Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut
16. April 2016
Dieses Protokoll zeigt, wie eine femtomolare Nachweisempfindlichkeit von Proteinen in 10 μl Vollblut innerhalb von 30 min erreicht werden kann. Dies kann durch die Verwendung von elektrogesponnenen Nanofasermatten erreicht werden, die in eine Lab-on-a-Disc integriert sind und eine große Oberfläche sowie effektives Mischen und Waschen für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bieten.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Nachweisempfindlichkeit von ELISA unter Verwendung natürlicher gesponnener Nanofasern zu verbessern. Dieses Video zeigt, wie eine femtomolare Nachweisempfindlichkeit von Proteinen in 10 Mikrolitern Vollblutproben innerhalb von 30 Minuten erreicht werden kann. Bei einer Lab-on-a-Disc-Plattform wird die Zentrifugalkraft genutzt, um die Flüssigkeit durch die Kammern zu befördern, und der gesamte Prozess ist vollständig automatisiert.
Die Detektionsempfindlichkeit könnte durch die Integration von Nanofasern stark erhöht werden. Das Problem war allerdings, dass die Nanofaser sehr zerbrechlich und schwer zu handhaben ist. In diesem Video stellen wir ein einfaches Verfahren vor, um zerbrechliche Titandioxid-Nanofasermatten auf einer Kunststoffscheibe zu befestigen.
Um Titandioxid-Nanofasermatten auf Silikonsubstrat durch Elektrospinnen herzustellen, wird das Silikonsubstrat zunächst silanisiert, mit PDMS beschichtet und vorgehärtet. Eine Nanofasermatte wird dann auf dieses vorgehärtete PDMS übertragen und dieses Produkt wird gestanzt, um ein kreisförmiges Stück für die Befestigung herzustellen. Beschichten Sie die Reaktionskammer mit einem Tropfen PDMS als Klebstoff und befestigen Sie das kreisförmige Stück am Boden der Kammer.
Härten Sie dann das PDMS im Ofen aus. Setzen Sie abschließend die Disc-Schichten zu einem kompletten Gerät für ELISA zusammen. Diese Nanofaser-Transfertechnik ermöglicht es uns, die große Oberfläche von Nanofasern für die Bioanalytik zu nutzen.
Das zentrifugale mikrophylitische Gerät bietet die vollständige Integration und Automatisierung aller für ELISA erforderlichen Prozesse. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden besteht darin, dass sie femtomolare Konzentrationen von Proteinen aus nur 10 Mikrolitern Vollblut nachweisen kann. Bereiten Sie die Vorläuferlösungen vor, wie im beigefügten Prüfprotokoll beschrieben.
Laden Sie dann die Lösung in den Elektrospinner und stellen Sie die Nanofasern durch Elektrospinnen unter den optimalen Bedingungen her. Wenn die Polymer-Nanofasermatten vorbereitet sind, kalzinieren Sie sie in einem Ofen unter Vakuum. Nach der Kalzinierung werden schließlich die Titandioxid-Nanofasermatten vorbereitet.
Bereiten Sie das mikrophylitische Layout mit Hilfe von 3D-Konstruktionssoftware wie SOLIDWORKS vor und übertragen Sie die Konstruktion auf die CNC-Fräsmaschine. Bedienen Sie die CNC-Fräsmaschine, um die Scheibe mit Kanälen und Kammern herzustellen. Die Scheibe und die Nanofasermatte sind nun bereit für die Integration.
Bereiten Sie eine Vakuumkammer, Silikonsubstrat und Fluorsilan vor. Silanisieren Sie das Silikonsubstrat 30 Minuten lang unter Vakuum mit Fluorsilan. Bereiten Sie das Gast-PDMS vor, indem Sie das Prepolymer mit einem Härter im Verhältnis 10 zu eins vorbereiten und die Beschichtung auf das silanisierte Silikonsubstrat bei 650 U/min für 60 Sekunden aufwirbeln.
Härten Sie das auf dem silanisierten Wafer beschichtete PDMS 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius aus, um es haftend zu machen. Übertragen Sie nun diese Nanofasermatten auf das PDMS-beschichtete Silikon, indem Sie mit einem flachen Gegenstand, z. B. einem Objektträger, entsprechenden Druck ausüben. Backen Sie die Probe eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius, um den Klebstoff PDMS vollständig auszuhärten.
