Name: Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Lernen Sie eine kompakte Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet-Mikrofluidik mit optischen Fasern. Diese kostengünstige Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screening und die Untersuchung seltener Phänotypen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die DARPA-Fördernummer 84389.01.44908, einen NSF CAREER Award (DBI-1253293), einen NIH explorative/developmental research grant (CA195709) und NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01) sowie einen New Directions Grant aus dem UCSF Resource Allocation Program.

1. SU8 Meister Fabrication <ol><li> Entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen für drei Schichtherstellungs Design-Software verwenden und die Entwürfe von einem Lieferanten auf der Leiterplatte Folie gedruckt mit 10 &amp; mgr; m Auflösung. Die Details der Gerätedesign sind in einem angeschlossenen Referenz 6 und die Kanalgeometrien sind in Abbildung 1 gezeigt , gegeben. Die Schichten sollten Ausrichtungsmarken sind auf Merkmale 8 von jeder Herstellungsschicht helfen collocate. </li><li> Legen Sie eine vorgereinigte 3 Zoll Durchmesser Silizium-Wafer auf einem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 Sekunden bei 1.750 Umdrehungen pro Minute, mit einer Schichtdicke von 80 &amp; mgr; m bereitstellt. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt weitergehen. </li><li> Setzen Sie die beschichtete Wafer auf der 1. Schicht Maske unter einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung Stellen Sie den Wafer auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 sec bei 5000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 40 um liefert. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen. </li><li> Richten Sie die 2. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 4 min 30 sec, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30sec bei 1000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 100 um bereitstellt. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen. </li><li> Richten Sie die 3. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 9 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Entwickeln der Masken durch in ein gerührtes Bad aus Propylenglykolmonomethylether-acetat während 30 min eingetaucht wird. Waschen Sie die Wafer in Isopropanol und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min. Platzieren Sie den entwickelten Master in einer 100 mm Petrischale für Polydimethylsiloxan (PDMS) Formen. </li></ol> 2. PDMS Gerätefertigung <ol><li> Bereiten Sie 10: 1 PDMS von 50 g Silikonbasis kombiniert mit 5 g Mittel in einem Plastikbecher zu heilen. Mischen Sie den Inhalt mit einem Drehwerkzeug mit einem Rührstab ausgestattet. Degals Gemisch in einem Exsikkator für 30 Minuten, oder bis alle Luftblasen entfernt werden. </li><li> Gießen Sie die PDMS mit einer Dicke von 3 mm über dem Master zu geben und zurück in den Exsikkator zur weiteren Entgasung. Sobald alle Blasen entfernt werden, backen das Gerät bei 80 ° C für 80 min. </li><li> Schneiden Sie das Gerät aus der Form mit einem Skalpell und auf eine saubere Oberfläche mit der strukturierten Seite nach oben und Punsch die fluidische und -auslässe mit einer 0,75 mm Biopsie Stempel verwenden. Das Gerät ist so geschnitten werden, dass die 120 &amp; mgr; m und 220 &amp; mgr; m groß Geometrien von der Seite der Vorrichtung zugänglich sind. </li><li> Plasma behandeln Sie das Gerät, mit Feature - Seite nach oben, zusammen mit einer vorgereinigte 2 Zoll von 3 Zoll Glasträger bei 1 mbar O 2 Plasma für 20 Sekunden in einem 300 W Plasma - Reiniger. Bond, die PDMS-Gerät von der strukturierten Seite der PDMS Vorrichtung auf die plasmabehandelte Seite der Glasobjektträger platziert. Stellen Sie das Gerät in einem 80 ° C Ofen und backen Sie die zusammengebauten Vorrichtung für 40 min. </li><li> Machen Sie die Kanälehydrophob durch eine Spritze unter Verwendung der Vorrichtung mit einer fluorierten Oberflächenbehandlungsfluid zu spülen. Unmittelbar backen das Gerät bei 80 ° C für 10 min, das Lösungsmittel zu