Antikörper Bindungsspezifität für Kappa (V & kgr;) Leichte Kette enthaltende Human (IgM) Antikörper: Polysialinsäure (PSA) An NCAM als Fallstudie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung von Antigenen für Antikörper mit therapeutischem Potenzial mit Fokus auf den IgM-Isotyp. Diese Methode schließt eine Wissenslücke im biomedizinischen Bereich und kann dazu beitragen, neue Biomarker und Immuntherapeutika für die Krebsforschung und Erkrankungen des zentralen Nervensystems zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Tür zu einer vernachlässigten Klasse von Antikörpern mit großem therapeutischem Potenzial öffnet.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose und Behandlung aller Krankheiten, die mit Antikörper-basierten Therapeutika behandelt werden können. Was diese Materie geben kann, gibt Aufschluss über Antigene von IgM-Antikörpern und wachsendes Gewebe und Subkulturen. Es kann auch eine Seuche für andere Antikörper-Isotypen aller Spezies sein.

Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich eine spezifische und prominente Bindung des IgM-Antikörpers in verschiedenen biochemischen Anwendungen feststellte. Das Verfahren wird von Robert Kahoud und Jens Watzlawik vorgeführt. Um diesen Eingriff zu beginnen, machen Sie einen Schnitt am Schädel nach vorne auf Ohrhöhe und schälen Sie den Schädel zurück.

Legen Sie dann das Gehirn vorsichtig in ein 15-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie es sofort auf Trockeneis. Übertragen Sie das Gehirn nach fünf Minuten auf ein sauberes Wiegepapier und entfernen Sie schnell das Kleinhirn und den Hirnstamm mit einer sauberen Rasierklinge. Wiegen Sie anschließend das gefrorene Großhirn, bevor Sie es wieder in das 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis geben.

Geben Sie eiskalten Lysepuffer bis zu einer Endkonzentration von 150 Mikrogramm Hirngewebe pro Mikroliter Lysepuffer hinzu. Homogenisieren Sie dann das Gehirn in einem Lysepuffer durch Verreibung durch eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, gefolgt von einer Verreibung durch eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Inkubieren Sie danach das Gehirnlysat für weitere 30 Minuten auf Eis, um eine vollständige Gewebelyse zu ermöglichen.

Entfernen Sie nach 30 Minuten das Reinigungsmittel, unlösliches Material und die Gehirnlipide, um sie seriell zu zentrifugieren. Entsorgen Sie das Myelin und die Zelltrümmer, die das Pellet enthalten, aber behalten Sie den Überstand nach jedem Zentrifugationsschritt bei. Aliquotieren Sie das Gehirnlysat und lagern Sie es bei 80 Grad Celsius.

Bereiten Sie in diesem Schritt 200 Milliliter IP Buffer mit BSA und weitere 200 Milliliter IP Buffer ohne BSA vor. Für die Immunpräzipitationsreaktion werden 100 Mikroliter Protein-L-Agarose-Aufschlämmung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie einen Milliliter IP-Puffer mit BSA in das Röhrchen.

Mischen Sie es dann manuell durch Inversion. Waschen Sie anschließend die Agarosekügelchen von Protein L viermal durch Zentrifugation. Entfernen Sie danach den Überstand, ohne das Agarose-Pellet zu stören, und wiederholen Sie den Waschvorgang noch dreimal.

Geben Sie dann frischen BSA-haltigen IP-Puffer zu der Protein L-Agarose und inkubieren Sie sie über Nacht auf einer Walze bei vier Grad Celsius. In 800 Mikroliter IP-Puffer, der BSA enthält, und 30 Milligramm lysiertes Hirngewebe fügen Sie 20 Mikrogramm experimentellen Antikörper, Kontrollantikörper oder PBS hinzu. Inkubieren Sie 30 Milligramm lysiertes Hirngewebe in eiskaltem IP-Puffer mit IgM-Antikörpern in einem 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag schleudern Sie Protein L Agarose-Kügelchen in einer Tischzentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Agarose-Pellet zu beschädigen. Fügen Sie dann die gekühlte Antikörper-Hirnlysatlösung zur Protein L-Agarose hinzu.

Inkubieren Sie das Antikörperantigen, die Protein-L-Agarose-Suspension, zwei Stunden lang auf einer Walze bei vier Grad Celsius. Nach zwei Stunden wird der an Agarose L gebundene Antikörper-Antigen-Komplex durch Zentrifugation gewaschen. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie einen Milliliter eiskalten IP-Puffer mit 0,2 % BSA hinzu.

Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal mit eiskaltem IP-Puffer mit 0,2 % BSA und zwei weitere Male mit eiskaltem IP-Puffer ohne BSA. Danach schleudern Sie den an Agarose L gebundenen Antikörper-Antigen-Komplex herunter.Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um den Überstand zu verwerfen, bis etwa 50 Mikroliter der Lösung auf dem Protein L-Agarose-Pellet verbleiben. Verwenden Sie dann eine 10-Mikroliter-Pipette, um es vollständig zu entfernen.

