Name: Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie eine vollautomatische Schleuder-Mikrofluidik-Vorrichtung mit Titanoxid-Nanofasern die Empfindlichkeit von ELISA auf Femtomolarniveau steigert. Diese Methode ermöglicht die ultrasensitive Proteindetektion aus nur 10 µL Vollblut innerhalb von 30 Minuten.

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Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschüsse unterstützt (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), einen Zuschuss von der koreanischen Health Technology R &amp; D-Projekt, das Ministerium für Gesundheit und Soziales (A121994) und IBS-R020-D1 von der koreanischen Regierung finanziert.

HINWEIS: Es wurde Blut von gesunden Individuen gezogen und wurde in einem Blutsammelröhrchen gesammelt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Freiwilligen erhalten. 1. Herstellung von TiO 2 NF Mat <ol><li> Herstellung der Vorläuferlösung 22 <ol><li> Man löst 1,5 g Titantetraisopropoxid (TTIP) in einer Mischung aus Ethanol (99,9%, 3 ml) und Eisessig (3 ml) und mische die Lösung bei RT (25 ° C) für 30 min auf einem Magnetrührer. </li><li> Man löst 11 Gew% Polyvinylpyrrolidon (PVP) in 3,64 g Ethanol (99,9%) und rührt die Lösung bei 65 ° C für 1 Stunde einer Heißplatte Magnetrührer. </li><li> Kombinieren Sie und rühren die beiden Lösungen bei 65 ° C für 4 Stunden auf einer heißen Platte Magnetrührer. </li></ol></li><li> Elektroverspinnen <ol><li> Laden die hergestellte Lösung in eine Spritze mit einer Nadel aus rostfreiem Stahl von 200 um Innendurchter. Füllen Sie die Lösung direkt in die Spritze nach den Kolben zu entfernen. </li><li> Einführung der Lösung ständig mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,3 ml / h für 10 min auf einen Si-Wafer (2 cm x 2 cm), die auf einem geerdeten Substrat bei einer hohen DC-Spannung (15 kV). Während der Elektro, stellen Sie den Abstand zwischen der Nadel und dem geerdeten Substrat bis 10 cm. </li></ol></li><li> Die Calcinierung der Matte NF <ol><li> Platzieren Sie die NF - Matte in einem Ofen und erhöhen die Temperatur bis zu 500 ° C mit einer Anstiegsrate von 3 ° C / min unter Hochvakuum - Bedingungen (5 x 10 -5 Torr). </li><li> Man hält die Temperatur bei 500 ° C für 3 Stunden. Abkühlen, um die Temperatur der Proben auf den RT (25 ° C) in dem Ofen. </li></ol></li></ol> 2. Integration von TiO 2 NF - Matte in eine Zentrifugal Mikrofluidik - Disc <ol><li> Herstellung einer Scheibe <ol><li> Verwenden Sie die 3D - Design - Software (zB SolIDWorks oder ähnliches) darstellen Kammern, Kanäle und Ventile jeder Schicht der Scheibe. Konvertieren Sie die Design - Dateien auf Computer numerischen Steuerung (CNC) Code Generierung von Code - Software (zB Edgecam oder ähnliches). Verwenden Sie die Software gemäß der Bedienungsanleitung 23,24 . Hinweis: Die typischen Kanal verwendeten Dimensionen in diesem Gerät sind 1,0 mm x 0,3 mm (Breite x Tiefe). </li><li> Öffnen Sie die Betriebssoftware der CNC - Fräsmaschine (z. B. DeskCNC oder ähnliches) und laden CNC-Code in die Betriebssoftware und klicken Sie auf den folgenden in dieser Reihenfolge: &quot;AUTO&quot; -&gt; &quot;G CODE OPEN&quot; -&gt; Wählen Sie die CNC generierten Code. </li><li> Bringen Sie die PC-Platte auf der CNC-Fräsmaschine: Verwenden Sie 1 mm PC-Platten für die obere Schicht und 5 mm PC-Platten für die Disc-Schicht. Führen Sie die CNC-Fräsmaschine, jede Schicht der Scheibe zu schneiden, indem Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; klicken. </li></ol></li><li> Übertragung von TiO 2 NF - Matte auf die Platte<ol><li> Platzieren ein Siliziumsubstrat und eine kleine Petrischale mit 40 ul (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-trichlorsilan in einer Vakuumkammer unter Vakuum für 30 min. Das Fluorsilan verdampft und wird auf dem Substrat beschichtet. </li><li> Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) Vorpolymer mit einem Härter in einem Verhältnis 10: 1 und Entgasen in einer Vakuumkammer. Spin-Beschichtung der PDMS auf ein Siliciumsubstrat bei 650 rpm für 60 sec. </li><li> Härten des PDMS beschichtet auf einem Siliziumsubstrat in einem Ofen bei 65 ° C für 10 min eine haftende Zustand zu erreichen. HINWEIS: Die Härtungszeit kann in Abhängigkeit von den Umgebungsbedingungen