verdampfen. </li></ol> 3. Herstellung von optischen Komponenten <ol><li> Bereiten Sie die Laseranregung Faser, die durch die Isolierung von der letzten 5 mm von einer 105 &amp; mgr; m-Kern, 125 um Mantel zu entfernen, NA = 0,22 optischen Faser. </li><li> Bereiten Sie die 2. Farbe Laseranregung Faser um 3,1 für eine 2. identische Faser zu wiederholen. </li><li> Bereiten Sie die Faser zum Sammeln des Fluoreszenzsignals von 3,1 für einen 200 &amp; mgr; m-Kern, 225 &amp; mgr; m Mantel wiederholen, NA = 0,39 optische Faser. </li><li> Überprüfen Sie die Spitzen aller Fasern - wenn die Spitzen in einer flachen Oberfläche nicht zu Ende, wieder spalten die Enden mit einem Faserschreiber. </li><li> Bringen Sie einen Laser-Faserkoppler mit einem 50 mW, 405 nm Laser und befestigen Sie eine der 105 &amp; mgr; m Kernfasern an den Laser. Richten Sie das abisolierte Ende am Sensor der LaserleistungMeter, und die Feinjustierung des Lasers Koppler verwenden, um die Laserleistung zu maximieren. </li><li> Wiederholen 3.5 für eine 50 mW, 473 nm-Laser. </li><li> Montieren Sie einen 446/510/581/703 nm Quad-Bandpassfilter auf der PMT Linse Röhren mit Laserlicht zu blockieren und emittiert Fluoreszenz übertragen. Bringen Sie Faserkoppler, so dass Licht den Filter durchläuft, bevor die PMT zu schlagen. </li><li> Bringen Sie die Faser von 3,3 auf der montierten Einheit in 3.7. </li></ol> 4. Offline-Mischemulsion-Generation <ol><li> Besorgen Sie sich einen Strömungs Fokus Mikrofluidik dropmaker Gerät mit einem 60 &amp; mgr; m × 60 &amp; mgr; m Öffnung. </li><li> Füllen Sie eine 1 - ml - Spritze mit HFE 7500 Ölen mit 2% ionisches Fluortensid 9. </li><li> Füllen einer Reihe von 1 ml Spritzen mit den folgenden Kombinationen von Fluorescein (FITC) und Dextran-konjugiertes blaue Farbstoffe (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB und 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> Montieren Sie die dropmaker Gerät auf der Bühne eines invertierten Microsbewältigen und die wässrigen und Öl Spritzen auf Spritzenpumpen. Paar die Spritzen an die Geräte PE-2 Schläuche verwenden. </li><li> Laufspritzenpumpen bei 500 &amp; mgr; l / h für die Öl- und 250 &amp; mgr; l / h für die wässrigen Lösungen, erstellen einer Mischung aus 80 &amp; mgr; m-Tröpfchen, die Lösungen von 4,3 enthält. Für jede Art von wässrigen Probe, mit einem frischen dropmaker Gerät eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Sammeln Sie ~ 200 &amp; mgr; l Emulsion aus jeder Farbstoffkombination in eine leere Spritze. </li><li> Nachdem die vier Tröpfchen Typen haben in einer einzigen Sammlung Spritze, mischen die Emulsion durch mehrmaliges Drehen der Spritze gesammelt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,6 mit wässrigen Lösungen, die 0,1, 1, 10 und 100 nM FITC in PBS. </li></ol> 5. Optical Fiber Insertion <ol><li> Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip hergestellt in Schritt 2 auf der Stufe eines inversen Mikroskops gekoppelt mit einer digitalen Kamera in der Lage von &lt;100 &amp; mgr; s Verschlusszeiten. </li><li> Arbeiten sorgfältig von der Seite, insert die Faser mit dem 473-nm-Laser in die am weitesten vorgelagerten 120 &amp; mgr; m Kanal gekoppelt, dabei nicht bis zur Hauptströmungskanal zu durchstechen. </li><li> Legen Sie die Faser mit dem 405-nm-Laser in die am weitesten stromabwärts 120 &amp; mgr; m hohen Seitenkanal und bietet Faserabstand von 300 &amp; mgr; m. </li><li> Legen Sie die PMT-gekoppelten Faser in den 220 &amp; mgr; m groß Kanal senkrecht zu den beiden Laseranregungsfasern. </li></ol> 6. Fluoreszenzdetektion von gemischten Emulsionen <ol><li> Halterung eine 5 ml Spritze mit HFE 7500 mit 2% ionisches Fluortensid mit dem Spacer Öleinlaß der Detektionseinrichtung mit PE-2 Schlauch gefüllt. </li><li> Montieren Sie die Spritze mit dem gemischten FITC / CB-Emulsion auf einem vertikal ausgerichteten Spritzenpumpe und koppeln an das Gerät des Tröpfchens reinjection Einlass mit PE-2 Schläuche enthalten. Schließen Sie eine Länge von PE-2 Schlauch aus dem Gerät Ausgang in einen Abfallbehälter. </li><li> Prime das Gerät von jeder der Pumpen bei 1000 &amp; mgr; l / h, bis beide LaufÖl und Tröpfchen werden zu sehen regelmäßig in dem Gerät und fließt stromabwärts kombiniert werden. </li><li> Stellen Sie die Durchflussraten, so dass das Abstands Öl läuft bei 6.000 &amp; mgr; l / h und die Tröpfchen bei 100 &amp; mgr; l / h und bietet erhebliche Abstand zwischen den Tröpfchen durch den Detektionsbereich reisen. </li><li> Schalten Sie den Laser, das Datenerfassungsprogramm zu starten, und stellen Sie die PMT-Verstärkung um Signale zu liefern, die mehr sind als das Grundrauschen Boden 100x. Stellen Sie die Laserleistung so, dass alle der Dublett Peaks auf einem einzelnen, linear skaliert Timetrace deutlich sichtbar sind. </li><li> Erwerben Sie 60 Sekunden der PMT-Spannung Timetrace bei mindestens 20 kHz. Importieren Sie die Daten in Rechenprogramm wie Matlab und messen die Höhen der Spitzen der aufgenommenen Dubletten das benutzerdefinierte Berechnungsprogramm Skript. Hinweis: Dies wird als zusätzliche Information zur Verfügung gestellt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,2-6,7 die FITC-nur gemischte Emulsion in 4.7 erstellt wurden, mit der 405-nm-Laser ausgeschaltet. </li></ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
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<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

LWL-Erkennung erfordert die Ausrichtung der optischen Fasern in Bezug auf Fluidkanäle. Da unser Gerät Führungskanäle hergestellt mit mehrschichtigen Photolithographie verwendet, die Platzierung von Masken in Bezug zueinander ist von großer Bedeutung. Wenn die Faserleitkanäle zu nahe an der Fluidkanal sind, gibt es ein Potential für eine Fluidleckage; wenn die Führungskanäle zu weit entfernt oder falsch ausgerichtet angeordnet sind, kann das Fluoreszenzsignal von der Detektionsfaser gesammelt werden deutlich vermindert. ...

Tröpfchen Mikrofluidik eine Plattform für einen hohen Durchsatz biology von 1 in einem Trägeröl suspendiert Experimente in einer Vielzahl von wässrigen Tröpfchen Kompartimentierung. Droplets sind für Anwendungen als Einzelzellanalyse 2, digitale Polymerase - Kettenreaktion (PCR) 3, wie variiert verwendet worden und Enzym Evolution 4. Fluoreszierende Assays sind die Standard-Erfassungsmodus für Tröpfchen Mikrofluidik, als ihre helle Signale und schnelle Zeitverhalten kompatibel sind mit Sub-Nanoliter Tropfenvolumen bei Kilohertz Raten zu erfassen. Viele Anwendungen erfordern Fluoreszenzdetektion, um gleichzeitig mindestens zwei Farben. Zum Beispiel unserem Labor führt häufig Tröpfchensortierexperimente-PCR aktiviert , die ein Detektionskanal für das Ergebnis eines Assays zu verwenden, und verwendet eine Sekundärhintergrundfarbstoff Assay negative Tröpfchen zählbaren 5 zu machen. Typische Nachweisstationen für Tröpfchen Mikrofluidik sind based auf Epifluoreszenz- Mikroskope und erfordern Licht Manipulationen Systeme kompliziert Anregungslicht von freien Raum Laser in Mikroskop eingeführt werden, die Probe fokussiert werden. Nach Fluoreszenz von einem Tröpfchen abgegeben wird, wird das emittierte fluoreszierte Licht gefiltert, so daß jeder Detektionskanal eine Photovervielfacherröhre (PMT) auf einem Wellenlängenband zentriert verwendet. Epifluoreszenzmikroskop basierte optische Detektionssysteme bieten eine Zutrittsschranke aufgrund ihrer Kosten, die Komplexität und die erforderliche Wartung. Optische Fasern liefern die Mittel eine vereinfachte und robuste Detektionsschema zu konstruieren, da Fasern manuell in mikrofluidischen Vorrichtungen eingesetzt werden, wodurch die Notwendigkeit für spiegelbasierte Lichtführung zu entfernen und so dass Lichtwege unter Verwendung von Lichtwellenleiterverbindern angeschlossen zu werden. In diesem Dokument beschreiben wir die Montage und Validierung eines kompakten und modularen Schema Mehrfarbenfluoreszenzdetektion durchzuführen, indem eine Anordnung von optischen Fasern eine Verwendungda einzelne Photodetektor 6. Lichtleitfasern sind mit individuellen Lasern und eingesetzt sind senkrecht zu einer L-förmigen Strömungskanal in regelmäßigen räumlichen Offsets. Ein Fluoreszenzsammelfaser