LC-MS-Analyse von menschlichen Blutplättchen als Plattform für ein Studium Mitochondrial Metabolism
4. April 2016
Hier zeigen wir isolierten menschlichen Blutplättchen kann als zugänglich ex vivo - Modell verwendet werden metabolische Anpassungen in Antwort auf den Komplex I Rotenon Inhibitor zu studieren. Dieser Ansatz beschäftigt Isotopenverfolgung und relative Quantifizierung durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und kann auf eine Vielzahl von Studiendesigns angewendet werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, herauszufinden, wie entweder eine xenobiotische Behandlung oder ein Krankheitszustand den Zellstoffwechsel verändert. Diese Methode hat das Potenzial, aufzudecken, wie sich ein Krankheitszustand oder ein appliziertes Toxin auf den Zellstoffwechsel auswirkt. Und sobald dies bekannt ist, kann unsere Methode aufzeigen, ob der Defekt durch irgendeine Art von Intervention behoben werden kann.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht auf transformierten Zelllinien beruht, so dass es wahrscheinlicher ist, dass sie Antworten liefert, die für die menschliche Gesundheit direkt relevant sind. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine 10 millimolare Stammlösung von Rotenon in Dimethylsulfoxid vor. Führen Sie eine serielle Verdünnung der 10 millimolaren Rotenon-Stammlösung durch, um Lösungen mit Rotenonkonzentrationen von einem Nanomolar bis 100 Mikromolar zu erhalten.
Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter jeder Stammlösung zu fünf Millilitern einer zuvor hergestellten angereicherten Tyrode-Pufferlösung hinzu, um Lösungen mit Rotenonkonzentrationen im Bereich von 10 Picomolare bis zu einem Mikromolaren herzustellen. Geben Sie 50 Mikroliter DMSO zu einer der Proben der Pufferlösung, die als Fahrzeugkontrolle dient. Um Blutplättchen aus Vollblut zu isolieren, zentrifugieren Sie Vollblutproben bei 175 x g für 15 Minuten ohne Pausen.
Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie einen Milliliter der oberen plättchenreichen Plasmaschicht in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Achten Sie beim Transfer des plättchenreichen Plasmas darauf, den Buffy Coat nicht zu stören, damit das Thrombozytenpellet nicht durch Lymphozyten verunreinigt wird. Zentrifugieren Sie die plättchenreiche Plasmaschicht bei 400 x g für fünf Minuten.
Aspiriere dann den Überstand. Unter Verwendung von nicht weniger als drei biologischen Replikaten für jede Bedingung resuspendieren Sie das Thrombozytenpellet in einem Milliliter jeder zuvor hergestellten Rotenonlösung. Inkubieren Sie anschließend die resuspendierten Blutplättchen in einem wasserummantelten Kohlendioxid-Inkubator, der auf 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius eingestellt ist.
Zu diesem Zeitpunkt pelletieren Sie die Blutplättchen, indem Sie die Proben drei Minuten lang bei 3000 x g zentrifugieren. Nach dem Aspirieren des Überstands wird der entsprechende mit stabilen Isotopen markierte interne Standard hinzugefügt. Dann resuspendieren Sie die Blutplättchen in 750 Mikrolitern eiskalter 10%iger Trichloressigsäure.
Pulsbeschallung jeder Probe 30 Mal mit 0,5-Sekunden-Impulsen. Nach der Zentrifugation sind die C18-Festphasenextraktionssäulen an einem Vakuumverteiler anzubringen. Konditionieren Sie die Säulen mit einem Milliliter Methanol.
Dann äquilibrieren Sie die Säulen mit einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser. Führen Sie den von der Stichprobe abgeleiteten Überknoten durch die Spalten aus. Wenn Sie fertig sind, waschen Sie die Säulen mit einem Milliliter Wasser.
Laden Sie anschließend 10-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen in den Vakuumverteiler, um die Elutionsfraktionen zu sammeln. Eluieren Sie die Säulen mit einem Milliliter 25 Millimolar Ammoniumacetat und Methanol. Nach dem Trocknen des Eluats unter Stickstoffgas werden die getrockneten Rückstände in 50 Mikrolitern 5%5-Sulfosalicyclsäure resuspendiert und die Proben zur Analyse in HPLC-Dateien überführt.
Wie bereits in SH-SY5Y-Zellen berichtet, wird angenommen, dass Veränderungen der relativen Spiegel von Aceyl-CoA-Thioestern als Reaktion auf Rotenon auf die Hemmung von Komplex eins zurückzuführen sind. Insbesondere gibt es eine dosisabhängige Abnahme von Succinyl-CoA bei gleichzeitigem Anstieg von Beta-Hydroxybutyryl-CoA, während die Acetyl-CoA-Spiegel unverändert blieben. Die Analyse von mit Rotenon behandelten menschlichen Blutplättchen liefert sehr konsistente Ergebnisse und liefert einen einzigartigen Satz experimenteller Daten.
Es ist wichtig zu beachten, dass diese Beobachtung die mitochondriale Abhängigkeit der Reaktion auf Rotenon unterstreicht, da Blutplättchen Kerne fehlen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die metabolische Nachverfolgung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B.: Wie wirkt sich dieser Behandlungs- oder Krankheitszustand auf die Substratverwertung aus? Wenn wir Veränderungen in den Spiegeln eines Metaboliten feststellen, warum ändert sich das?