Bewahren Sie alle Proben auf Eis auf. Geben Sie anschließend 40 Mikroliter IP-Elutionspuffer in jedes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Schnippen Sie sechsmal mit dem Finger auf die Tube und erhitzen Sie sie fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Legen Sie die Probe danach zwei Minuten lang auf Eis und schleudern Sie sie 30 Sekunden lang nach unten. Übertragen Sie dann 35 Mikroliter des Überstands in ein frisches 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen, ohne das Pellet zu stören. Bestätigen Sie als Nächstes, dass keine Protein L-Agarosekügelchen vorhanden sind, indem Sie eine kleine Menge verdünnter Probe an der Innenwand des Röhrchens abspülen.

Wenn Protein-L-Agarosekügelchen vorhanden sind, wird die Probe weitere 30 Sekunden lang bei 13.000 g heruntergeschleudert und der Überstand in ein sauberes Röhrchen überführt. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis keine Agarosekügelchen mehr erkennbar sind. Laden Sie dann 10-20 Mikroliter verdünnter Proben pro Vertiefung auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel und ein Tris-Glycin-SDS-Puffersystem und lassen Sie das Gel etwa eine Stunde lang bei 100 Volt ohne zusätzliche Kühlung auf dem Labortisch laufen.

Übertragen Sie anschließend die Proteine auf eine PVDF-Membran. Die Proteine werden zweieinhalb Stunden lang im Kühlraum bei 100 Volt mit Hilfe von Kältetransferpuffer übertragen. Blockieren Sie die Membran mit 10 % Gewichtsprozent pro Volumen Trockenmilchpulver in PBS-T für eine Stunde bei 25 Grad Celsius auf einem Tisch-Orbitalschüttler.

Waschen Sie es zweimal für jeweils 10 Minuten mit PBS-T. Sondieren Sie die Membran mit einem Primärantikörper in 5%BSA in PBS-T. Inkubieren Sie über Nacht auf einem Orbitalschüttler im Kühlraum.

Waschen Sie die Membran am nächsten Morgen einmal mit überschüssigem PBS-T bei 25 Grad Celsius, gefolgt von drei Wäschen mit PBS-T für jeweils 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler. Geben Sie anschließend einen Sekundärantikörper und 5%iges Trockenmilchpulver in PBS-T in die Membran und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler. Danach waschen Sie die Membran einmal mit überschüssigem PBS-T bei 25 Grad Celsius, gefolgt von drei Wäschen mit PBS-T für jeweils 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler.

Mischen Sie einen Milliliter gekühltes HRP-Substrat mit verbesserter Chemilumineszenz Komponente A mit einem Milliliter Komponente B bei 25 Grad Celsius. Übertragen Sie die Membran auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Trocknen Sie dann den Behälter mit Papiertüchern ab, bevor Sie die Membran wieder darauf übertragen.

Geben Sie sofort zwei Milliliter des vorgemischten HRP-Substrats mit verbesserter Chemilumineszenz in die Membran und inkubieren Sie sie zwei Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Kippen Sie den Behälter alle 20 Sekunden von Hand, um die Membran gleichmäßig zu befeuchten. Übertragen Sie danach die Membran in eine durchsichtige Kunststoffhülle und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und Luftblasen mit Papiertüchern.

Kleben Sie die Plastikhülle in die Kassette und schließen Sie sie. Diese Abbildung zeigt, dass HigM12 sein Antigen aus den zerebralen Hirnlysaten immunpräzipitiert und als Nachweismittel in Western Blots wirkt. Weder Isotyp-Kontrollantikörper noch Agarose-L-Kügelchen immunpräzipitieren ein ähnliches Antigen, was die Spezifität des Pulldowns zeigt.

Hier zeigen Western Blots mit ZNS-Lysaten aus Wildtyp- und NCAM-Knockout-Mäusen die Spezifität der HIgM-Bindung an PSA, das NCAM enthält. Die enzymatische Verdauung von ZNS-Gewebe aus Wildtyp-Mäusen mittels ENDO-NF identifiziert PSA, das an NCAM gebunden ist, als spezifisches Bindungsapitop für HIgM12. Unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens werden IBA-1-positive Ratten-Mikrogliakulturen von hoher Reinheit erhalten. Im Gegensatz zu Mikroglia waren HIgM12- und A2B5-Zielzelloberflächenantigene in Ratten-OPC-Kulturen unter Lebendzellbedingungen stark angereichert.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von 13 Arbeitsstunden durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Biacore oder die Oberflächenplasmonenresonanztechnologie eingesetzt werden, um die Bindungsaffinitäten der Antikörper zu Assoziations- und Assoziationskonstanten zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsforschung, Immuntherapien und natürlichen Autoantikörper, um Kohlenhydratapitope auf ähnlichen Proteinen als Antigene für therapeutische IgM-Antikörper beim Menschen zu identifizieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glykoprotein-Antigene für Forschungsarbeiten identifiziert, die humane IgM-Antikörper enthalten. Die Daten liefern ein neues Ziel für die MS-Therapie. PSA ENCAP, die von uns entwickelte Antikörperbehandlung, ist eine der ersten, die eine funktionelle Verbesserung in einer Aktivitätsbox zeigt, indem sie das strenge Modell verwendet, das bei der Krankheit steckt und die Krankheit ähnlich wie bei Multipler Sklerose abwertet.