wird an die Anregungsbereiche parallel orientiert und an einem einzigen PMT verbunden. Weil ein Tröpfchen zu unterschiedlichen Zeiten den Laserstrahlen durchläuft, durch den PMT aufgezeichneten Daten zeigt einen zeitlichen Versatz, dass der Benutzer zwischen der emittierten Fluoreszenz zu unterscheiden erlaubt, nachdem die Tröpfchen durch jede einzelne Laserstrahl angeregt wird. Diese zeitliche Verschiebung eliminiert die Notwendigkeit emittierte Licht zu trennen PMTs zu trennen, um eine Reihe von dichroitische Spiegel und Bandpassfilter verwendet wird. Um die Wirksamkeit des Detektors zu validieren, zu quantifizieren wir Fluoreszenz in Tröpfchenpopulationen Farbstoffe unterschiedlicher Farbe und Konzentration einkapselt. Die Empfindlichkeit des Systems wird für einfarbige Fluorescein Detektion untersucht und zeigt die Fähigkeit Tröpfchen mit Konzentrationen zu detektieren bis zu 0,1 nm, eine 200x Empfindlichkeit improvement im Vergleich zu bisherigen Vorgehensweisen auf Faserbasis 7 in der Literatur berichtet.

<table><tbody><tr><td>Fotomasken</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" Siliziumwafer, P-Typ, reine Testqualität</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritzen</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>10 ml Spritzen</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 Gaugue Nadeln</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 Polyethylen-Schlauch</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Allgemein bekannt als HFE 7500</td></tr><tr><td>Ionic Krytox Anleitung zur Synthese von Tensiden</td><td></td><td></td><td>in Ref #10</td></tr><tr><td>Dextran-konjugierter Kaskadenblau-Farbstoff</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Quad-Bandpassfilter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Glasfaseranschluss</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>Objektivrohr</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Patchkabel mit 200 &#956; M Kern / 225 &#956; m Ummantelung von Glasfaser mit einem abisolierten Ende und einem FC/PC-Stecker</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Patchkabel mit 105 &#956; M-Kern / 125 &#956; m Ummantelung von Glasfasern mit einem abisolierten Ende und einem FC/PC-Stecker</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956; m Abisolierwerkzeug</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956; m Faserabisolierwerkzeug</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>Laser Faseradapter</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC Adapter</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW Laser bei 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Verteiler für CNI Laser</td></tr><tr><td>473 nm CW Laser bei 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

mehrfarbenfluoreszenzdetektion für droplet mikrofluidik verwendung von optical fibers

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluoreszenz-Assays sind aufgrund ihrer hellen Signale und ihrer schnellen Zeitreaktion die gebräuchlichsten Messwerte, die in der Tröpfchen-Mikrofluidik verwendet werden. Anwendungen wie Multiplex-Assays, Enzymevolution und Molekularbiologie Verbesserte Zellsortierung erfordern den Nachweis von zwei oder mehr Fluoreszenzfarben. Standardmäßige Mehrfarben-Detektionssysteme, die Freiraumlaser an Epifluoreszenzmikroskope koppeln, sind sperrig, teuer und schwer zu warten. In diesem Artikel beschreiben wir ein Schema zur Durchführung einer Mehrfarbendetektion durch Anregung diskreter Bereiche eines mikrofluidischen Kanals mit Lasern, die an optische Fasern gekoppelt sind. Das emittierte Licht wird von einer optischen Faser gesammelt, die mit einem einzelnen Photodetektor gekoppelt ist. Da die Anregung an unterschiedlichen räumlichen Orten stattfindet, kann die Identität des emittierten Lichts als zeitliche Verschiebung kodiert werden, wodurch kompliziertere Lichtfilterschemata überflüssig werden. Das System wurde zum Nachweis von Tröpfchenpopulationen mit vier einzigartigen Farbstoffkombinationen und zum Nachweis von sub-nanomolaren Fluorescein-Konzentrationen eingesetzt.