variiert werden und Haftkraft kann durch ein Klebrigkeitstest mit einem Rheometer geprüft werden. </li><li> Übertragen Sie die TiO 2 NF - Matte durch Elektrospinnen und Brennen auf der PDMS-beschichteten Silizium unter Verwendung einer Pinzette vorbereitet. Wenden Sie dann manuell einen konformen Druck auf die TiO 2 übertragen NF - Matte mit einem flachen Gegenstand (z. B. Glasträger) und das Objekt entfernen. Stellenin dem Ofen dieser Probe bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei 80 ° C für 1 Stunde die PDMS-Schicht vollständig auszuhärten. </li><li> Coat Bindungsreaktionskammern in der Platte mit 20 ul der PDMS / Härter - Mischung (10: 1), die wirkt als Haftschicht TiO 2 NF Matte auf die Platte zu befestigen. </li><li> Dispense 50 ul Ethanol (99,9%) auf der TiO 2 NF - Matte auf dem PDMS - Schicht, schneiden Sie die NF - Matte mit einem Stanzloch von 6 mm Durchmesser und übertragen den Schnitt TiO 2 NF Matte zu den Bindungsreaktionskammern , beschichtet mit 20 &amp; mgr; l der PDMS in dem vorherigen Schritt. HINWEIS: In diesem Schritt wird Ethanol wird hilfreich sein , die geschnittenen TiO 2 NF Matte aus dem Si - Substrat zu lösen. </li><li> Inkubieren der TiO 2 NF Matte integrierten Scheibe in den Ofen bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei 80 ° C für 1 Stunde die PDMS vollständig auszuhärten. </li></ol></li><li> Oberflächenmodifizierung der TiO 2 NF Matte auf der Disk <ol><li> Prepare 1% v / v Lösung von (3-Glycidoxypropyl) methyldiethoxy Silan (GPDES) in Ethanol (99,9%). </li><li> Behandeln Sie die TiO 2 NF Matte integrierte Scheibe mit Sauerstoffplasma bei 140 W, 50 sccm Sauerstoffstrom für 180 Sekunden. Dispense 100 ul GPDES Lösung auf jeder Nanofasermatte und Inkubation bei RT (25 ° C) für 2 Stunden. </li><li> Waschen Sie die Substrate kurz durch Ethanol (99,9%) unter Verwendung einer Waschflasche Dispensen, entfernen Sie dann das Ethanol vollständig durch die Scheibe Umkehren und es gegen einen sauberen Blotting abzuwischen. Härtung bei 80 ° C für 1 Stunde. Zweimal waschen mit Ethanol (99,9%) in der gleichen Weise wie oben angegeben, die physikalisch adsorbiert und ungebundener GPDES Moleküle zu entfernen. </li><li> Föhnen mit einem Stickstoffstrom, unter Vakuum getrocknet. HINWEIS: Die Scheibe kann in einem verschlossenen Behälter bei RT gelagert werden (25 ° C) bis zum Gebrauch. </li></ol></li><li> Immobilisierung von Antikörpern auf der Oberfläche <ol><li> Machen Sie eine Lösung von 200 ug / ml Fänger-Antikörper (monoklonale Maus-Antimenschliche hsCRP oder monoklonaler Maus-anti-cTnI) durch die Antikörper mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) -Puffer (pH 7,4) verdünnt. Verzichtet werden 5 ul der Lösung auf jede NF Matte in einer Scheibe mit einer Mikropipette. Siehe Liste Materialien für weitere Informationen über die Antikörper. </li><li> Halten Sie die Scheiben in einer befeuchteten Kammer und Inkubation bei 37 ° C für 4 Stunden. Waschen Sie die NF-Matte mit 0,1% BSA-PBS Puffer beschichtet Antikörper. Füllen Sie die Kammer mit 100 ul Waschpuffer mit einer Mikropipette, entfernen Sie den Puffer durch Absaugen oder dekantieren. Schließlich kehren die Scheibe und tupfen sie gegen eine saubere wischen und dann die Scheibe montieren. </li></ol></li><li> Disc Montage <ol><li> Zeichnen Sie das Design der Scheibe auf doppelseitigen Klebeband mit einem CAD - Programm (zB AutoCAD oder ähnliches). Laden Sie die CAD-Konstruktion auf den Schneideplotter. </li><li> Schneiden Sie das doppelseitige Klebeband die Schneideplotter verwenden. Ziehen Sie eine Schutzschicht aus Doppel-Klebeband ab und befestigen it auf der Oberseite der Plattenschicht. Ziehen Sie die andere Schutzschicht und befestigen Sie die obere Schicht auf der Disc Schicht ab. </li><li> Legen Sie das vorläufig montierte Scheibe in der Pressmaschine und genau oben / Klebstoff / Scheibe Schichten unter Verwendung von Align Markierungen in jeder Schicht ausrichten, um jedes Ventil, Kanal verbinden und Kammern. Wenden Sie konformen Druck der Pressmaschine. </li></ol></li></ol> 3. Immunoassay <ol><li> Füllen Sie die Kammern mit 1% BSA-PBS-Puffer mit einer Mikro und brüten die Scheibe bei 37 ° C für 1 Stunde unter Verwendung. Entfernen Sie den Puffer durch Absaugen