Welche Schritte auf dem Weg sind betroffen und auf welche Weise? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Blutplättchen aus Vollblut isoliert, die kontrollierte Ex-vivo-Herausforderung durchführt und die Aceyl-CoA-Thioester für die LCMS-Analyse extrahiert
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Übersicht
Diese Studie demonstriert die Verwendung isolierter menschlicher Thrombozyten als ex vivo Modell zur Untersuchung metabolischer Anpassungen als Reaktion auf den Komplex-I-Inhibitor Rotenon. Die Methode verwendet isotopenbasiertes Tracing und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie für die relative Quantifizierung, was sie für verschiedene Studiendesigns anwendbar macht.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellulärer Stoffwechsel
- Pharmakologie
- Relevanz für die menschliche Gesundheit
Hintergrund
- Das Verständnis, wie Xenobiotika den zellulären Stoffwechsel beeinflussen, ist entscheidend.
- Isolierte menschliche Thrombozyten bieten ein relevantes Modell im Vergleich zu transformierten Zelllinien.
- Dieser Ansatz kann helfen, potenzielle Interventionen für metabolische Defekte zu identifizieren.
- Rotenon wird als Komplex-I-Inhibitor verwendet, um metabolische Veränderungen zu untersuchen.
Ziel der Studie
- Die Auswirkungen der Behandlung mit Xenobiotika auf den zellulären Stoffwechsel zu bestimmen.
- Zu untersuchen, wie Krankheitszustände metabolische Prozesse verändern.
- Das Potenzial von Interventionen zur Korrektur metabolischer Defekte zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer 10-Millimolaren Stammlösung von Rotenon in Dimethylsulfoxid.
- Serielle Verdünnung der Rotenon-Stammlösung, um verschiedene Konzentrationen zu erhalten.
- Isotopenbasiertes Tracing für die metabolische Analyse.
- Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie für die Quantifizierung.
Hauptergebnisse
- Isolierte Thrombozyten modellieren effektiv metabolische Reaktionen auf Rotenon.
- Isotopenbasiertes Tracing zeigt signifikante metabolische Anpassungen.
- Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie liefert genaue Quantifizierung.
- Die Methode ist auf verschiedene experimentelle Designs anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Isolierte menschliche Thrombozyten sind ein wertvolles Modell zur Untersuchung des Stoffwechsels.
- Dieser Ansatz kann zu Erkenntnissen über Krankheitsmechanismen und potenzielle Therapien führen.
- Zukünftige Studien können diese Methode erweitern, um andere metabolische Wege zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Human platelets offer a clinically relevant, non-transformed model for studying mitochondrial metabolism and xenobiotic effects, addressing limitations of cancer cell lines in metabolic research. This platform enables reproducible, donor-specific analysis of metabolic pathway alterations, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Scalability via blood bank sourcing facilitates translational continuity from basic discovery to preclinical and clinical studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by probing mitochondrial responses to complex I inhibitors like rotenone.
- Operational Value: Provides a human-relevant system that reduces confounding variables from metabolic reprogramming in transformed cell lines.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through consistent detection of compensatory metabolic shifts, such as increased fatty acid oxidation upon glycolysis inhibition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative LC-MS readouts of acyl-CoA thioesters, enabling relative quantification and isotopic labeling for pathway-specific activity assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible metabolite profiles across biological replicates, supporting assay standardization for xenobiotic screening campaigns.
- Scalability: Platelet isolation from individual donors or blood banks allows scalable production of metabolically active samples for high-content screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects ex vivo platelet responses to in vivo metabolic adaptations, supporting biomarker-aligned preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed metabolic changes are mitochondria-dependent, as evidenced by responses in anucleate platelets.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of intervention efficacy in reversing metabolic defects, informing go/no-go decisions in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for mitochondrial-targeted compounds and metabolic modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of xenobiotic effects on cellular metabolism by isolating platelet responses to dose-dependent rotenone treatment.
- Screening: Enables assay-ready preparation of platelets for LC-MS analysis, yielding reproducible quantitative outputs for compound library screening.
- Analytics: Provides relative quantification of acetyl-CoA, succinyl-CoA, and beta-hydroxybutyryl-CoA thioesters, enabling comparison of metabolic flux across conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by modeling metabolic adaptations relevant to disease states and therapeutic interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platelet isolation and metabolite extraction workflow applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by using a physiologically relevant human model that avoids cancer cell line artifacts.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized platelet isolation, ex vivo challenge, and metabolite extraction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of metabolic liabilities, reducing late-stage attrition due to unforeseen mitochondrial toxicity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on core metabolic pathways in a human-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in platelet isolation, sterile cell handling, and LC-MS/MS metabolomics.
- Dependent on access to centrifugation equipment, vacuum manifolds for solid-phase extraction, and HPLC-MS systems.
- Necessitates standardization of platelet-rich plasma preparation and rotenone dosing across laboratories and donors.
- Involves adaptation considerations for different xenobiotics and isotopic labeling schemes.
- Limited by platelet viability ex vivo and the need for immediate processing post-isolation to maintain metabolic integrity.