Geben Sie ein paar Tropfen Ethanol auf die Nanofasermatten, die auf der PDMS-Schicht befestigt sind, und bohren Sie mit einem PunchIt ein Loch mit einem Durchmesser von sechs Millimetern. Ziehen Sie dann die gestanzten Nanofasermatten, die auf dem PDMS befestigt sind, vom Silikonsubstrat ab. Beschichten Sie als Nächstes die Bindungsreaktionskammer in der Scheibe mit etwa 20 Mikrolitern PDMS-Gemisch und platzieren Sie die auf dem PDMS befestigten Nanofasern in den Kammern.
Inkubieren Sie dann die in die Nanofasermatte integrierte Scheibe eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Lösung von GPDES mit 1 Vol.-% in Ethanol vor. Behandeln Sie dann die Nanofasern in der Scheibe mit Sauerstoffplasma.
GebenSie 100 Mikroliter GPDES-Lösung auf jede Nanofasermatte und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Behälter. Entfernen Sie nach der Inkubation die GPDES-Lösung, indem Sie mit der Scheibe auf einen Wischer klopfen. Mit Ethanol waschen, herausnehmen und eine Stunde bei 80 Grad Celsius backen.
Nach dem Backen mit Ethanol waschen und zum Entfernen klopfen. Diesen Vorgang wiederholen und mit einem Stickstoffstrahl trocken föhnen. Für die Immobilisierung von Antikörpern ist verdünnte eingefangene Antikörperlösung zu dispensieren.
Bewahren Sie die Scheiben in einer befeuchteten Kammer auf und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad. Waschen Sie die restliche Lösung mit Waschpuffer ab. Montieren Sie nun die Scheibe mit einem doppelseitigen Klebeband.
Üben Sie angemessenen Druck aus, um die Schichten zu einer vollständigen Scheibe zusammenzusetzen. Füllen Sie die Bindungsreaktionskammern mit Blockierungspuffer und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Scheibe zweimal mit Waschpuffer und lagern Sie die Scheibe bis zur Verwendung bei 40 Grad Celsius.
Laden Sie die Reagenzien, Waschpuffer und 10 Mikroliter Vollblut in die Reagenz- und Probenkammern. Legen Sie die Disc in eine speziell angefertigte Visualisierungsmaschine für den automatisierten Immunoassay. Das Visualisierungssystem besteht aus einem Rotor, der mit einem Computer für den automatisierten Disc-Betrieb verbunden ist, zusammen mit einem Stroboskoplicht und einer CCD-Kamera für die Bildaufnahme.
Drehen Sie die Scheibe 60 Sekunden lang mit 3.600 U/min, um die roten Blutkörperchen zu trennen. Mischen Sie Plasma mit den Nachweisantikörpern. Übertragen Sie das Gemisch in die Reaktionskammer, in die die Titandioxid-Nanofasermatte integriert ist.
Waschen Sie die Nanofasern nach der Immunreaktion, indem Sie den Waschpuffer in die Reaktionskammer überführen. Übertragen Sie dann die chemilumineszierende Substratlösung in die Bindungsreaktionskammer und inkubieren Sie sie eine Minute lang in einem Mischmodus. Übertragen Sie abschließend die umgesetzte Substratlösung in die Detektionskammer.
Wenn die gesamte Reaktion abgeschlossen ist, übertragen Sie die Scheibe auf ein Detektionssystem und lesen Sie das Chemilumineszenzsignal mit Hilfe einer speziell entwickelten Software aus. Der Disc-Betrieb und das Detektionssystem können in einer einzigen Plattform integriert werden. Durch die Optimierung der Spannung und des Fluorats wurden gleichmäßige Nanofasermatten erhalten, wie in diesem REM-Bild zu sehen ist.
Um die Aushärtezeit des PDMS zu optimieren, wurde die Adhäsionskraft gemessen. War sie zu kurz, wurde die Nanofasermatte in PDMS eingebettet, oder bei zu langer Länge abgezogen. Nach der Optimierung wurde die Nanofasermatte dann stabil auf dem PDMS befestigt.