mit einer Mikropipette. Führen Sie diesen Schritt, um die nicht umgesetzten Stellen zu blockieren und nicht-spezifische Adsorption von Protein zu reduzieren in einer Scheibe. </li><li> Zweimal waschen mit 0,1% BSA-PBS durch Füllen und Absaugen der Kammern mit einer Mikropipette. HINWEIS: In diesem Stadium kann die Scheibe bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li><li> Last 10 ul Antigen-dotierten Vollblut oder CRP-freies Serum für die CRP-Erkennung auf der Disc ein micropipett mite. Für die Herstellung der Eichkurven verwenden Konzentrationen von CRP von 1 pg / ml bis 100 ng / ml; und cTnI von 10 pg / ml bis 100 ng / ml. HINWEIS: Aufgrund der höheren CRP in Vollblut, die in der Regel im Bereich um ist, CRP-freies Serum verwendet wurde, die geringe Nachweisgrenze der Vorrichtung zu demonstrieren. </li><li> Drehen Sie die Scheibe bei 3600 Umdrehungen pro Minute (391 × g) für 60 Sekunden um die roten Blutkörperchen zu trennen. </li><li> Offenes Ventil # 1 durch Laserbestrahlung, und Transfer 4 ul des Überstandes Plasma in die Kammer, die 8 &amp; mgr; l Antikörper, konjugiert mit HRP Detektion durch die Scheibe bei 2.400 Upm für 3 sec dreht. . HINWEIS: Die allgemeinen Verfahren zur Ventilbetätigung und Visualisierung von Disks sind im Detail in einem früheren Bericht beschrieben 21 </li><li> Anwenden eines Mischmodus (15 Hz s -1, 15 °) für 5 sec auf Antikörper des Proteins und Nachweis zu binden. </li><li> Öffnen Sie das Ventil # 2, und die Mischung übertragen, hergestellt in Schritt 6 an die Bindungsreaktionskammer (2400 Umdrehungen pro Minute, 3 sec). Wenden Sie dann einen Mischbetrieb (60 Hz s -1, 2 °) für 20 min eine Immunreaktion zwischen dem Gemisch und den bindenden Antikörpern auf den TiO 2 FNs zu erreichen. Nach der Reaktion wird das offene Ventil # 3 und übertragen die Restmischung in die Abfallkammer (2.400 Upm, 10 s). </li><li> Übertragen Sie den Waschpuffer (600 ul) zu der Bindungsreaktionskammer durch das Ventil # 4 Öffnen und Drehen der Scheibe (2400 rpm, 4 sec). Dann bewerben Sie sich ein Mischbetrieb (30 Hz s -1, 30 °) für 120 Sekunden die TiO 2 FNs in der Kammer zu waschen. </li><li> Waschen Sie die TiO 2 FNs mehr zweimal durch folgende gleiche Bedingung von Schritt 3.8, und entfernen Sie die restliche Waschpuffer vollständig durch die Scheibe bei 2400 Umdrehungen pro Minute für 20 Sekunden drehen. Dann schließen Sie das Ventil # 5. </li><li> Für die Chemilumineszenzreaktion gelten einen Mischmodus (30 Hz s -1, 2 °) für 1 min nach der chemilumineszierenden Substratlösung zu der Bindungsreaktionskammer übertragen durch das Ventil # 6 Öffnen und SpinnAnschließend wird die Platte für 10 Sekunden bei 2.400 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Übertragen Sie die reagierte Substratlösung zu den Nachweiskammern durch Öffnen des Ventils # 7 und Drehen der Scheibe bei 2400 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden. </li><li> Messung der Chemilumineszenz-Signale aus der umgesetzten Substratlösung eine Photovervielfacherröhre (PMT) Modul ausgestattet Detektionssystem verwendet wird. HINWEIS: Das Detektionssystem ist eine maßgeschneiderte Maschine folgende Teile mit: Schrittmotor, mechanische Komponenten, Übersetzungsstufen und im Handel erhältliche PMT. Die optisch-mechanische Teile und Schrittmotor zusammengebaut werden, die Vorrichtung zu halten, und der Motor die Scheibe drehen kann. Die Detektion wird durch PMT fixiert auf den optomechanischen Teilen durchgeführt, und es wird über den Detektionskammern der Vorrichtung angeordnet. Durch den Schrittmotor zu manipulieren, werden die Detektionskammern direkt unter der Nachweiszone von PMT ausgerichtet sind. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der Assay auf TiO 2 NF integrierten Platte eine schnelle, kostengünstige und praktische Technik für die ultrasensitiver Detektion niedriger reichlich vorhandene Proteine ​​in sehr geringen Blutvolumen. Diese Technik hat den Vorteil der Verwendung von kleinen Probenvolumina (10 ul) und ist für die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig zugänglich. Dies stellt ein großes Potential als Multiplexing-Immunoassay-Gerät. Die Vorrichtung hat den zusätzlichen Vorteil, dass es nicht Probevorbehandlungsschritte wie Pl...

