Name: Antikörper Bindungsspezifität für Kappa (V and kgr;) Leichte Kette enthaltende Human (IgM) Antikörper: Polysialinsäure (PSA) An NCAM als Fallstudie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie man Antigene für therapeutische IgM-Antikörper identifiziert. Diese Methode nutzt Immunpräzipitation und Western Blotting mit Gehirngewebe, um neue Biomarker für Krebs und Erkrankungen des ZNS zu finden.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 und R21 NS073684) unterstützt wurde, der National Science Foundation (Career Award), die Minnesota Partnership Award für Biotechnologie und Medical Genomics, der National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) und der Mayo-Klinik Zentrum für Klinische und Translational Science (CCATS). Die Autoren erkennen an Unterstützung von den Applebaum, Hilton, Peterson und Sanford Foundations, dem Mond und Marilyn Park Directorship Fonds und der McNeilus Familie.

Patente für Antikörper, die die Remyelinisierung und ZNS-Reparatur fördern, werden von der Mayo Clinic erteilt und sind im Besitz der Mayo Clinic. Autoren haben einen potenziellen Interessenkonflikt.

Natürliche menschliche IgM - Autoantikörper sind ansprechend Kandidaten für Immuntherapien und haben sich für die Behandlung verschiedener Krankheiten einschließlich Krebs und Erkrankungen des ZNS 1-7 therapeutisches Potential nachgewiesen. Vorteilhafterweise werden diese Antikörper keine Immunantwort in dem die Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern reduziert wesentlich die wirksame therapeutische Dosis und Wirksamkeit hervorzurufen. Wichtig ist , dass alle Antikörper mit therapeutischem Potential des Isotyps IgM gewesen und gehören zu den NKV Repertoire 3-5,8,9,37,40,42-45. Eine große Hürde für die potentielle klinische Anwendung von IgM-Antikörpern ist die Identifizierung der Antigene, die in vielen Fällen nicht bestimmt werden. Standardtechniken für die IgG-Antikörper eingesetzt werden, sind oft nicht anwendbar, ein IgM des Antigens zu identifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die Identifizierung von PSA-NCAM als Antigen für die regenerative menschlichen IgM-Antikörper HIgM12, wirksam in Tiermodellenvon MS und ALS 15-18. Die angewandte Methodik ist prinzipiell für alle humanen Antikörpern mit spezifischen V &amp; kgr; leichten Ketten VκI, VκIII und VκIV und Maus-Antikörper mit VκI leichten Ketten, unabhängig von der Isotyp des Antikörpers. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung von IgM-Antikörpern bei der Affinitätschromatographie-Anwendungen. Genauer gesagt sind erfolgreiche Antikörper erforderlich als Pull-down-Mittel in Immunpräzipitationen handeln ein Antigen aus komplexen Gewebe- oder Zellkultur-Lysaten zu isolieren oder anzureichern. Angereichert Antigenfraktionen können zu Immunpräzipitationen von Isotypenkontrolle Antikörpern und anschließend analysiert, um Unterschiede durch Massenspektrometrie verglichen werden. Eine wesentliche Anforderung oder die Begrenzung dieses Schrittes ist die Gegenwart des korrekten Antikörpers V &amp; kgr; leichte Kette und Wirt (Mensch, Maus) Antikörperbindung an Protein L-Agarose zu ermöglichen. Die Verwendung von Mannan-bindendes Protein an Agarose gebunden (auch called Mannose-bindendes Lektin) anstelle von Protein L Agarose ist eine mögliche Alternative IgMs ohne spezifische V &amp; kgr; leichten Ketten zu Immunpräzipitation. Jedoch ist , wie von Arnold et al angegeben. 35, Antigen-gebundenen IgM - Antikörper binden nicht an Mannan-bindendes Protein, wie es die Ziel Glykan unzugänglich zu werden scheinen , sobald das IgM an sein Antigen gebunden hat. Basierend auf diesen Ergebnissen Protein Mannan-binding kann nicht als Bindematrix eingesetzt werden IgM zu immunpräzipitieren Antigen-beladenen 35 Molekülen. Andere mögliche Alternativen könnte die Verwendung von sekundären Agarose-gebundenen anti-IgM - Antikörper IgG 46,47 oder die Verwendung von oberflächenaktivierte magnetische Kügelchen 48 sein. IgG-Antikörper gegen IgM konnte chemisch vernetzt werden, um eine oder Agarose G, um an Agarose, das Ausmaß der eluierten Antikörper zusammen mit dem Antigen von Interesse zu reduzieren. Eine richtige Vergleich zwischen verschiedenen Varianten von IgM-Immunpräzipitation in Bezug auf i erfolgreich identifizierten Antigenes schwierig, weil die meisten Immunpräzipitationen durchgeführt wurden, zu isolieren oder IgMs ohne weiteres Interesse an ihre Antigene erschöpfen. Zusätzlich wurden Immunpräzipitationen unter Verwendung IgMs hauptsächlich 49 eine bereits bekannte oder erwartete einzelnes Antigen mit Antikörper Exposition gegenüber gereinigter Antigene zu bestätigen. Nachteilig an Agarose-gekoppelter IgGs gegen menschliche IgMs gerichtet ist , eine sehr geringe Ausbeute (10 bis 15%) der immunpräzipitierten Serummoleküle IgM , wenn dem Ausgangsmaterial 50 verglichen. Im Gegensatz dazu oberflächenaktivierte magnetische Kügelchen wurden erfolgreich an Antikörper verschiedener Isotypen angewendet einschließlich IgM 48 Scrapie-assoziierten Fibrillen Immunpräzipitation. Dieses Verfahren ist nicht auf bestimmte kappa (V &amp; kappa;) oder Lambda (λ) -Ketten oder einen bestimmten Host beschränkt und kann im Wesentlichen das Spektrum der IgM Antikörper in Immunpräzipitationen verwendet verbreitern. Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll ist die Fähigkeit des Antikörpers als det zu funktionierenektierender Antikörper (primärer Antikörper) in Western-Blots oder anderen Screening-Plattformen. Erfolgreiche Antikörper müssen ihre Antigen mit ausreichend hoher Affinität Zielantigenbindung in Gegenwart von nichtionischen oder möglicherweise ionische Detergenzien zu ermöglichen. Antikörper mit hoher Affinität sind häufig bei Affinitäts-gereifte IgG-Antikörpern, aber weniger häufig bei Antikörpern vom IgM-Isotyp, der einer der Gründe ist, warum es gibt relativ wenige kommerziell erhältlichen IgM Antikörper als Mittel in biochemischen Einstellungen erfassen. Hochaffine Bindung von Antikörpern ist eine Voraussetzung für Immunpräzipitationen von molekularen Antigenen und zum Western-Blotting. Absenken Detergenzkonzentrationen oder vollständiger Abwesenheit von Detergentien in IP-Puffer und Lysepuffer ermöglicht Antigen durch niederaffinen Antikörpern über ihre Fab-Domäne Targeting. Im Gegensatz dazu wird der Antikörper die Fähigkeit Protein L-Agarose über seinen Fc-Teil zum Ziel nicht wesentlich unter Isotypkontrollen über einen Bereich verschiedener Waschmittel Konzen betroffentrationen. Jedoch Puffer niedriger Waschmittelkonzentration in Lysepuffer und IP verhindert Zellmembran Unterbrechung und Isolierung von spezifischen Molekülen. In ähnlicher Weise eine geringe Detergenskonzentration in Western - Blot - Wasch - Puffer (zB PBS-T) erlaubt Antigenbindung von niederaffinen Antikörpern , aber zur gleichen Zeit erhöht unspezifische Bindung und ist daher nicht in Frage . Die Anwesenheit eines Antigens Proteinkern ist eine weitere Voraussetzung für diese Methode. Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen (zB Glykoproteine, Lipoproteine) und unmodifizierten Proteine, aber nicht alleinige Lipiden oder Kohlenhydraten, sind nachweisbar in Western Blots. Es ist nicht möglich , Lipide zu immunpräzipitieren (beispielsweise um Sphingolipide) aus Gewebe oder Zell - Lysaten in der Gegenwart oder Abwesenheit von Detergenzien. Die physikochemischen Eigenschaften von Detergenzien und Lipide sind zu ähnlich selektive lipid-Antikörper-Wechselwirkungen zu ermöglichen, während gleichzeitig die Detergenzien sind wesentlich zu störenMembranen, um selektive Isolierung von spezifischen Molekülen zu ermöglichen. Nach unserem besten Wissen, Immunpräzipitationen ausschließlich aus Kohlenhydraten besteht, in Abwesenheit eines Proteinkern, sind bisher nicht berichtet worden. Dies wird besonders relevant, da IgM-Antikörper häufig Kohlenhydrate und Glycolipiden Target, die nicht notwendigerweise auf eine Proteineinheit verbunden. Andere chromatographische Techniken sind für die Trennung und immunologische Identifizierung von Lipiden und Kohlenhydraten in Abwesenheit eines Proteinkern erforderlich. Zum Beispiel Dünnschichtchromatographie (TLC) der zellulären Lipiden mit anschließender Antikörper - Nachweis auf der DC - Platte (immuno-TLC) können 51,52 realisiert werden. Andere anti-PSA-Antikörper wurden in früheren Studien und Ergebnisse im Vergleich mit HIgM12 sowie die im Handel erhältlichen anti-PSA IgM (Klon 2-2B) beschrieben worden. Die am häufigsten verwendeten Antikörper auf dem Gebiet der PSA ist ein IgG-Antikörper (Klon 735), erhältlich als Maus-Mono-Clonal oder Kaninchen polyklonalen Antikörper 53. Diese Anti-PSA - IgG - Antikörper erkennt PSA auf SynCAM und NCAM auf verschiedenen ZNS - Zelltypen , einschließlich Mikroglia - Zellen 41. Im Gegensatz zu dem Antikörper anti-PSA-IgG, Human-IgM-Antikörper HIgM12, HIgM42 und die anti-PSA-Maus IgM (Klon 2-2B) sind nicht in der Lage PSA auf SynCAM Ziel (aber auf NCAM) bei verschiedenen embryonalen und frühen postnatalen Stadien in Mäusen , während nicht-polysialylierte SynCAM ist leicht nachweisbar 15. Die IgM - Antikörper verwendet werden , sind auch nicht in der Lage PSA auf Mikroglia - Zellen nachzuweisen (Figuren 3 + 4). Eine mögliche Erklärung für die Unterschiede zwischen den beobachteten Antikörper-Isotypen können geringe PSA-SynCAM Ebenen im Vergleich zu Mengen an PSA-NCAM mit der potentiell geringere Affinität kombiniert Bindung von IgM-Antikörpern im Vergleich zu dem Anti-PSA-IgG. Um diese Hypothese zu testen, führten wir Immunpräzipitationen in NCAM KO Tiere an embryonalen Stadium E17 mit großen Mengen an SynCAM vorhanden und verwendet HIgM12 als &quot;Pull-Down-Agenten&quot; &lt;sup&gt; 15. In E17 WT littermate steuert HIgM12 immunpräzipitiert PSA-NCAM in einem Ausmaß, die ähnliche Intensitäten von &quot;heruntergezogen&quot; PSA-NCAM zeigte im Vergleich zum IgMs schweren Kette, wie durch Densitometrie in nachfolgenden Western-Blot unter Verwendung von eluierten Antigene nachgewiesen. Dieses Ergebnis schlug mindestens eine ausreichende Affinität von HIgM12 an seine Ziel PSA. Im Gegensatz zu WT littermate steuert HIgM12 nicht PSA SynCAM in NCAM KO Tieren angebracht erkannt hat. Identische Ergebnisse wurden in Immunpräzipitationen unter Verwendung des menschlichen Anti-PSA IgM HIgM42 erhalten. HIgM12 und HIgM42 sowie die Maus-Anti-PSA-IgM (Klon 2-2B) waren nicht in der Lage PSA auf SynCAM in Western-Blots an embryonalen und postnatalen Entwicklungsstadien von WT und NCAM KO Tiere zu zielen. In Anbetracht der geringen Menge an HIgM12 erforderlich (0,1 ug / ml) , um speziell PSA erkennen an NCAM in Western - Blots unter Verwendung von geringen Mengen von ZNS - Gewebe (0,1 ug ZNS - Gewebe pro Vertiefung) 15 scheint es unwahrscheinlich zu sein , dass niedrige Affinitäten alleinverantwortlich für völlige Fehlen von PSA-SynCAM Erkennung von HIgM12 in drei verschiedenen Methoden. Wir schließen daraus, dass es signifikante Unterschiede zwischen den Anti-PSA-IgM-Antikörper und der häufig veröffentlicht anti-PSA-IgG-Antikörper (Klon 735). Es ist nicht klar, warum handelsüblichen anti-PSA-IgM-Antikörper nicht häufiger in der Vergangenheit verwendet wurden Ergebnisse mit Antikörper antiPSA IgG 735. Dies ist besonders interessant, erhalten, um zu bestätigen, weil HIgM12 bereits Wirksamkeit in verschiedenen Krankheitsmodellen erwiesen hat. Während andere Anti-PSA-IgM-Antikörper ähnliche therapeutische Wirkungen haben können bleibt unklar, ob die Anti-PSA-IgG-Antikörper (Klon 735) eine ähnliche therapeutische Ergebnis in Modellen der MS und ALS hat. Kurz gesagt, wurden hier in erster Linie zu identifizieren, die das Antigen des Regenerativ-menschlichen Antikörpers HIgM12 unterstützen potentielle klinische Studien für MS und möglicherweise andere neurodegenerative Erkrankungen beschriebenen Verfahren verwendet. Die Identifizierung der Ameiseigens für Antikörper mit der biologischen Aktivität ist, als wesentlichen Schritt ihres Wirkmechanismus zu verstehen. Dies wird besonders relevant im Zusammenhang mit zahlreichen monoklonalen Antikörpern zur Zeit für die Sicherheit und Wirksamkeit in Studien am Menschen getestet. Während die Anzahl der klinisch getestet IgM Antikörper bisher klein ist, die jüngsten Fortschritte in Hybridom - Technologie zusammen mit einer steigenden Anzahl von Studien , die die therapeutische Potential dieses Antikörperklasse Hervorhebung 1-10,37,40,42-45 fordert die Entwicklung neuer oder modifizierte Methoden anwendbar nicht-Protein-IgM-Antigene zu identifizieren.

