Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache Anwendung der Tröpfchenmikrofluidik-Fluoreszenzdetektion mit optischen Fasern zu demonstrieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im biologischen Hochdurchsatz-Screening zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung seltener Phänotypen und die gerichtete Evolution von Enzymen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache und kostengünstige Anwendung der Fluoreszenzdetektion in der Tröpfchenmikrofluidik ermöglicht.

Platzieren Sie zunächst einen vorgereinigten Siliziumwafer mit einem Durchmesser von drei Zoll auf dem Vakuumfutter eines Spin-Coaters. Tragen Sie dann einen Milliliter SU-8 3050 in die Mitte des Wafers auf und drehen Sie den Wafer, um eine 80 Mikrometer dicke Fotolackschicht zu erhalten. Nehmen Sie den beschichteten Wafer aus dem Spin Coater und legen Sie ihn auf eine auf 135 Grad Celsius vorgeheizte Heizplatte.

Nach 30 Minuten den Wafer herausnehmen und wieder auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Platzieren Sie als Nächstes den Wafer auf einer ebenen Fläche und richten Sie die erste Schichtmaske auf dem Wafer aus. Setzen Sie den Wafer drei Minuten lang einer kollimierten 190-Milliwatt-LED mit 365 Nanometern aus.

Legen Sie den Wafer nach der Belichtung eine Minute lang auf eine 135 Grad Celsius heiße Platte und lassen Sie ihn dann wieder auf Raumtemperatur abkühlen. Nach dem Abkühlen legen Sie den Wafer wieder auf den Spin Coater und befestigen Sie ihn am Spannfutter. Tragen Sie einen zusätzlichen Milliliter SU-8 3050 in die Mitte des Wafers auf und drehen Sie ihn 20 Sekunden lang bei 500 U/min.

gefolgt von 30 Sekunden bei 5.000 U/min. Als nächstes backst du die Waffel auf einer Herdplatte. Lassen Sie es wieder auf Raumtemperatur abkühlen und legen Sie es dann wieder auf die Ausrichtungsfläche der Maske.

Verwenden Sie den Präparierbereich, um die Maske der zweiten Ebene manuell an den gemusterten Ausrichtungsmarkierungen auf dem Wafer auszurichten. Sobald der beschichtete Wafer richtig ausgerichtet ist, belichten Sie ihn 4-1/2 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. Legen Sie den Wafer nach der Belichtung eine Minute lang bei 135 Grad Celsius auf eine Heizplatte, kühlen Sie den Wafer ab und kleben Sie ihn wieder auf den Spin Coater.

Tragen Sie ein drittes Mal einen Milliliter SU-8 3050 auf den Wafer auf und drehen Sie, um weitere 100 Mikrometer Fotolack hinzuzufügen. Die Waffel herausnehmen und auf einer 135 Grad heißen Platte 30 Minuten backen. Kühlen Sie es dann auf Raumtemperatur ab und legen Sie es auf die Ausrichtungsfläche.

Richten Sie die Maske der dritten Schicht an der vorherigen Geometrie aus und belichten Sie den beschichteten Wafer neun Minuten lang unter den vorherigen Bedingungen. Legen Sie den Wafer nach der Belichtung für eine Minute auf eine 135 Grad Celsius heiße Platte und kühlen Sie ihn dann auf Raumtemperatur ab. Nach dem Abkühlen entwickeln Sie die Masken, indem Sie den Wafer 30 Minuten lang in ein Rührbad aus Entwickler tauchen.

Zum Schluss die Waffel in Isopropanol waschen und dann ein letztes Mal eine Minute auf einer Herdplatte bei 135 Grad Celsius backen. Lagern Sie das entwickelte Master in einer 100-Millimeter-Petrischale, bis es geformt ist. Bereiten Sie eine 10:1-Mischung aus PDMS vor, indem Sie 50 Gramm Siliziumbasis mit fünf Gramm Härter in einem Plastikbecher kombinieren.

Mischen Sie den Inhalt mit einem rotierenden Werkzeug und entgasen Sie die Mischung dann 30 Minuten lang im Exsikkator oder bis alle Luftblasen entfernt sind. Gießen Sie das entgaste PDMS über das vorbereitete Master, um eine Dicke von drei Millimetern zu erhalten. Setzen Sie dann die Petrischale zur weiteren Entgasung wieder in den Exsikkator ein.

Sobald alle Blasen entfernt sind, backen Sie das Gerät 80 Minuten lang bei 80 Grad Celsius. Schneiden Sie das Gerät nach dem Abkühlen mit einem Skalpell aus der Form, so dass sowohl die 120-Mikrometer- als auch die 220-Mikrometer-Telegeometrie von der Seite des Geräts zugänglich sind. Stanzen Sie dann die fluidischen Ein- und Auslässe mit einem 0,75 mm Biopsiestanzer.

Behandeln Sie das Gerät mit der Gesichtsseite nach oben, zusammen mit einem vorgereinigten Objektträger und 1 Millibar Sauerstoffplasma für 20 Sekunden in einem 300-Watt-Plasmareiniger. Verkleben Sie das Gerät, indem Sie die gemusterte Seite des PDMS-Geräts fest auf die plasmabehandelte Seite des Objektträgers legen. Stellen Sie dann das Gerät in einen 80 Grad Celsius heißen Geräteofen und stellen Sie das zusammengebaute Gerät 40 Minuten lang zurück.

Spülen Sie das Gerät nach dem Einbrennen mit einer Spritze mit einer fluorierten Oberflächenbehandlungsflüssigkeit, um die Kanäle hydrophob zu machen. Backen Sie das Gerät dann sofort 10 Minuten lang bei 80 Grad Celsius, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Bereiten Sie zwei Laseranregungsfasern vor, indem Sie die Isolierung von den letzten fünf Millimetern der optischen Fasern entfernen.

