Name: Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie eine vollautomatische Schleuder-Mikrofluidik-Vorrichtung mit Titanoxid-Nanofasern die Empfindlichkeit von ELISA auf Femtomolarniveau steigert. Diese Methode ermöglicht die ultrasensitive Proteindetektion aus nur 10 µL Vollblut innerhalb von 30 Minuten.

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Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschüsse unterstützt (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), einen Zuschuss von der koreanischen Health Technology R &amp; D-Projekt, das Ministerium für Gesundheit und Soziales (A121994) und IBS-R020-D1 von der koreanischen Regierung finanziert.

HINWEIS: Es wurde Blut von gesunden Individuen gezogen und wurde in einem Blutsammelröhrchen gesammelt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Freiwilligen erhalten. 1. Herstellung von TiO 2 NF Mat <ol><li> Herstellung der Vorläuferlösung 22 <ol><li> Man löst 1,5 g Titantetraisopropoxid (TTIP) in einer Mischung aus Ethanol (99,9%, 3 ml) und Eisessig (3 ml) und mische die Lösung bei RT (25 ° C) für 30 min auf einem Magnetrührer. </li><li> Man löst 11 Gew% Polyvinylpyrrolidon (PVP) in 3,64 g Ethanol (99,9%) und rührt die Lösung bei 65 ° C für 1 Stunde einer Heißplatte Magnetrührer. </li><li> Kombinieren Sie und rühren die beiden Lösungen bei 65 ° C für 4 Stunden auf einer heißen Platte Magnetrührer. </li></ol></li><li> Elektroverspinnen <ol><li> Laden die hergestellte Lösung in eine Spritze mit einer Nadel aus rostfreiem Stahl von 200 um Innendurchter. Füllen Sie die Lösung direkt in die Spritze nach den Kolben zu entfernen. </li><li> Einführung der Lösung ständig mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,3 ml / h für 10 min auf einen Si-Wafer (2 cm x 2 cm), die auf einem geerdeten Substrat bei einer hohen DC-Spannung (15 kV). Während der Elektro, stellen Sie den Abstand zwischen der Nadel und dem geerdeten Substrat bis 10 cm. </li></ol></li><li> Die Calcinierung der Matte NF <ol><li> Platzieren Sie die NF - Matte in einem Ofen und erhöhen die Temperatur bis zu 500 ° C mit einer Anstiegsrate von 3 ° C / min unter Hochvakuum - Bedingungen (5 x 10 -5 Torr). </li><li> Man hält die Temperatur bei 500 ° C für 3 Stunden. Abkühlen, um die Temperatur der Proben auf den RT (25 ° C) in dem Ofen. </li></ol></li></ol> 2. Integration von TiO 2 NF - Matte in eine Zentrifugal Mikrofluidik - Disc <ol><li> Herstellung einer Scheibe <ol><li> Verwenden Sie die 3D - Design - Software (zB SolIDWorks oder ähnliches) darstellen Kammern, Kanäle und Ventile jeder Schicht der Scheibe. Konvertieren Sie die Design - Dateien auf Computer numerischen Steuerung (CNC) Code Generierung von Code - Software (zB Edgecam oder ähnliches). Verwenden Sie die Software gemäß der Bedienungsanleitung 23,24 . Hinweis: Die typischen Kanal verwendeten Dimensionen in diesem Gerät sind 1,0 mm x 0,3 mm (Breite x Tiefe). </li><li> Öffnen Sie die Betriebssoftware der CNC - Fräsmaschine (z. B. DeskCNC oder ähnliches) und laden CNC-Code in die Betriebssoftware und klicken Sie auf den folgenden in dieser Reihenfolge: &quot;AUTO&quot; -&gt; &quot;G CODE OPEN&quot; -&gt; Wählen Sie die CNC generierten Code. </li><li> Bringen Sie die PC-Platte auf der CNC-Fräsmaschine: Verwenden Sie 1 mm PC-Platten für die obere Schicht und 5 mm PC-Platten für die Disc-Schicht. Führen Sie die CNC-Fräsmaschine, jede Schicht der Scheibe zu schneiden, indem Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; klicken. </li></ol></li><li> Übertragung von TiO 2 NF - Matte auf die Platte<ol><li> Platzieren ein Siliziumsubstrat und eine kleine Petrischale mit 40 ul (Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-trichlorsilan in einer Vakuumkammer unter Vakuum für 30 min. Das Fluorsilan verdampft und wird auf dem Substrat beschichtet. </li><li> Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) Vorpolymer mit einem Härter in einem Verhältnis 10: 1 und