Antikörper vom IgM - Isotyp zeigen großes therapeutisches Potential für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten , einschließlich Krebs und Erkrankungen des ZNS 1-7. Die Vollmers &#39;Gruppe zahlreiche Antikörper bei Krebspatienten für mögliche Verwendung als tumorspezifische Biomarker oder aktiven Therapeutika identifiziert die in der Lage sind bösartige Zellen zu töten , indem sie apoptotische Wege 4,8,9 induzieren. Interessanterweise alle identifizierten Antikörper mit therapeutischem Potential sind der IgM-Isotyp und gehören zur Gruppe der &quot;natürlichen Autoantikörper&quot; (NAbs). In ähnlicher Weise identifiziert die Rodriguez Gruppe von Maus und Mensch-Antikörper, die Remyelinisierung in chronisch demyelinierten Läsionen des Rückenmarks bei den Modellen der Multiplen Sklerose (MS) zu stimulieren. Identisch mit Antikörpern mit Anti-Krebs - Wirkung, alle Remyelinisierung fördernder Antikörper sind NAbs und der IgM - Isotyp 1,6,7,10. Die genauen Antigene für die meisten identifiziert IgMs sind noch undetermined einschließlich des menschlichen Remyelinisierung fördernden Antikörper rHIgM22, die derzeit in klinischen Phase - I - Studien für MS - Patienten 11. Trotz wiederholter Bemühungen von Experten auf dem Gebiet der Lipid- und Kohlenhydratforschung sowohl im akademischen Umfeld und in Partnerschaft mit der Industrie 11, versucht rHIgM22 das Antigen zu identifizieren , waren nicht erfolgreich. Das Versagen von Standardtechniken verwendeten Antigene von IgG-Antikörpern zu identifizieren, mit IgM-Antikörpern zu arbeiten identifiziert eine kritische Notwendigkeit Methoden zu verfeinern, spezifisch für diesen Antikörper, die wahrscheinlichste Ziel Kohlenhydrat oder Lipid-Antigene. Der Schwerpunkt dieses Manuskript ist der menschliche regenerative Antikörper HIgM12 und die experimentellen Verfahren verwendet, sein Antigen zu identifizieren. Antikörper HIgM12 wurde von Patienten mit Morbus Waldenström identifiziert, stimuliert das Neuritenwachstum in vitro 12-14 und Ziele Polysialsäure (PSA) , die an das neuronale Zelladhäsionsmolekül (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 verlängert Lebensdauer in einem Mausmodell der ALS 17 und verbessert die funktionelle Ergebnis in Theiler murine Enzephalomyelitis Virus (TMEV) infiziertem Mäuse. Insbesondere stimuliert HIgM12 spontane horizontale und vertikale Bewegungsaktivität in chronisch demyelinierten Mäuse und erhöht Zahl von kleinen und mittleren Durchmesser des Rückenmarks Axone acht Wochen nach einer einzigen, niedrigen Dosis von intraperitoneale 18 Antikörper injiziert. Das neurale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) ist ein Glycoprotein der Immunglobulin (Ig) -Superfamilie auf der Zelloberfläche von Neuronen exprimiert, Glia, Skelettmuskel, und natürliche Killerzellen 19-25. Die drei großen NCAM-Isoformen genannt NCAM180, NCAM140 und NCAM120 sind alternative Splice-Varianten eines primären Transkripts, die nur in ihrer zytoplasmatischen Domäne variieren. Im ZNS ist NCAM die Haupt polysialylierte Molekül (&gt; 95%) mit langen, negativ geladene Sialinsäure-Homopolymere. Polysialinsäuren eincid mit n&gt; 10 wird als PSA aber kürzere oligomere Strukturen existieren, die auch biologisch relevant sind. Andere polysialylierte Proteine ​​im ZNS exprimiert sind SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 und ein Natriumkanal - Untereinheit 25 (für einen Überblick siehe 29). Die hier beschriebenen Methoden erlauben Antigen Identifikation für die Human- und Maus - Immunglobulinen , die spezifische kappa (V &amp; kgr;) Leichtketten (VκI, VκIII oder VκIV leichten Ketten für menschliche Antikörper und VκI leichten Ketten für Maus - Antikörper) , unabhängig von der Isotyp des Antikörpers (zB IgG, IgM , IgA, IgD oder IgE). Diese Beschränkung beruht auf der Verwendung von Protein L-Agarose für Immunpräzipitationen mit Antikörpern des IgM-Isotyps. Alternative Strategien können Mannose-bindende Lektine und sekundären IgG anti-IgM-Antikörper kovalent an Agarose-Kügelchen, umfassen, die die Anwendbarkeit dieses Verfahrens auf mehr IgM Antikörper erweitern kann incdie mit Lambda (λ) Leichtketten Luding (siehe Diskussion). Die Verhältnisse von Serum V &amp; kgr; leichten Ketten IgM im Vergleich zu leichten Ketten λ IgM von gesunden Individuen abgeleitet sind 1,5: 1 30. Basierend auf dem chromatographischen Methodik hier verwendet zur Trennung, Anreicherung und immunologisch bestimmte Moleküle 31 erfassen, werden alle Antigene erforderlich , mindestens eine kleine Proteindomäne umfassen. Die spezifische Bindung Epitop des Antikörpers kann (in Glykoproteine, Lipoproteine ​​zB) innerhalb oder außerhalb des Proteindomäne sein. Erste biochemische Schritte verwendet, um das spezifische Antigen für HIgM12, jeweils die Liste der potentiellen Kandidaten einzuengen zu identifizieren, sind die wichtigsten Schritte in diesem Verfahren. Zelltyp-spezifische Präparate und Zellmorphologie Basis Charakterisierungen sind für Gliazellen beschrieben, aber diese Methode extrapoliert werden kann andere Zelltypen innerhalb oder außerhalb des ZNS anzupassen. Es besteht ein dringendermüssen neue oder modifizierte Techniken anwendbar für die zunehmende Anzahl von IgM-Antikörpern mit therapeutischem Potential für verschiedene menschliche Erkrankungen insbesondere in den Fällen (die meisten IgM-Antigene) entwickeln, in denen die Antikörper-Targets sind Kohlenhydrat- oder Lipidstrukturen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>High Glucose, mit Glutamin, mit Natriumpyruvat, 500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml, L-Glutamin, Natriumpyruvat, hoher Glukosegehalt</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Serum frei, 10 ml</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Steriles Wasser zur Spülung</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1.000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys &middot; xHBr, Molekulargewicht 30.000-70.000 g/mol, 50 mg</td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminfraktion V</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>Hitzeschockfraktion, proteasefrei, pH 7,&nbsp; Reinheit 98%, 100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, Molekulargewicht: 180,16 g/mol, ACS-Reagenz, 500 g</td></tr><tr><td>Trypsin aus der Rinderpankreas</td><td>Sigma</td><td>T9935-100 mg</td><td>im Wesentlichen salzfreies, lyophilisiertes Pulver, 9.000 BAEE-Einheiten/mg Protein</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der Rinderpankreas</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Typ IV, lyophilisiertes Pulver, 2.000 Kunitz-Einheiten/mg Protein</td></tr><tr><td>Rekombinantes Ratten-FGF-Basisprotein</td><td>R& D systems</td><td>3339-FB-025</td><td>BSA als Trägerprotein, 25 &#181; g, lyophilisiert, > 95%, 16,2 kDa</td></tr><tr><td>rekombinantes Ratten-PDGF-AA-Protein</td><td>R& D systems</td><td>1055-AA-50</td><td>trägerfrei, 50 &#181; g, lyophilisiert, > 97%, E. coli-abgeleitet, 12,5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td>500 ml, kein Glutamin, keine Asparaginsäure, keine Glutaminsäure</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>kristallin, 1 kg, Reagenzqualität, Molekulargewicht 30,03 g/mol (als Monomer)</td></tr><tr><td>Tris[hydroxymethyl]aminomethan (Tris bas</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg, 99,8% rein, Pulver</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Biorad</td><td>#1610302</td><td>1 kg, Pulver</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C2H5NO2, Molekulargewicht: 75,07 g/mol, Weißes kristallines Pulver, 5 kg</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, Molekulargewicht: 58,44 g/mol, 5 kg</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, Molekulargewicht: 119,98 g/mol, 500 g</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Lösung 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>ohne Calcium und Magnesium, 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm TC-behandelte Zellkulturschale</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#353002</td><td>60 mm Zellkulturschale, TC-behandeltes Polystyrol, 20/Packung, steril</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm x 15 mm Petrischale</td><td>Corning Life Sciences</td><td>#351007</td><td>Nicht TC-behandelte bakteriologische Petrischale, 20/Packung</td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatten</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 Well, flacher Boden (einzeln verpackt), gammabestrahlt, Wachstumsfläche 9,5 c</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; Gewebekulturflasche</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2; U-förmiger Zellkulturkolben mit abgeschrägtem Hals und Stopfendichtungskappe</td></tr><tr><td>Pierce & Trade; Protein L Plus Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, vernetzt 6% Agarose (CL-6B), Bindungskapazität: 10 bis 20 mg IgG</td></tr><tr><td>4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10-Well, 50 & Mikro; l, zur Verwendung mit Mini-PROTEAN-Elektrophoresezellen</td></tr><tr><td>Immobilon-P Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF, 0,45 &micro; m, 26,5 cm x 3,75 m Rolle</td></tr><tr><td>Anti-Polysialinsäure-NCAM Antikörper, Klon</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 Mikroliter, Wirt: Maus, monoklonales IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli Probenpuffer</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x vorgemischtes Protein Probenpuffer</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, 98 % rein, 14,2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidase-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 Mikroliter, 200 & Mikro; g/ml, 3.500 U/mg</td></tr><tr><td>25 mm Glasdeckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Kreise Nr. 1; Dicke: 0,13 bis 0,17 mm; Größe: 25 mm</td></tr><tr><td>HEPES-Pufferlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml, ohne Calcium, Magnesium, Phenol Red</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Cooperation</td><td>LS003119</td><td>lyophilisiertes Pulver, 100 mg</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma</td><td>M-2643-500G</td><td>Pulver, 500 g</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml, 200 mM&nbsp;</td></tr></tbody></table>