Herstellung eines PDMS - Gerät , das für das Einsetzen von optischen Fasern ermöglicht , erfordert ein mehrstufiges photolithographischen Verfahren zu schaffen Kanäle unterschiedlicher Höhe (Abbildung 1). Zuerst wird eine 80 um hohe Schicht aus SU-8 wird auf einen Siliziumwafer versponnen und strukturiert, um eine Maske mit dem Fluidhandhabungs Geometrie zu schaffen. Als nächstes wird eine weitere 40 &amp; mgr; m Schicht aus SU-8 auf den Wafer gesponnen und strukturiert,...

Mehrfarbige Fluoreszenzdetektion in der Tröpfchenmikrofluidik beinhaltet typischerweise sperrige und komplexe Epifluoreszenzmikroskop-basierte Detektionssysteme. Hier beschreiben wir ein kompaktes und modulares mehrfarbiges Detektionsschema, das ein Array von optischen Fasern verwendet, um mehrfarbige Daten, die von einem einzigen Photodetektor gesammelt wurden, zeitlich zu kodieren.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache Anwendung der Fluoreszenzdetektion in der Tropfenmikrofluidik unter Verwendung von optischen Fasern zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Hochdurchsatz-Biologischen-Screening zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung seltener Phänotypen und die gezielte Evolution von Enzymen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache und kostengünstige Anwendung der Fluoreszenzdetektion in der Tropfenmikrofluidik ermöglicht.Platzieren Sie zunächst eine vorgereinigte Siliziumscheibe mit einem Durchmesser von drei Zoll auf der Vakuumspannvorrichtung eines Spin-Coaters. Geben Sie dann einen Milliliter SU-8 3050 in die Mitte der Scheibe und drehen Sie die Scheibe, um eine 80 Mikrometer dicke Schicht aus Fotolack zu erzeugen. Entnehmen Sie die beschichtete Scheibe aus dem Spin-Coater und stellen Sie sie auf eine auf 135 Grad Celsius vorgeheizte Heizplatte.Nach 30 Minuten die Wafer entfernen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Anschließend die Wafer auf eine ebene Fläche legen und die Maskierung der ersten Schicht auf der Wafer ausrichten. Die Wafer drei Minuten lang einer kollimierten 190 Milliwatt, 365 Nanometer LED aussetzen.Nach der Belichtung das Wafer auf eine Heizplatte mit 135 Grad Celsius für eine Minute legen und anschließend wieder auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Wenn es abgekühlt ist, das Wafer erneut auf den Spin-Beschichter setzen und auf dem Chuck befestigen. Einen zusätzlichen Milliliter SU-8 3050 in die Mitte des Wafers geben und 20 Sekunden lang mit 500 U/min schleudern.anschließend 30 Sekunden bei 5.000 min⁻¹. Danach das Wafer auf einer Heizplatte aushärten lassen. Es auf Raumtemperatur abkühlen lassen und anschließend wieder auf die Maskenausrichtfläche stellen.Verwenden Sie das Stereomikroskop, um die Maske der zweiten Schicht manuell mit den strukturierten Ausrichtungsmarkierungen auf dem Wafer auszurichten. Sobald die Ausrichtung korrekt ist, belichten Sie den beschichteten Wafer unter denselben Bedingungen wie zuvor für 4-1/2 Minuten. Nach der Belichtung platzieren Sie den Wafer eine Minute lang auf einer Heizplatte bei 135 Grad Celsius, kühlen ihn anschließend ab und befestigen ihn erneut am Spin-Beschichter.Tragen Sie ein Milliliter SU-8 3050 ein drittes Mal auf das Wafer auf und schleudern Sie es, um weitere 100 Mikrometer Fotolack hinzuzufügen. Entfernen Sie das Wafer und backen Sie es 30 Minuten lang auf einer Heizplatte bei 135 Grad Celsius. Kühlen Sie es anschließend auf Raumtemperatur ab und legen Sie es auf die Ausrichtfläche.Richten Sie die Maskierung der dritten Schicht an der vorherigen Geometrie