Der lineare Bereich für den Nachweis von C-reaktiven Proteinen von zwei Plattformen ist in dieser Grafik dargestellt. Mit dem Nanofaser-Integritätslabor auf der Disc konnten wir innerhalb von 30 Minuten eine stark verbesserte Nachweisempfindlichkeit von C-reaktivem Protein aus nur 10 Mikrolitern Serum erreichen. Derzeit verfügbare Technologien, wie z. B. der plattenbasierte 96-Well-ELISA, erfordern ein größeres Probenvolumen und eine längere Nachweiszeit.
Insgesamt zeigte der in Nanofasern integrierte scheibenbasierte ELISA einen breiten, dynamischen Bereich von sechs Größenordnungen mit einer Nachweisgrenze von sechs Femtomol des C-reaktiven Proteins. Diese Nachweisempfindlichkeit, unterstützt durch die hohe Oberfläche der in die Scheibe integrierten Nanofaser, übertraf die des herkömmlichen ELISA, der auf 2.000 Femtomol begrenzt war. Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein zentrifugales mikrophylitisches Gerät vorbereitet, wie man phasale Nanofasern integriert und wie man den Proteinnachweis mit ELISA durchführt.
Diese Technik kann nützlich sein, um niedrig gebundene Proteine in einer sehr kleinen Menge biologischer Proben nachzuweisen.
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Übersicht
Dieses Protokoll zeigt, wie eine Nachweisempfindlichkeit im Femtomolarbereich für Proteine in 10 µL Vollblut innerhalb von 30 Minuten erreicht werden kann. Die Methode nutzt elektrogesponnene nanofasrige Matten, die in eine Lab-on-a-Disc-Plattform integriert sind, und verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis durch effektives Mischen und Waschen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biotechnologie
- Proteinnachweis
- Nanotechnologie
Hintergrund
- ELISA ist eine gängige Methode zum Nachweis von Proteinen.
- Die Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit ist entscheidend für genaue Diagnosen.
- Natürliche gesponnene Nanofasern können die Empfindlichkeit erhöhen, sind jedoch zerbrechlich.
- Automatisierte Lab-on-a-Disc-Systeme können den Prozess vereinfachen.
Zweck der Studie
- Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit des ELISA.
- Veranschaulichung der Verwendung von Nanofasern in einer Lab-on-a-Disc-Anordnung.
- Bereitstellung einer Methode zum Umgang mit empfindlichen Nanofasermatten.
Verwendete Methoden
- Integration von Titandioxid-Nanofasermatten auf einer Kunststoffscheibe.
- Verwendung der Zentrifugalkraft zum Durchführen von Flüssigkeiten durch Kammern.
- Automatisierung des gesamten Nachweisverfahrens.
- Bewertung der Nachsempfindlichkeit in Vollblutproben.
Hauptergebnisse
- Erreichte femtomolare Empfindlichkeit für die Proteindetektion.
- Zeigte effektive Misch- und Waschfähigkeiten.
- Belegte die Machbarkeit der Verwendung empfindlicher Nanofasern in einer praktischen Anwendung.
- Bestätigte den automatisierten Prozess für eine schnelle Analyse.
Schlussfolgerungen
- Die Integration von Nanofasern verbessert die Nachweisempfindlichkeit erheblich.
- Die Lab-auf-einer-Scheibe-Technologie bietet einen aussichtsreichen Ansatz für Proteinanalysen.
- Diese Methode kann für verschiedene diagnostische Anwendungen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Technologie adressiert das entscheidende Erfordernis einer ultrasensitiven Proteindetektion in klinischen Proben geringen Volumens und ermöglicht die frühe Entdeckung von Biomarkern aus minimalen Mengen Vollblut. Durch die Integration elektrogesponnener Nanofasern in eine zentrifugale mikrofluidische Plattform erreicht sie eine Sensitivität im Femtomolarbereich innerhalb von 30 Minuten und verbessert damit die Nachweisgrenze im Vergleich zum konventionellen ELISA erheblich. Dieser Fortschritt unterstützt die Target-Validierung und die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, indem er falsch-negative Ergebnisse bei der Screening-Analyse von Proteinen mit geringer Häufigkeit verringert, was direkte Auswirkungen auf die präklinische Risikominderung und die Priorisierung von Portfolioentscheidungen hat.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Proteinen mit geringer Häufigkeit in Vollblut und verbessert so die Zuverlässigkeit von Zielprotein-Krankheits-Assoziationen.