Mehrere Plattformen für die Diagnose von Krankheiten wurden auf Basis von nanoskaligen Materialien 1,2 wie Nanodrähte entwickelt, 3 - Nanopartikel, 4 - Nanoröhrchen, 5 und Nanofasern (NFS) 6-8. Diese Nanomaterialien bieten hervorragende Perspektiven bei der Gestaltung neuer Technologien für die hochsensiblen Biotests aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel haben mesoporösen Zinkoxid - Nanofasern für die Femto-molar empfindlichen Nachweis von Brustkrebs Biomarkern verwendet worden. 9 Kürzlich Basis Nanomaterialien auf Titandioxid (TiO 2) wurden für bioanalytische Anwendungen 10 unter Berücksichtigung ihrer chemischen Stabilität, 11 vernachlässigbar Proteindenaturierung untersucht , 12 und Biokompatibilität. 13 Außerdem erleichtern die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche der TiO 2 chemische Modifikation und die kovalente Anlagerung von Biomolekülen. 14,15 Patterned TiO 2 thin Filme 16 oder TiO 2 -Nanoröhren 17 die Detektionsempfindlichkeit eines Zielproteins zu verbessern , verwendet worden sind , durch den Oberflächenbereich zu erhöhen; jedoch ist das Herstellungsverfahren ziemlich komplex und erfordert eine teure Ausrüstung. Auf der anderen Seite, elektro NFs Aufmerksamkeit wegen ihrer hohen Oberfläche erhalten sowie einfache und kostengünstige Herstellungsverfahren; 18,19 noch die zerbrechliche oder lose Charakteristik des elektro TiO 2 NF Matte macht es schwierig zu handhaben und Integration mit mikrofluidischen Systemen. 6,20 Daher wurden die TiO 2 NF Matten selten in bioanalytischen Anwendungen eingesetzt, insbesondere solche , erfordern harte Waschbedingungen. In dieser Studie wurden diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir durch die Verwendung eines dünnen Polydimethylsiloxan (PDMS) Haftschicht, eine neue Technologie für die Übertragung der NF elektroMatten auf die Oberfläche eines beliebigen Zielsubstrat entwickelt. Furthermore haben wir erfolgreich zeigte die Integration der elektro TiO 2 NF Matten auf eine zentrifugale Mikrofluidikvorrichtung aus Polycarbonat (PC) hergestellt. Mit diesem Gerät wird eine hochempfindliche, vollautomatische und integrierte Detektion von C-reaktivem Protein (CRP) sowie kardialem Troponin I (cTnI) wurde aus 10 &amp; mgr; l Vollblut innerhalb von 30 min erreicht. 21 aufgrund der kombinierten Vorteile der Eigenschaften des NFS- und die zentrifugale Plattform der Assay einen breiten dynamischen Bereich von sechs Größenordnungen von 1 pg / ml (~ 8 fM) bis 100 ng / ml (~ 12.08) mit einer unteren Nachweisgrenze zeigten von 0,8 pg / ml (~ 6 fM) für CRP und einem dynamischen Bereich von 10 pg / ml (~ 12.04) bis 100 ng / ml (~ 4 nM) mit einer Nachweisgrenze von 37 pg / ml (~ 01.05) für cTnI. Diese Nachweisgrenzen sind ~ 300 und ~ 20-fach niedriger im Vergleich zu ihren entsprechenden herkömmlichen ELISA-Ergebnisse. Diese Technik könnte zum Nachweis von irgendwelchen Zielproteine ​​verwendet werden, mit entsprechenden Antikörpern. Insgesamt ist dieses Gerät could tragen wesentlich zur in-vitro - Diagnostik und biochemische Tests , da sie auch von sehr geringen Mengen an biologischen Proben selten Mengen von Zielproteinen mit großer Sensibilität erkennen kann, beispielsweise 10 &amp; mgr; l Vollblut. Obwohl wir nur die Serumproteinnachweis mittels ELISA in dieser Studie gezeigt, die Übertragung und Integration Technologie der elektro NFs mit mikrofluidischen Vorrichtungen breiter in anderen biochemischen Reaktionen angewendet werden kann, die eine große Oberfläche für eine hohe Detektionsempfindlichkeit erfordern.