antikörper bindungsspezifität für kappa (v &amp; kgr;) leichte kette enthaltende human (igm) antikörper: polysialinsäure (psa) an ncam als fallstudie

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Antikörper des IgM-Isotyps werden oft als potentielle Therapeutika in Humanversuchen, Tiermodellen für menschliche Krankheiten sowie als Nachweismittel in Standardlabortechniken vernachlässigt. Im Gegensatz dazu zeigten mehrere humane IgMs einen Wirksamkeitsnachweis in Krebsmodellen und Modellen für ZNS-Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Gründe für ihre mangelnde Berücksichtigung sind unter anderem Schwierigkeiten bei der Expression, Reinigung und Stabilisierung von IgM-Antikörpern, die Herausforderung bei der Identifizierung von (Nicht-Protein-)Antigenen, eine geringe Affinitätsbindung und grundlegende Wissenslücken in der Kohlenhydrat- und Lipidforschung. 
Dieses Manuskript verwendet HIgM12 als Beispiel, um ein detailliertes Protokoll zum Nachweis von Antigenen durch Western Blotting, Immunpräzipitationen und Immunzytochemie bereitzustellen. HIgM12 zielt auf Polysialinsäure (PSA) ab, die an das neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) gebunden ist. Frühes postnatales Hirngewebe von Mäusen aus dem Wildtyp (WT) und NCAM-Knockout (KO), denen die drei wichtigsten Spleißvarianten des Zentralnervensystems (ZNS) NCAM180, 140 und 120 fehlten, wurde verwendet, um die Bedeutung von NCAM für die Bindung an HIgM12 zu bewerten. Die weitere enzymatische Verdauung von ZNS-Gewebe und kultivierten ZNS-Zellen mit Hilfe von Endoneuraminidasen führte dazu, PSA als spezifisches Bindungsepitop für HIgM12 zu identifizieren.

Dieser Abschnitt veranschaulicht Beispiele von Ergebnissen, die durch das Studium menschlicher IgM-spezifischen PSA-Antigene im ZNS erhalten werden kann. Die Verwendung von menschlichen IgM-Antikörpern mit spezifischen Leichtketten V &amp; kgr; in biochemisch-Einstellungen und durch Fluoreszenz Immunzytochemie gezeigt. HIgM12 immunopräzipitiert sein Antigen von zerebralen Hirn Lysaten und fungiert als Agent (primärer Antikörper) in Western-Blots nachzuweisen. Weder Isotypkontrollantikörper noch Agarose L Perlen Immunpräzipitation ein ähnliches Antigen, das die Spezifität des Pull - Down (Abbildung 1) zeigt. Western - Blots unter Verwendung von CNS Lysaten von WT und NCAM KO - Mäusen zeigen die Spezifität von HIgM12-Bindung an PSA-NCAM enthält (2A). Die enzymatische Verdauung von ZNS - Gewebe von WT - Mäusen mit ENDO-NF identifiziert PSA an NCAM als die spezifische Bindung Epitop für HIgM12 (2B). Unter Verwendung des Verfahrens , die hier beschrieben, IBA-1-positive Ratte Mikroglia - Kulturen von hoher Reinheit erhalten (Abbildung 3). Im Handel erhältliche Anti-PSA-Antikörper (Klon 2-2B) beschriften nicht Zelloberfläche oder interne PSA-Pools in fixiert und permeabilisiert IBA-1-positive Mikroglia-Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie. In Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Literatur, die berichtet , keine Zelloberflächenexpression von PSA-NCAM in Mikroglia 16,41 HIgM12 nicht Zelloberflächenantigene in gereinigter Ratten - Mikroglia nicht beschriften. Interessanterweise HIgM12 Kennzeichnung fixiert und permeabilisiert Mikroglia führt zu einer intrazellulären, perinukleären Muster , das nicht auf spezifische Organellen beschränkt ist (Abbildung 3). Ergebnisse sind im Gegensatz zu denen ein Anti-PSA - IgG - Antikörper , erhalten unter Verwendung (Klon 735) 26, die auf der Ebene des Golgi - 41 PSA-SynCAM in Mikroglia abzielt. Im Gegensatz zu Mikrogliazellen, HIgM12und A2B5 Zielzellenoberflächenantigene in hoch angereicherter Ratte OPC Kulturen unter Lebendzellbedingungen (Abbildung 4). OPC - Kulturen enthalten ~ 5% Mikroglia - Zellen kontaminiert. 5 veranschaulicht eine nahezu identische Zelloberflächenfärbungsmuster zwischen HIgM12 und anti-PSA mAb (Klon 2-2B) in GFAP-positive Astrozyten (5A). Immunofluoreszenz - Markierung von ENDO-NF-verdaute WT Astrozyten verglichen mit Kontrolle behandelten WT Astrozyten zwischenzuspeichern Verwendung HIgM12 das Vorhandensein von Astrozyten PSA (5B) zeigt. Das Vorhandensein von PSA-positive Astrozyten in vivo muss noch bestätigt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> Abbildung 1: HIgM12 fungiert als &quot;Pull-down&quot; Agent in Immunpräzipitationen Immunpräzipitationen von insgesamt Gehirn Lysat von drei Monate alten Mäusen mit HIgM12, menschliche Isotypenkontrolle HIgM.126 oder Agarose L Perlen nur als &quot;pull down&quot; Agenten. Die eluierten Proteine ​​wurden in Western-Blots mit Membranen sondiert gegen HIgM12 laufen. Molekulargewichte von eluierten Proteine ​​aus HIgM12 beschichteten Kügelchen waren im Bereich von 160-200 kDa zusätzlich zu der IgMs schweren Kette (~ 65-73 kDa). Diese Zahl wurde von J. geändert Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> Abbildung 2: HIgM12 Ziele der Polysialinsäure (PSA) -Einheit auf NCAM. A. Hirnhomogenate von P7, P13, P16 und P27 NCAM insgesamt KO - Mäuse