- Operationaler Wert: Reduziert den Probenverbrauch auf 10 µL und ermöglicht es, wertvolle klinische Proben in mehreren Assays parallel zu verwenden.
- Prädiktiver Wert: Die Nachweisgrenze im Femtomolarbereich verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis und unterstützt eine zuverlässigere Biomarker-Quantifizierung in Entdeckungsworkflows.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine standardisierte, automatisierte Plattform für die Entwicklung von Immunoassays mit reproduzierbarem Fluidhandling und Vermischung.
- Operativer Wert: Eliminiert manuelle Pipettierschritte, verringert die Variabilität und erhöht den Durchsatz bei Antikörperscreening-Kampagnen.
- Assay-Einsatzbereitschaft: Ermöglicht multiplexierte Analysen mit minimalem Reagenzverbrauch und erleichtert die panelbasierte Zielvalidierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem eine konsistente Proteinquantifizierung über verschiedene Probentypen und -volumina hinweg ermöglicht wird.
- Risikominderung: Hohe Empfindlichkeit verringert die Wahrscheinlichkeit, frühe pharmakokinetische oder pharmakodynamische Signale in Krankheitsmodellen zu übersehen.
- Präklinische Anwendbarkeit: Kompatibel mit geringen Blutvolumina von Kleintieren und somit geeignet für Längsschnittstudien ohne terminale Probennahme.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die hypothesengetriebene Zielvalidierung durch quantitative Proteindetektion in klinisch relevanten Matrizes.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die mechanistische Entlastung durch den Nachweis von wegweisspezifischen Biomarkern in Vollblut und verbessert so das Vertrauen in das Zielmolekül.
- Screening: Bietet immunologische Assay-Leistung, die für die Automatisierung geeignet ist, mit präziser Flüssigkeitsdosierung und Waschschritten, was für die reproduzierbare Validierung von Treffern unerlässlich ist.
- Analytik: Erzeugt quantitative chemilumineszente Signale über sechs Größenordnungen hinweg und ermöglicht somit einen genauen Vergleich der Proteinexpression unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Biomarker-Korrelation durch den Nachweis klinisch relevanter Proteine (z. B. CRP, cTnI) in minimal aufbereitetem Blut.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Labor-auf-einer-Scheibe-Konzept ermöglicht die Anpassung der Plattform auf verschiedene Immunassays und fördert so die Standardisierung von Reagenzien und Arbeitsabläufen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung durch verbesserte Nachweisgrenzen und dynamische Messbereiche.
- Operationaler Wert: Vollständige Automatisierung reduziert die manuelle Bearbeitungszeit und die Variabilität zwischen Anwendern und verbessert so die Reproduzierbarkeit von Assays an verschiedenen Standorten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf robusten Biomarkerdaten aus begrenzten Probenmengen und verringert damit das Risiko von Ausfällen in späteren Entwicklungsphasen.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem zuverlässige Quantifizierungen von selten vorkommenden Targetmolekülen bereits früh im Entwicklungsprozess bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrospinnen, Handhabung von Nanofasern und mikrofluidischer Konstruktion für eine erfolgreiche Herstellung.
- Hängt von der Verfügbarkeit von CNC-Fräsen, Plasma-Behandlung und Vakuumgeräten für die Herstellung der Scheiben und Nanofasermatten ab.
- Erfordert die Standardisierung von PDMS-Beschichtungs- und Aushärtungsprotokollen, um eine konsistente Haftung der Nanofasern über Chargen hinweg sicherzustellen.
- Die Anpassung an alternative Proteintargets erfordert eine erneute Optimierung der Oberflächenchemie und Inkubationsbedingungen.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Notwendigkeit kontrollierter Umgebungsbedingungen während der Übertragung der Nanofasern sowie mögliche Variabilität in der Gleichmäßigkeit der Fasermatten.