<table><tbody><tr><td>Si-Wafer</td><td>LG SILTRON</td><td>Polierter Wafer, Prüfgüte</td><td>Ø (mm) = 150, Ausrichtung = < 100>, Dotierung = Bor, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, Dicke (&mu; m) = 650 - 700</td></tr><tr><td>Polycarbonat (PC) &nbsp;</td><td>Daedong Kunststoff</td><td>PCS#6900</td><td>Dicke (mm) = 1 und 5&nbsp;</td></tr><tr><td>Titantetraisopropoxid, 98%,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon, Mw = 1.300.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreies Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorsilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMS und Härter</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>GPDES</td><td>Gelest Inc</td><td>SIG5832.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>J T Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM</td><td></td></tr><tr><td>Röntgen-Photoelektronenspektroskopie</td><td>ThermoFisher</td><td>K-alpha</td><td></td></tr><tr><td>3D-Modellierungsmaschine</td><td>M& I CNC Lab, Korea</td><td></td><td>CNC-Fräsmaschine</td></tr><tr><td>Wachsdosiermaschine</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td><td></td><td>Kundenspezifisches</td></tr><tr><td>doppelseitiges Klebeband</td><td>FLEXcon, USA</td><td>DFM 200 klar 150 POLY H-9 V-95</td><td></td></tr><tr><td>Schneideplotter</td><td>Graphtec Corporation, Japan</td><td>Graphtec CE3000-60 MK2</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIDAS</td><td>SPIN-3000D</td><td></td></tr><tr><td>Ofen (Kalzinierung)</td><td>R. D. WEBB COMPANY</td><td>WEBB 99</td><td></td></tr><tr><td>Rheometer (Haftprobe)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Haake MARS&nbsp; III - ORM-Paket</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffplasmasystem</td><td>FEMTO</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonale Maus antihuman hsCRP</td><td>Hytest Ltd., Finnland</td><td>4C28</td> <td>(Klon # C5)</td></tr><tr><td>Monoklonale Maus Anti-cTnI</td><td>Hytest Ltd., Finnland</td><td>4T21</td> <td>(Klon # 19C7)</td></tr><tr><td>HRP konjugierte Ziege polyklonal anti-hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab19175</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjugierte monoklonale Maus anti-cTnI</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab24460</td> <td>(Klon # 16A11)</td></tr><tr><td>hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab111647</td><td></td></tr><tr><td>cTnI</td><td>Fitzgerald, MA</td><td>30-AT43</td><td></td></tr><tr><td>Rinderalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Amresco Inc</td><td>E404</td><td></td></tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen</td><td>BD Vacutainer</td><td>367844</td><td>K2 EDTA 7,2 mg plus Blut -Entnahmeröhrchen</td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA femto</td><td>Invitrogen</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Modularer Multilabel-Plattenleser</td><td>Perkin Elmer</td><td>Envision 2104</td><td></td></tr><tr><td>Disc-Bedienmaschine</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td><td></td><td>Kundenspezifische</td></tr><tr><td>Photomultiplier-Röhre (PMT)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>H1189-210</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td>Version 2012</td><td>Konstruktionssoftware</td></tr><tr><td>SolidWorks 3D CAD-Software&nbsp;</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Version 2013</td><td>3D-Design-Software,</td></tr> <tr><td>Edgecam</td><td>Vero</td><td>Software-Version 2009.01.06928</td><td>Code-Generierungssoftware</td></tr><tr><td>DeskCNC</td><td>Carken Co.</td><td>Version 2.0.2.18</td><td>CNC-Fräsmaschinen-Software</td></tr></tbody></table>