und heterozygote littermate Kontrollen wurden in Western - Blots mit Membranen gegen HIgM12, PSA und β-Aktin als Ladekontrolle sondiert laufen. <strong&gt; B. 10 ug adulter WT Mausgehirn - Lysat in 1% NP40 in PBS, pH 6,5 wurde mit endoneuraminidase behandelt N (ENDO-N) (exo) mit Neuraminidase α2-3 Polysialsäure Polymer Spezifität (Sialidase) oder PBS über Nacht bei 37 ° C, als Dubletten in Western-Blots laufen und sondiert gegen HIgM12, PSA und β-Aktin als Ladekontrolle. Diese Zahl wurde von J. geändert Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die Abwesenheit von PSA auf Ratten - Mikroglia wird durch einen Mangel an HIgM12 Labeling Gespiegelte Ratte Mikroglia für 48 Stunden auf Poly-D-Lysin beschichtete Glasplättchen und entweder markiert live auf Eis mit HIgM12 oder nach der Fixierung mit HIgM12 oder anti kultiviert. -PSA mAb (Klon 2-2B). Zellen wurden triple mit Mikroglia Marker IBA-1 (grün) markiert, HIgM12 / PSA (rot) und DAPI (blau). Bilder zeigen Mangel an Mikroglia-Zelloberfläche mit HIgM12 (obere Reihe) und das Fehlen von anti-PSA-Bindung (Klon 2-2B) auf der Zelloberfläche und internen Speicher in primären Ratten-Mikroglia (untere Reihe) verbindlich. Basierend auf bipolare Morphologie und das Fehlen von IBA-1-Färbung, die kleine PSA-positive Zelle (untere Reihe) wurde vorgeschlagen, ein OPC zu sein. In fixierten Zellen führte HIgM12 Färbung in einem punktualisierte, perinukleären Muster , das nicht auf bestimmte Organellen beschränkt wurde und unspezifische Bindung (mittlere Reihe) betrachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> Abbildung 4: HIgM12 Targets Zelloberfläche PSA-NCAM auf Rat OPCs Rat OPCs und Mikroglia waren cultu.rot für 4 Tage in Proliferationsmedium auf Poly-D-Lysin beschichteten Glasplättchen und dreifach live auf Eis mit HIgM12 oder A2B5 (grün), interne Makrophagen / Monozyten-Marker CD68 (Klon ED-1) (rot) und DAPI (blau) gekennzeichnet . Bilder zeigen Zellpopulationen majorly positiv für OPC-Marker A2B5 (obere Reihe) und HIgM12 (untere Reihe) mit wenigen CD68-positive Mikroglia (~ 5%). Phasenkontrast und DAPI Bilder wurden hinzugefügt , um die Integrität der Zelle und Zellzahlen für jede Population zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> Abbildung 5: HIgM12 und Anti-PSA - mAb eine Astrozytäre Subpopulation in Maus Mixed Glia Co-beschriften. A. Maus gemischten Gliazellen von WT und NCAM insgesamt KO Tiere Astrozyten, Oligodendrozyten-Linie Zellen und microg enthältlia waren für 3 Tage kultiviert und live auf Eis mit HIgM12 (grün), Anti-PSA-mAb (Klon 2-2B) (rot) und anschließend für astrozytären Marker GFAP (lila) und DAPI (blau) markiert. HIgM12 und anti-PSA zeigen eine virtuelle identische Färbemuster auf GFAP-positive Astrozyten WT aber an kultivierte Astrozyten von NCAM KO-Mäusen ermangeln Bindung. Diese Zahl wurde von J. geändert Neurochem. 15. B. Misch Gliazellen wurden identisch kultiviert wie unter A. beschrieben und über Nacht mit endoneuraminidase-NF (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Martina Muehlenhoff) oder PBS - Kontrolle behandelt. Die Zellen wurden live auf Eis mit HIgM12 (grün) und anschließend gefärbt für interne Marker GFAP (rot) und DAPI (blau) markiert. HIgM12 zielt auf Zelloberflächenantigene auf PBS-Kontrolle gemischten Glia-Kulturen behandelt, aber nicht endoneuraminidase-NF gemischten Glia behandelt. Diese Zahl wurde von JNSCI modifiziert 16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Pl</a>erleichtern klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Alle Bilder wurden mit 60facher Vergrößerung unter Verwendung der gleichen Geräteeinstellungen und verarbeitet identisch übernommen. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> Tabelle 1:. Buffer und Lösung Rezepte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">diese Tabelle zu laden.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> ZNS - Gewebe </td><td> ENDO-NF / PBS </td><td> Lysepuffer </td><td> Volle Lautstärke </td></tr><tr><td> 1. WT Maus </td><td> 67 &amp; mgr; g (0,45 &amp; mgr; l) </td><td> 2 ul (12 ug) ENDO-NF </td><td> 7,55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 2. WT Maus </td><td> 67 &amp; mgr; g (0,45 &amp; mgr; l) </td><td> 2 &amp; mgr; l PBS </td><td> 7,55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 3. WT Maus </td><td> 67 &amp; mgr; g (0,45 &amp; mgr; l) </td><td> kein PBS oder ENDO-NF </td><td> 9,55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 4. NCAM KO Maus </td><td> 67 &amp; mgr; g (0,45 &amp; mgr; l) </td><td> 2 ul (12 ug) ENDO-NF </td><td> 7,55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 5. NCAM KO Maus </td><td> 67 &amp; mgr; g (0,45 &amp; mgr; l) </td><td> 2 &amp; mgr; l PBS </td><td> 7,55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 6. NCAM KO Maus </td><td> 67 &amp; mgr; g (0,45 &amp; mgr; l) </td><td> kein PBS oder ENDO-NF </td><td> 9,55 ul </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: ENDO-NF Verdauung von ZNS - Gewebe von P7 WT und NCAM KO - Mäuse.

