignete stabile Isotop-markierte interne Standard hinzufügen. Anschließend die Thrombozyten in 750 Mikrolitern eiskalter 10 % Trichloressigsäure resuspendieren.
Sondieren Sie jede Probe 30-mal mit 0,5-Sekunden-Impulsen. Befestigen Sie nach der Zentrifugation C18-Festphasen-Extraktions-Säulen an einem Vakuummanifold. Konditionieren Sie die Säulen mit einem Milliliter Methanol.
Äquilibrieren Sie anschließend die Säulen mit einem Milliliter zweifach destilliertem Wasser. Leiten Sie das probenstammende Überstand durch die Säulen. Spülen Sie danach die Säulen mit einem Milliliter Wasser aus.
Laden Sie als Nächstes 10-Milliliter-Glaskölbchen in den Vakuummanifold, um die Elutionsfraktionen zu sammeln. Eluieren Sie die Säulen mit einem Milliliter 25 Millimolar Ammoniumacetat und Methanol. Nach dem Eindampfen des Eluats unter Stickstoffgas resuspendieren Sie die getrockneten Rückstände in 50 Mikrolitern 5%iger 5-Sulfosalicylsäure und überführen Sie die Proben in HPLC-Gefäße zur Analyse.
Wie zuvor in SH-SY5Y-Zellen berichtet, wird vermutet, dass Veränderungen der relativen Spiegel von Acyl-CoA-Thioestern als Reaktion auf Rotenon auf die Hemmung des Komplexes I zurückzuführen sind. Insbesondere zeigt sich eine dosisabhängige Abnahme von Succinyl-CoA bei gleichzeitiger Zunahme von Beta-Hydroxybutyryl-CoA, während die Acetyl-CoA-Spiegel unverändert blieben. Die Analyse von mit Rotenon behandelten menschlichen Thrombozyten ergibt äußerst konsistente Ergebnisse und liefert einen einzigartigen Datensatz experimenteller Befunde.
Es ist wichtig anzumerken, dass diese Beobachtung die mitochondriale Abhängigkeit der Reaktion auf Rotenon unterstreicht, da Thrombozyten keinen Zellkern besitzen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie metabolische Markierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie beeinflusst diese Behandlung oder Krankheitsphase die Substratnutzung? Wenn wir Veränderungen in den Konzentrationen bestimmter Metabolite feststellen, warum ändern sie sich?
Welche Schritte des Signalwegs sind betroffen und auf welche Weise? Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Thrombozyten aus Vollblut isoliert, die kontrollierte ex-vivo-Belastung durchführt und die Acetyl-CoA-Thioester für die LC-MS-Analyse extrahiert.
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Übersicht
Diese Studie zeigt die Verwendung isolierter menschlicher Thrombozyten als ex-vivo-Modell zur Untersuchung metabolischer Anpassungen als Reaktion auf den Komplex-I-Inhibitor Rotenon. Die Methode verwendet isotopische Markierung und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie zur relativen Quantifizierung und ist somit auf verschiedene Studiendesigns anwendbar.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellulärer Stoffwechsel
- Pharmakologie
- Bedeutung für die menschliche Gesundheit
Hintergrund
- Das Verständnis, wie Xenobiotika den zellulären Stoffwechsel beeinflussen, ist entscheidend.
- Isolierte humane Thrombozyten stellen im Vergleich zu transformierten Zelllinien ein aussagekräftiges Modell dar.
- Dieser Ansatz kann helfen, mögliche therapeutische Eingriffe bei Stoffwechselstörungen zu identifizieren.
- Rotenon wird als Komplex-I-Inhibitor verwendet, um metabolische Veränderungen zu untersuchen.
Zweck der Studie
- Um die Auswirkungen einer Xenobiotika-Behandlung auf den zellulären Stoffwechsel zu bestimmen.
- Um zu untersuchen, wie Krankheitszustände den Stoffwechsel verändern.
- Um das Potenzial von therapeutischen Maßnahmen zur Korrektur von Stoffwechselstörungen zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer 10 Millimolar-Stammlösung von Rotenon in Dimethylsulfoxid.
- Serielle Verdünnung der Rotenon-Stammlösung, um unterschiedliche Konzentrationen zu erhalten.
- Isotopenmarkierung für die metabolische Analyse.
- Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie zur Quantifizierung.
Hauptergebnisse
- Isolierte Thrombozyten modellieren effektiv metabolische Reaktionen auf Rotenon.
- Isotopische Markierung zeigt signifikante metabolische Anpassungen auf.
- Die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie ermöglicht eine genaue Quantifizierung.
- Die Methode ist auf verschiedene experimentelle Designs anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Isolierte humane Thrombozyten sind ein wertvolles Modell, um den Stoffwechsel zu untersuchen.