aus und belichten Sie die beschichtete Wafer unter den vorherigen Bedingungen für neun Minuten. Stellen Sie den Wafer nach der Belichtung für eine Minute auf eine Heizplatte mit 135 Grad Celsius und kühlen Sie ihn anschließend auf Raumtemperatur ab. Entwickeln Sie die Masken, sobald der Wafer abgekühlt ist, indem Sie den Wafer 30 Minuten lang in ein gerührtes Entwicklerbad eintauchen.Spülen Sie die Wafer abschließend in Isopropanol und backen Sie sie ein letztes Mal eine Minute lang auf einer Heizplatte bei 135 Grad Celsius. Bewahren Sie den hergestellten Master bis zur Formgebung in einer 100 Millimeter Petrischale auf. Bereiten Sie ein 10:1-Gemisch aus PDMS vor, indem Sie 50 Gramm Silikonbasis mit fünf Gramm Härter in einem Plastikbecher vermischen.Mischen Sie den Inhalt mit einem Rührgerät und entgasen Sie die Mischung anschließend 30 Minuten lang im Exsikkator oder bis alle Luftblasen entfernt sind. Gießen Sie das entgasste PDMS auf die vorbereitete Masterform, sodass eine Dicke von drei Millimetern erreicht wird. Stellen Sie die Petrischale danach erneut in den Exsikkator, um die Entgasung fortzusetzen.Nachdem alle Blasen entfernt wurden, das Gerät bei 80 Grad Celsius 80 Minuten lang aushärten. Nach dem Abkühlen das Gerät mit einem Skalpell aus der Form schneiden, sodass sowohl die 120 µm- als auch die 220 µm-Telegeometrien von der Seite des Geräts zugänglich sind. Anschließend die fluidischen Ein- und Ausgänge mit einer 0,75-mm-Biopsiepunch herausschneiden.Plasmabehandeln Sie das Gerät mit der strukturierten Seite nach oben zusammen mit einer vorgereinigten Glasplatte und 1 Millibar Sauerstoffplasma für 20 Sekunden in einem 300-Watt-Plasmareiniger. Verbinden Sie das Gerät, indem Sie die strukturierte Seite des PDMS-Geräts fest auf die plasmabehandelte Seite der Glasplatte legen. Anschließend stellen Sie das Gerät in einen Ofen bei 80 Grad Celsius und backen das zusammengebaute Gerät 40 Minuten lang. Nach dem Backen das Gerät mit einer fluorhaltigen Oberflächenbehandlungsflüssigkeit durchspülen, um die Kanäle hydrophob zu machen. Anschließend das Gerät unverzüglich bei 80 Grad Celsius für 10 Minuten backen, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Bereiten Sie zwei Laseranregungsfasern vor, indem Sie die Isolierung der letzten fünf Millimeter der optischen Fasern entfernen.Bereiten Sie außerdem die Faser zur Sammlung des fluoreszierenden Signals vor, indem Sie die Isolierung der letzten fünf Millimeter einer größeren optischen Faser entfernen. Untersuchen Sie die Spitzen aller Fasern unter einem Mikroskop. Falls die Spitzen nicht auf einer ebenen Fläche enden, schlagen Sie die Enden erneut mit einem Faserschreiber ab.Befestigen Sie anschließend einen Laserfaserkoppler an einem 50-Milliwatt-405-Nanometer-Laser und verbinden Sie eine der 105-Mikrometer-Kernfasern mit dem Laser. Richten Sie das abisolierte Ende des Sensors eines Laserleistungsmessgeräts aus und nutzen Sie die Feineinstellungen des Laserkopplers, um die Laserleistung zu maximieren. Führen Sie denselben Vorgang aus, um die andere Faser mit einem 50-Milliwatt-473-Nanometer-Laser abzugleichen.Danach montieren Sie einen Quad-Bandpassfilter mithilfe von Linsenrohren am Photomultiplierrohr, um das Laserlicht zu blockieren und die emittierte Fluoreszenz durchzulassen. Befestigen Sie einen Faserkopppler, sodass das Licht vor dem Auftreffen auf das Photomultiplierrohr durch die Filter geleitet wird. Anschließend verbinden Sie die Sammelfaser mit dem Faserkopppler.Platzieren Sie den hergestellten mikrofluidischen Chip auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops, das mit einer Digitalkamera mit Verschlusszeiten von mindestens 100 Mikrosekunden gekoppelt ist. Führen Sie vorsichtig von den Seiten her die mit dem 473-Nanometer-Laser gekoppelte Faser in den am weitesten stromaufwärts gelegenen 120-Mikrometer-Kanal ein. Achten Sie darauf, nicht bis in den Hauptströmungskanal durchzustechen.Danach wird die mit dem 405-Nanometer-Laser gekoppelte Faser in den am weitesten stromabwärts gelegenen Seitenkanal mit einer Höhe von 120 Mikrometern eingeführt, wodurch ein Fasernabstand von 300 Mikrometern entsteht. Zuletzt wird die größere, mit einer Photomultiplier-Röhre gekoppelte Faser in den 220 Mikrometer hohen Kanal eingeführt, der senkrecht zu den beiden Laseranregungsfasern verläuft. Eine Fünf-Milliliter-Spritze, gefüllt mit HFE 7500, das 2 % ionischen Fluortensid enthält, wird befüllt und mittels PE2-Schlauch an den Spaceroleinlass des Detektionsgeräts montiert.Füllen Sie als Nächstes eine Spritze mit einer Emulsion aus FITC und blauer Farbe und befestigen Sie sie an einer vertikal ausgerichteten Spritzenpumpe, die über PE2-Schlauchleitung als Zulauf für die Wiedereinspritzung von Tröpfchen mit dem Gerät verbunden ist. Verbinden Sie ein Stück PE-Schlauch vom Ausgang des Geräts mit einem Abfallbehälter. Spülen Sie anschließend das Gerät vor, indem Sie beide Pumpen mit 1.000 Mikrolitern pro Stunde betreiben, bis sowohl Öl als auch Tröpfchen regelmäßig im Gerät zusammenfließen und stromabwärts transportiert werden.Stellen Sie die Durchflussraten so ein, dass das Abstandshaltende Öl mit 6.000 Mikrolitern pro Stunde fließt und die Tröpfchen mit 100 Mikrolitern pro Stunde, wodurch ein ausreichender Abstand zwischen den Tröpfchen im Detektionsbereich gewährleistet wird. Schalten Sie anschließend die Laser ein und starten Sie das Datenerfassungsprogramm. Danach stellen Sie den Verstärkungsfaktor der Photomultiplierröhre so ein, dass Signale erzeugt werden, die mehr als das 100-fache des Grundrauschens betragen.Passt abschließend die Laserleistung so an, dass alle Doppelspitzen auf einer einzelnen, linear skalierten Zeitkurve deutlich sichtbar sind. Ein Tröpfchen, das durch den Detektionskanal fließt, durchläuft diskrete Anregungsregionen vor jeder der mit Laserlicht gekoppelten optischen Fasern. Die Detektionsfaser zeichnet die emittierte Fluoreszenz mit einer zeitlichen Verschiebung auf, wobei der Spitzenabstand mit der Zeit korreliert, die ein Tröpfchen benötigt, um sich von einer Anregungsregion zur nächsten zu bewegen.Dadurch entfällt die Notwendigkeit weiterer Lichtfilterung und separater Fotomultiplierröhren. Die Wirksamkeit des Nachweisschemas wurde getestet, indem eine Mischemulsion aus Tröpfchen detektiert wurde, die Farbstoffe enthalten, die bei 405 Nanometern und bei 473 Nanometern angeregt werden. Dieses Diagramm zeigt eine klare Trennung zwischen den vier erneut injizierten Tröpfchentypen, wenn sie mit etwa 50 Hertz durchströmt werden.Der Dynamikbereich und die absolute Empfindlichkeit des Detektors wurden durch die Messung von nur Fluorescein enthaltenden Tröpfchen untersucht. Die Daten zeigen die Fähigkeit des Systems, Farbstoffkonzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 Nanomolar zu detektieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein einfaches und kompaktes Fluoreszenzdetektionssystem mithilfe eines Arrays eingefügter optischer Fasern und eines einzelnen Photodetektors realisiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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