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung von Proteineinheiten, die Antigene für IgM-Antikörper von Mensch und Maus mit spezifischen Kappa (Vκ) Leichtketten enthalten. Dieses Protokoll ist nicht auf Antikörper der IgM-Klasse beschränkt, sondern gilt für alle Immunglobulin-Isotypen, die bei Immunpräzipitationen mit ausreichend hoher Affinität auf ihr Antigen abzielen.

Antikörper Bindungsspezifität für Kappa (V &amp; kgr;) Leichte Kette enthaltende Human (IgM) Antikörper: Polysialinsäure (PSA) An NCAM als Fallstudie

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Antigene für Antikörper mit therapeutischem Potenzial zu identifizieren, wobei der Fokus auf der IgM-Isotypklasse liegt. Diese Methode schließt eine Wissenslücke im biomedizinischen Bereich und könnte zur Entdeckung neuartiger Biomarker sowie immuntherapeutischer Wirkstoffe für die Krebsforschung und Erkrankungen des zentralen Nervensystems beitragen. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie den Zugang zu einer bisher vernachlässigten Klasse von Antikörpern mit hohem therapeutischem Potenzial ermöglicht.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose und Behandlung aller Krankheiten, die mittels antikörperbasierter Therapeutika gezielt behandelt werden können. Dieses Verfahren kann Einblicke in Antigene von IgM-Antikörpern sowie in wachsendes Gewebe und Unterpopulationen liefern. Es kann zudem für andere Antikörperisotypen aller Spezies von Nutzen sein.Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals, als mir die spezifische und auffällige Bindung des IgM-Antikörpers in verschiedenen biochemischen Anwendungen auffiel. Den Ablauf wird Robert Kahoud und Jens Watzlawik demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, führen Sie einen Schnitt am Schädel in Richtung vorn auf Höhe des Ohres durch und klappen Sie den Schädel zurück.Danach das Gehirn vorsichtig in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben und sofort auf Trockeneis lagern. Nach fünf Minuten das Gehirn auf ein sauberes Wägepapier überführen und mit einer sauberen Rasierklinge schnell das Kleinhirn und den Hirnstamm entfernen. Anschließend das gefrorene Großhirn wiegen, bevor es wieder in das 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführt wird.Fügen Sie eiskalte Lysepufferlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 150 Mikrogramm Gehirngewebe pro Mikroliter Lysepuffer zu erreichen. Anschließend homogenisieren Sie das Gehirn in der Lysepufferlösung durch Trituration über eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, gefolgt von einer Trituration durch eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Danach inkubieren Sie das Gehirnlysat weitere 30 Minuten auf Eis, um eine vollständige Gewebelyse zu ermöglichen.Nach 30 Minuten Detergens, unlösliches Material und Gehirnlipide durch serielle Zentrifugation entfernen. Den Pellet, der Myelin und Zelltrümmer enthält, verwerfen, aber das Überstand nach jedem Zentrifugationsschritt aufbewahren. Das Gehirnlysat aliquotieren und bei 80 Grad Celsius lagern.In diesem Schritt bereiten Sie 200 Milliliter IP-Puffer mit BSA und weitere 200 Milliliter IP-Puffer ohne BSA vor. Für die Immunpräzipitationsreaktion überführen Sie 100 Mikroliter Protein-L-Agarose-Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie ein Milliliter IP-Puffer mit BSA in das Röhrchen.Anschließend manuell durch Inversion mischen. Danach die Protein-L-Agarose-Kügelchen viermal durch Zentrifugation waschen. Danach das Überstand entfernen, ohne den Agarose-Pellet zu stören, und den Waschvorgang noch dreimal wiederholen.Fügen Sie dann frischen IP-Puffer mit BSA zu der Protein-L-Agarose hinzu und inkubieren Sie die Mischung über Nacht auf einem Rollapparat bei vier Grad Celsius. Geben Sie in 800 Mikroliter IP-Puffer mit BSA und 30 Milligramm lysiertem Hirngewebe 20 Mikrogramm experimentellen Antikörper, Kontrollantikörper oder PBS. Inkubieren Sie 30 Milligramm lysiertes Hirngewebe in eiskaltem IP-Puffer mit IgM-Antikörper in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag die Protein-L-Agarose-Kügelchen in einer Tischzentrifuge abzentrifugieren. Das Überstandsvolumen verwerfen, ohne das Agarose-Pellet zu stören. Anschließend die gekühlte Antikörper-Hirn-Lysatlösung zur Protein-L-Agarose hinzufügen.Die Antikörper-Antigen-Protein-L-Agarose-Suspension zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Rollapparat inkubieren. Nach zwei Stunden das an Agarose L gebundene Antikörper-Antigen-Komplex durch Zentrifugation waschen. Das Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Pellet zu stören, und ein Milliliter eiskaltes IP-Puffer mit 0,2 % BSA hinzufügen.Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal mit eiskaltem IP-Puffer, der 0,2 % BSA enthält, und zwei zusätzliche Male mit eiskaltem IP-Puffer ohne BSA. Danach zentrifugieren Sie den an Agarose L gebundenen Antikörper-Antigen-Komplex. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um das Überstandsvolumen abzudecken, bis etwa 50 Mikroliter der Lösung auf dem Protein-L-Agarose-Pellet verbleiben. Entfernen Sie diesen Rest dann vollständig mit einer 10-Mikroliter-Pipette.Halten Sie alle Proben auf Eis. Geben Sie anschließend 40 µL IP-Elutionspuffer in jedes 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Schlagen Sie das Röhrchen sechsmal mit dem Finger an und erhitzen Sie es fünf Minuten lang auf 95 °C.Anschließend das Probenmaterial zwei Minuten auf Eis stellen und 30 Sekunden lang zentrifugieren. Danach 35 Mikroliter des Überstandes in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, wobei das Pellet nicht gestört werden darf. Als Nächstes die Abwesenheit von Protein-L-Agarose-Kügelchen bestätigen, indem eine kleine Menge der verdünnten Probe an der inneren Röhrchenwand abgespült wird.Befinden sich Protein-L-Agarose-Kügelchen im Ansatz, wird die Probe weitere 30 Sekunden bei 13.000 × g zentrifugiert und das Überstand in ein sauberes Röhrchen überführt. Dieser Schritt wird wiederholt, bis keine Agarose-Kügelchen mehr nachweisbar sind. Anschließend werden pro Brunnen 10–20 Mikroliter verdünnter Probe auf ein SDS-Polyacrylamidgel mit Tris-Glycin-SDS-Puffer aufgetragen und das Gel etwa eine Stunde lang bei 100 Volt auf dem Laborpult ohne zusätzliche Kühlung durchlaufen. Anschließend übertragen Sie die Proteine auf eine PVDF-Membran. Die Proteine werden zweieinhalb Stunden lang bei 100 Volt im Kühlschrank mit kaltem Transferpuffer übertragen. Blocken Sie die Membran eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius auf einem schwenkenden Laborschüttler mit 10 % (Gewicht pro Volumen) Trockenmilchpulver in PBS-T.Zweimal mit PBS-T waschen, jedes Mal 10 Minuten lang. Die Membran mit dem Primärantikörper in 5 % BSA in PBS-T inkubieren. Über Nacht in der Kühlkammer auf einem Rotationsrührer inkubieren.Am nächsten Morgen die Membran einmal mit überschüssigem PBS-T bei 25 Grad Celsius waschen, gefolgt von drei weiteren Waschungen mit PBS-T jeweils zehn Minuten lang auf einem Rotationsschüttler. Danach sekundären Antikörper und 5 % Trockenmilchpulver in PBS-T zur Membran geben und eine Stunde bei 25 Grad Celsius auf einem Rotationsschüttler inkubieren. Anschließend die Membran erneut einmal mit überschüssigem PBS-T bei 25 Grad Celsius waschen, gefolgt von drei weiteren Waschungen mit PBS-T jeweils zehn Minuten lang auf einem Rotationsschüttler.Mischen Sie ein Milliliter gekühltes Substrat A der verbesserten Chemilumineszenz-HRP mit einem Milliliter Komponente B bei 25 Grad Celsius. Legen Sie die Membran auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Danach trocknen Sie den Behälter mit Papiertüchern ab, bevor Sie die Membran zurück in den Behälter geben.Unmittelbar zwei Milliliter des vorgemischten, verbesserten Chemilumineszenz-HRP-Substrats auf die Membran geben und zwei Minuten bei 25 Grad Celsius inkubieren. Den Behälter alle 20 Sekunden von Hand leicht kippen, um die Membran gleichmäßig zu benetzen. Danach die Membran in eine transparente Plastikhülle überführen und überschüssige Flüssigkeit sowie Luftblasen mit Papiertüchern entfernen.Befestigen Sie die Kunststoffhülle mit Klebeband in der Kassette und schließen Sie diese. Diese Abbildung zeigt, dass HigM12 sein Antigen aus lysierten zerebralen Gehirnproben anreichert und als Detektionsmittel in Western Blots fungiert. Weder das Isotyp-Kontrollantikörper noch Agarose-L-Kügelchen reichern ein ähnliches Antigen an, was die Spezifität der Anreicherung belegt.Hier zeigen Western Blots unter Verwendung von ZNS-Lysaten aus Wildtyp- und NCAM-Knockout-Mäusen die Spezifität der HIgM-Bindung an PSA-haltiges NCAM. Die enzymatische Verdauung von ZNS-Gewebe aus Wildtyp-Mäusen mit ENDO-NF identifiziert PSA, das an NCAM gebunden ist, als spezifisches Bindungsepitop für HIgM12. Mit der hier beschriebenen Methode werden IBA-1-positive Ratten-Mikroglia-Kulturen hoher Reinheit erhalten. Im Gegensatz zu Mikroglia waren die von HIgM12 und A2B5 erkannten Zelloberflächenantigene unter lebenden Zellbedingungen in Ratten-OPC-Kulturen stark angereichert.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von 13 Arbeitstunden durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Biacore oder die Oberflächen-Plasmonenresonanz-Technologie eingesetzt werden, um die Bindungsaffinitäten von Antikörpern hinsichtlich Assoziations- und Dissoziationskonstanten zu bestimmen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Krebsforschung, der Immuntherapien und der natürlichen Autoantikörper, um Kohlenhydrat-Epitope an Proteinen als Antigene für therapeutische IgM-Antikörper beim Menschen zu identifizieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glykoprotein-Antigene für Forschungsarbeiten identifiziert, die humane IgM-Antikörper enthalten. Die Daten liefern ein neues Ziel für die MS-Therapie. PSA ENCAP, die von uns entwickelte Antikörperbehandlung, gehört zu den ersten, die eine funktionelle Verbesserung in einer Aktivitätsbox unter Verwendung des strengen Modells zeigen, das in der Krankheit und einer krankheitsähnlichen Entwertung vorliegt, wie bei Multipler Sklerose.