vollautomatische schleuder mikrofluidik-vorrichtung zur ultrasensitive proteindetektion aus vollblut

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist eine vielversprechende Methode, um kleine Mengen an Proteinen in biologischen Proben nachzuweisen. Die Geräte, die eine Plattform für ein reduziertes Probenvolumen und eine reduzierte Assay-Zeit sowie eine vollständige Automatisierung bieten, sind für den potenziellen Einsatz in der Point-of-Care-Diagnostik erforderlich. Kürzlich haben wir den ultrasensitiven Nachweis von Serumproteinen, C-reaktivem Protein (CRP) und kardialem Troponin I (cTnI) unter Verwendung eines Lab-on-a-Disc demonstriert, das aus TiO2-Nanofasermatten (NF) besteht. Es zeigte einen großen Dynamikbereich mit Nachweisempfindlichkeit bei femtomolaren (fM) ab einem kleinen Volumen Vollblut in 30 min. Das Gerät besteht aus mehreren Komponenten für die Bluttrennung, Dosierung, Mischung und Reinigung, die automatisiert sind, um die Empfindlichkeit bei geringen Probenvolumina zu verbessern. Hier, in der Videodemonstration, zeigen wir die experimentellen Protokolle und das Know-how für die Herstellung von NFs sowie die Scheibe, ihre Integration und den Betrieb in der folgenden Reihenfolge: Prozesse zur Herstellung von TiO2 NF mat; Transferdruck von TiO2 NF Matte auf die Disc; Oberflächenmodifikation für Immunreaktionen, Scheibenmontage und -betrieb; On-Disc-Nachweis und repräsentative Ergebnisse für Immunoassays. Die Verwendung dieses Geräts ermöglicht die Multiplex-Analyse mit minimalem Verbrauch von Proben und Reagenzien. Angesichts der Vorteile sollte das Gerät in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden und sich als vorteilhaft erweisen, um die Analyse von Proteinen mit geringen Häufigkeiten zu erleichtern.