Bereiten Sie die Faser außerdem für das Sammeln des Fluoreszenzsignals vor, indem Sie die Isolierung von den letzten fünf Millimetern einer größeren optischen Faser entfernen. Untersuche die Spitzen aller Fasern unter einem Mikroskop. Wenn die Spitzen nicht auf einer ebenen Fläche enden, verfestigen Sie die Enden mit einem Faserstift.

Befestigen Sie als Nächstes einen Laserfaserkoppler an einem 50-Milliwatt-Laser mit 405 Nanometern und befestigen Sie eine der 105-Mikrometer-Kernfasern an den Laser. Richten Sie das abisolierte Ende des Sensors eines Laserleistungsmessers und nutzen Sie die Feineinstellungen des Laserkopplers, um die Laserleistung zu maximieren. Führen Sie den gleichen Vorgang durch, um die andere Faser mit einem 50-Milliwatt-Laser mit 473 Nanometern abzustimmen.

Montieren Sie dann einen Quad-Bandpassfilter auf der Photovervielfachungsröhre mit Linsentuben, um das Laserlicht zu blockieren und die emittierte Fluoreszenz zu übertragen. Bringen Sie einen Faserkoppler so an, dass das Licht durch die Filter gelangt, bevor es auf die Photomultiplier-Röhre trifft. Befestigen Sie als Nächstes die Sammelfaser an den Faserkoppler.

Platzieren Sie den hergestellten mikrofluidischen Chip auf dem Tisch eines inversen Mikroskops, das mit einer Digitalkamera gekoppelt ist, die eine Verschlusszeit von mindestens 100 Mikrosekunden ermöglicht. Führen Sie die mit dem 473-Nanometer-Laser gekoppelte Faser vorsichtig von den Seiten in den am weitesten vorgeschalteten 120-Mikrometer-Kanal ein. Achten Sie darauf, dass Sie nicht bis zum Hauptströmungskanal durchstechen.

Führen Sie dann die mit dem 405-Nanometer-Laser gekoppelte Faser in den am weitesten stromabwärts gelegenen 120 Mikrometer hohen Seitenkanal ein, wodurch ein Faserabstand von 300 Mikrometern erreicht wird. Führen Sie zuletzt die größere gekoppelte Faser der Photomultiplier-Röhre in den 220 Mikrometer hohen Kanal senkrecht zu den beiden Laseranregungsfasern ein. Füllen Sie eine mit HFE 7500 gefüllte Fünf-Milliliter-Spritze mit 2 % ionischem Fluortensid und befestigen Sie sie mit einem PE2-Schlauch am Abstandsöleinlass des Detektionsgeräts.

Füllen Sie anschließend eine Spritze mit einer gemischten FITC- und Blaufarbstoffemulsion und montieren Sie sie auf eine vertikal ausgerichtete Spritzenpumpe, die mit PE2-Schläuchen als Tröpfchen-Reinjektionseinlauf mit dem Gerät gekoppelt ist. Schließen Sie ein Stück PE-Schlauch vom Geräteausgang an einen Abfallbehälter an. Saugen Sie dann das Gerät an, indem Sie jede der Pumpen mit 1.000 Mikrolitern pro Stunde laufen lassen, bis sich sowohl Öl als auch Tröpfchen regelmäßig im Gerät verbinden und stromabwärts fließen.

Passen Sie die Durchflussraten so an, dass das Spaceröl mit 6.000 Mikrolitern pro Stunde und die Tröpfchen mit 100 Mikrolitern pro Stunde laufen, wodurch ein erheblicher Abstand zwischen den Tröpfchen gewährleistet wird, die sich durch den Nachweisbereich bewegen. Schalten Sie dann die Laser ein und starten Sie das Datenerfassungsprogramm. Passen Sie als Nächstes die Verstärkung der Photomultiplier-Röhre an, um Signale zu liefern, die mehr als das 100-fache des Grundrauschens sind.

Passen Sie abschließend die Laserleistung so an, dass alle Dublett-Peaks auf einer einzigen, linear skalierten Zeitkurve deutlich sichtbar sind. Ein Tröpfchen, das durch den Detektionskanal fließt, trifft vor jeder der lasergekoppelten optischen Fasern auf diskrete Anregungsbereiche. Die Detektionsfaser zeichnet die emittierte Fluoreszenz mit einer zeitlichen Verschiebung mit einem Peakabstand auf, der mit der Zeit korreliert, die ein Tröpfchen benötigt, um sich von einem Anregungsbereich in den nächsten zu bewegen.

Dadurch sind keine weitere Lichtfilterung und separate Photomultiplier-Röhren erforderlich. Die Wirksamkeit des Detektionsschemas wurde getestet, indem eine gemischte Emulsion von Tröpfchen detektiert wurde, die Farbstoffe enthielten, die bei 405 Nanometern und bei 473 Nanometern anregen. Diese Grafik zeigt eine klare Trennung zwischen den vier reinjizierten Tröpfchentypen, wenn sie mit etwa 50 Hertz gepumpt werden.

Der Dynamikbereich und die absolute Empfindlichkeit des Detektors wurden untersucht, indem die reinen Fluoreszein-Tröpfchen gemessen wurden. Die Daten zeigen die Fähigkeit des Systems, Farbstoffkonzentrationen zu erkennen, die von 0,1 bis 100 Nanomolar reichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein einfaches und kompaktes Fluoreszenzdetektionssystem implementieren können, indem Sie ein Array von eingesetzten optischen Fasern und einen einzigen Photodetektor verwenden.