antibody-binding-specificity-for-kappa-v-light-chain-containing-human

Research

Forschung

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Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine ​​verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung von zwei monoklonalen Antikörpern (mAbs) der IgG-Klasse, die stark auf Myoglobin von Walen reagieren. Diese mAbs werden auf einen kolloidalen immunchromatographischen Goldteststreifen aufgebracht, der auf dem Sandwichformat basiert, um das Mb von Walen und Delfinen von Robben und anderen Tieren zu unterscheiden.

Entwicklung eines Kolloidales-Gold-basierten Immunchromatographischer Teststreifen zum Nachweis von Cetacean Myoglobin

Hier präsentieren die Autoren ein einfaches und effizientes Protokoll zur Definition eines linearen antigenen Epitops unter Verwendung eines gereinigten monoklonalen Antikörpers und Peptid-Scans durch Dot-Blot-Hybridisierung. Das identifizierte Epitop kann dann in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen eingesetzt werden.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine bispezifische Antikörper GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Die gereinigte GPC3-S-Fab hat potente Zytotoxizität gegen GPC3 positive Leberkrebs Zellen.

Ein GPC3-targeting Bispezifische Antikörper, GPC3-S-Fab, mit potenten Zytotoxizität

Ansätze für die biophysikalischen und strukturelle Charakterisierung von Glykoproteinen präsentieren wir mit der Immunglobulin-Falte Biolayer Interferometrie, Isothermen Titration Kalorimetrie und Röntgen-Kristallographie.

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

Die genetische Codeerweiterung wird für die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure angewendet, die eine biorthogonale funktionelle Gruppe auf einem Trägerprotein an einem definierten Ort trägt. Die biorthogonale Funktion wird weiter für die standortselektive Kopplung eines Kohlenhydratantigens verwendet, um einen homogenen Glykonokjugate-Impfstoff bereitzustellen.

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Hierbei wird ein Verfahren beschrieben, um die Bindungsaffinität (KD) von radioaktiv markierten Antikörpern an immobilisierte Antigene zu bestimmen. KD ist die Gleichgewichtsdissoziationskonstante, die aus einem Sättigungsbindungsexperiment bestimmt werden kann, indem die gesamte, spezifische und unspezifische Bindung eines radioaktiv markierten Antikörpers in verschiedenen Konzentrationen an sein Antigen gemessen wird.

Bestimmung der Bindungsaffinität (KD) von radioaktiv markierten Antikörpern gegen immobilisierte Antigene

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Erfahren Sie, wie man Antigene für therapeutische IgM-Antikörper identifiziert. Diese Methode nutzt Immunpräzipitation und Western Blotting mit Gehirngewebe, um neue Biomarker für Krebs und Erkrankungen des ZNS zu finden.

Antikörper Bindungsspezifität für Kappa (V and kgr;) Leichte Kette enthaltende Human (IgM) Antikörper: Polysialinsäure (PSA) An NCAM als Fallstudie (Video) | JoVE Journal

Antikörper Bindungsspezifität für Kappa (V & kgr;) Leichte Kette enthaltende Human (IgM) Antikörper: Polysialinsäure (PSA) An NCAM als Fallstudie

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