Unter Verwendung dieses Protokolls, ein vollautomatisiertes zentrifugalen Mikrofluidik-Vorrichtung zum Proteinnachweis aus Vollblut mit hoher Empfindlichkeit hergestellt. Die TiO 2 NF Matten wurden durch Prozesse der Elektrospinnen und Calcinieren hergestellt. Um die FNs der gewünschten Durchmesser, Morphologie und Dicke, Elektroverspinnen Bedingungen wie Strömungsgeschwindigkeit, Spannung und Spinn Zeit wurden optimiert herzustellen. Wenn die Bedingungen nicht optimiert wurde...

Dieses Protokoll zeigt, wie eine femtomolare Nachweisempfindlichkeit von Proteinen in 10 μl Vollblut innerhalb von 30 min erreicht werden kann. Dies kann durch die Verwendung von elektrogesponnenen Nanofasermatten erreicht werden, die in eine Lab-on-a-Disc integriert sind und eine große Oberfläche sowie effektives Mischen und Waschen für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bieten.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Nachweisempfindlichkeit von ELISA unter Verwendung natürlicher gesponnener Nanofasern zu verbessern. Dieses Video zeigt, wie eine femtomolare Nachweisempfindlichkeit von Proteinen in 10 Mikrolitern Vollblutproben innerhalb von 30 Minuten erreicht werden kann. Bei einer Lab-on-a-Disc-Plattform wird die Zentrifugalkraft genutzt, um die Flüssigkeit durch die Kammern zu befördern, und der gesamte Prozess ist vollständig automatisiert.Die Detektionsempfindlichkeit könnte durch die Integration von Nanofasern stark erhöht werden. Das Problem war allerdings, dass die Nanofaser sehr zerbrechlich und schwer zu handhaben ist. In diesem Video stellen wir ein einfaches Verfahren vor, um zerbrechliche Titandioxid-Nanofasermatten auf einer Kunststoffscheibe zu befestigen.Um Titandioxid-Nanofasermatten auf Silikonsubstrat durch Elektrospinnen herzustellen, wird das Silikonsubstrat zunächst silanisiert, mit PDMS beschichtet und vorgehärtet. Eine Nanofasermatte wird dann auf dieses vorgehärtete PDMS übertragen und dieses Produkt wird gestanzt, um ein kreisförmiges Stück für die Befestigung herzustellen. Beschichten Sie die Reaktionskammer mit eine

fully-automated-centrifugal-microfluidic-device-for-ultrasensitive

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Digitale Mikrofluidik ist eine Technik, durch die Manipulation von diskreten Tröpfchen (~ nL - mL) charakterisiert auf eine Reihe von Elektroden, die durch die Anwendung von elektrischen Feldern. Es ist für die Durchführung schnelle, sequentielle, miniaturisierte automatische biochemische Assays gut geeignet. Hier berichten wir über eine Plattform, die die Automatisierung von mehreren Proteom Verarbeitungsschritte.

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät wurde für den Umlauf kernhaltigen Zelle Bereicherung aus dem peripheren Blut über Erythrozytenlyse dass die Isolierung von hoher Qualität Probe stellt sicher, ohne Zellverlust entwickelt.

Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

Dieses Video zeigt ein Kapillarelektrophorese-Immunoassay-Protokoll zum Nachweis eines Protein-Biomarkers, der mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) assoziiert ist, aus menschlichen Blutplättchen. Die Bestätigung des Vorhandenseins des ALS-Biomarkerproteins erfolgt durch größenbasierte Trennung der Thrombozytenproteine, gefolgt von einer Chemilumineszenzdetektion.

Ein Kapillarelektrophorese-Immunoassay für den Nachweis von Protein-Biomarkern

Dieses Video zeigt ein mikrofluidisches System für einen magnetischen Nanopartikel-basierten Immunoassay. Das Detektionssystem verwendet ein mikrofluidisches Gerät, das eine Magnetfalle in seine Kanäle integriert. In die Kanäle werden vorgeformte Immunkomplexe eingeführt, die aus antigenbeschichteten magnetischen Nanopartikeln bestehen, die an primäre und peroxidase-konjugierte Sekundärantikörper gebunden sind. Die Immunkomplexe werden in der porösen Magnetfalle eingefangen, wenn ein externes...

Ein magnetischer Nanopartikel-basierter Immunoassay mit einem mikrofluidischen Gerät

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt.

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Dieses Protokoll beschreibt eine Systemarchitektur für die Durchführung automatisierter Partikeltrennungen mit kleinen Volumina (0,15–1,5 ml) unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts und diskutiert Methoden zur Optimierung der Leistung und des Betriebs von akustofluidischen Geräten.

Einem mikrofluidischen Plattform für Präzisions-Kleinvolumen Probenbearbeitung und seine Verwendung zur Größe Separate biologische Partikel mit einem Acoustic Microdevice

Hier demonstrieren wir eine einfache Produktionsmethode für größensteuerbare, monodisperse Wasser-in-Öl (W/O) Mikrotröpfchen unter Verwendung eines kapillarbasierten zentrifugalen mikrofluidischen Geräts. Diese Methode benötigt nur ein geringes Probenvolumen und ermöglicht eine Produktion mit hoher Ausbeute. Wir gehen davon aus, dass diese Methode für schnelle biochemische und zelluläre Analysen nützlich sein wird.

Kapillar-basierten Kreisel Mikrofluidik-Vorrichtung zur Größe steuerbare Bildung von monodispersen Mikrotröpfchen

Wir zeigen, eine mikrofluidische Plattform mit einem Elektrodennetz integriert Oberfläche, die resistive Pulserfassungs kombiniert (RPS) mit Codemultiplex-Vielfachzugriff (CDMA), Auffinden und Ausmessen von Partikeln in mehrere mikrofluidische Kanäle zu multiplexen.

Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Elektrowetting-basierte digitale Mikrofluidic ist eine Technik, die eine spannungsgetriebene Änderung des scheinbaren Kontaktwinkels eines Mikroliter-Volumentröpfchens nutzt, um seine Manipulation zu erleichtern. Die Kombination mit funktionalisierten Magnetperlen ermöglicht die Integration mehrerer Laboreinheiten zur Probenvorbereitung und Identifizierung von Krankheitserregern mittels Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Elektrowetting-basierte Digital Microfluidics Plattform für automatisierte enzymgebundene Immunsorbent Assay

Die Mikrofluidik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entwicklung diagnostischer Tests. Oft sind jedoch teure Geräte und Materialien sowie aufwändige Fertigungs- und Handhabungstechniken erforderlich. Hier beschreiben wir das Herstellungsprotokoll eines mikrofluidischen Acrylgeräts für magnetische Mikro- und Nanopartikel-basierte Immunoassays in einer kostengünstigen und einfach zu bedienenden Umgebung.

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-based Immunoassays

Erfahren Sie, wie eine vollautomatische Schleuder-Mikrofluidik-Vorrichtung mit Titanoxid-Nanofasern die Empfindlichkeit von ELISA auf Femtomolarniveau steigert. Diese Methode ermöglicht die ultrasensitive Proteindetektion aus nur 10 µL Vollblut innerhalb von 30 Minuten.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

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