- Dieser Ansatz kann zu Erkenntnissen über Krankheitsmechanismen und mögliche Therapien führen.
- Zukünftige Studien können diese Methode erweitern, um andere Stoffwechselwege zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Menschliche Thrombozyten bieten ein klinisch relevantes, nicht transformiertes Modell zur Untersuchung des mitochondrialen Stoffwechsels und der Wirkung xenobiotischer Substanzen und beheben so die Einschränkungen von Tumorzelllinien in der Stoffwechselforschung. Diese Plattform ermöglicht reproduzierbare, donor-spezifische Analysen von Veränderungen in Stoffwechselwegen und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen sowie die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsforschung. Die Skalierbarkeit durch die Beschaffung von Blutbanken fördert die translationale Kontinuität von der Grundlagenforschung bis hin zu präklinischen und klinischen Studien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Untersuchung der mitochondrialen Reaktionen auf Komplex-I-Inhibitoren wie Rotenon.
- Operativer Wert: Bietet ein für den Menschen relevantes System, das störende Variablen durch metabolische Umprogrammierung in transformierten Zelllinien verringert.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch die zuverlässige Detektion kompensatorischer metabolischer Verschiebungen, wie beispielsweise der erhöhten Fettsäureoxidation bei Hemmung der Glykolyse.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative LC-MS-Signale von Acyl-CoA-Thioestern und ermöglicht die relative Quantifizierung sowie isotopische Markierung zur bewertenden Analyse spezifischer Stoffwechselwege.
- Operativer Wert: Liefert reproduzierbare Metabolitprofile über biologische Wiederholungen hinweg und unterstützt die Standardisierung von Assays für Xenobiotika-Screening-Kampagnen.
- Skalierbarkeit: Die Thrombozytenisolierung von einzelnen Spendern oder Blutbanken erlaubt eine skalierbare Herstellung metabolisch aktiver Proben für High-Content-Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet ex vivo Thrombozytenantworten mit in vivo metabolischen Anpassungen und unterstützt biomarkerbasierte präklinische Validierung.
- Mechanistische Entlastung: Klärt, ob beobachtete Stoffwechselveränderungen mitochondrienabhängig sind, wie durch Antworten in kernlosen Thrombozyten belegt.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Bewertung der Wirksamkeit von Interventionen bei der Umkehrung metabolischer Defekte und unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen in der Leitstrukturoptimierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung ein, insbesondere für mitochondriale Zielstrukturen aufweisende Verbindungen und metabolische Modulatoren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung xenobiotischer Wirkungen auf den zellulären Stoffwechsel, indem die thrombozytenbedingten Reaktionen auf dosisabhängige Rotenon-Behandlung isoliert werden.
- Screening: Ermöglicht die vorbereitete Aufarbeitung von Thrombozyten für die LC-MS-Analyse und liefert reproduzierbare quantitative Ergebnisse für das Screening von Substanzbibliotheken.
- Analytik: Ermöglicht die relative Quantifizierung von Acetyl-CoA, Succinyl-CoA und Beta-Hydroxybutyryl-CoA-Thioestern und damit den Vergleich des metabolischen Flusses unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Kontinuität, indem metabolische Anpassungen modelliert werden, die für Krankheitszustände und therapeutische Interventionen relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten Workflow zur Isolierung von Thrombozyten und Extraktion von Metaboliten, der auf mehrere Projekte und therapeutische Bereiche übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem ein physiologisch relevanter humaner Modellansatz verwendet wird, der Artefakte von Krebszelllinien vermeidet.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Protokolle zur Thrombozytenisolierung, ex-vivo-Belastung und Metabolit-Extraktion.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitaleffizienz, indem eine frühzeitige Erkennung metabolischer Schwachstellen ermöglicht wird und dadurch die Ausscheidung in späteren Entwicklungsstadien aufgrund unvorhergesehener mitochondrialer Toxizität verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf deren Auswirkungen auf zentrale Stoffwechselwege in einem für den Menschen relevanten System.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Thrombozytenisolation, sterilen Zellhandhabung und LC-MS/MS-Metabolomik.
- Setzt den Zugang zu Zentrifugiergeräten, Vakuummanifolds für die Festphasenextraktion und HPLC-MS-Systemen voraus.
- Erfordert eine Standardisierung der Vorbereitung von thrombozytenreichem Plasma sowie der Rotenon-Dosierung über verschiedene Labore und Spender hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für unterschiedliche Xenobiotika und isotopische Markierungsschemata.
- Ist durch die Lebensfähigkeit von Thrombozyten ex vivo sowie die Notwendigkeit einer sofortigen Verarbeitung nach der Isolation zur Aufrechterhaltung der metabolischen Integrität begrenzt.