Entgasen in einer Vakuumkammer. Spin-Beschichtung der PDMS auf ein Siliciumsubstrat bei 650 rpm für 60 sec. </li><li> Härten des PDMS beschichtet auf einem Siliziumsubstrat in einem Ofen bei 65 ° C für 10 min eine haftende Zustand zu erreichen. HINWEIS: Die Härtungszeit kann in Abhängigkeit von den Umgebungsbedingungen variiert werden und Haftkraft kann durch ein Klebrigkeitstest mit einem Rheometer geprüft werden. </li><li> Übertragen Sie die TiO 2 NF - Matte durch Elektrospinnen und Brennen auf der PDMS-beschichteten Silizium unter Verwendung einer Pinzette vorbereitet. Wenden Sie dann manuell einen konformen Druck auf die TiO 2 übertragen NF - Matte mit einem flachen Gegenstand (z. B. Glasträger) und das Objekt entfernen. Stellenin dem Ofen dieser Probe bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei 80 ° C für 1 Stunde die PDMS-Schicht vollständig auszuhärten. </li><li> Coat Bindungsreaktionskammern in der Platte mit 20 ul der PDMS / Härter - Mischung (10: 1), die wirkt als Haftschicht TiO 2 NF Matte auf die Platte zu befestigen. </li><li> Dispense 50 ul Ethanol (99,9%) auf der TiO 2 NF - Matte auf dem PDMS - Schicht, schneiden Sie die NF - Matte mit einem Stanzloch von 6 mm Durchmesser und übertragen den Schnitt TiO 2 NF Matte zu den Bindungsreaktionskammern , beschichtet mit 20 &amp; mgr; l der PDMS in dem vorherigen Schritt. HINWEIS: In diesem Schritt wird Ethanol wird hilfreich sein , die geschnittenen TiO 2 NF Matte aus dem Si - Substrat zu lösen. </li><li> Inkubieren der TiO 2 NF Matte integrierten Scheibe in den Ofen bei 65 ° C für 4 Stunden oder bei 80 ° C für 1 Stunde die PDMS vollständig auszuhärten. </li></ol></li><li> Oberflächenmodifizierung der TiO 2 NF Matte auf der Disk <ol><li> Prepare 1% v / v Lösung von (3-Glycidoxypropyl) methyldiethoxy Silan (GPDES) in Ethanol (99,9%). </li><li> Behandeln Sie die TiO 2 NF Matte integrierte Scheibe mit Sauerstoffplasma bei 140 W, 50 sccm Sauerstoffstrom für 180 Sekunden. Dispense 100 ul GPDES Lösung auf jeder Nanofasermatte und Inkubation bei RT (25 ° C) für 2 Stunden. </li><li> Waschen Sie die Substrate kurz durch Ethanol (99,9%) unter Verwendung einer Waschflasche Dispensen, entfernen Sie dann das Ethanol vollständig durch die Scheibe Umkehren und es gegen einen sauberen Blotting abzuwischen. Härtung bei 80 ° C für 1 Stunde. Zweimal waschen mit Ethanol (99,9%) in der gleichen Weise wie oben angegeben, die physikalisch adsorbiert und ungebundener GPDES Moleküle zu entfernen. </li><li> Föhnen mit einem Stickstoffstrom, unter Vakuum getrocknet. HINWEIS: Die Scheibe kann in einem verschlossenen Behälter bei RT gelagert werden (25 ° C) bis zum Gebrauch. </li></ol></li><li> Immobilisierung von Antikörpern auf der Oberfläche <ol><li> Machen Sie eine Lösung von 200 ug / ml Fänger-Antikörper (monoklonale Maus-Antimenschliche hsCRP oder monoklonaler Maus-anti-cTnI) durch die Antikörper mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) -Puffer (pH 7,4) verdünnt. Verzichtet werden 5 ul der Lösung auf jede NF Matte in einer Scheibe mit einer Mikropipette. Siehe Liste Materialien für weitere Informationen über die Antikörper. </li><li> Halten Sie die Scheiben in einer befeuchteten Kammer und Inkubation bei 37 ° C für 4 Stunden. Waschen Sie die NF-Matte mit 0,1% BSA-PBS Puffer beschichtet Antikörper. Füllen Sie die Kammer mit 100 ul Waschpuffer mit einer Mikropipette, entfernen Sie den Puffer durch Absaugen oder dekantieren. Schließlich kehren die Scheibe und tupfen sie gegen eine saubere wischen und dann die Scheibe montieren. </li></ol></li><li> Disc Montage <ol><li> Zeichnen Sie das Design der Scheibe auf doppelseitigen Klebeband mit einem CAD - Programm (zB AutoCAD oder ähnliches). Laden Sie die CAD-Konstruktion auf den Schneideplotter. </li><li> Schneiden Sie das doppelseitige Klebeband die Schneideplotter verwenden. Ziehen Sie eine Schutzschicht aus Doppel-Klebeband ab und befestigen it auf der Oberseite der Plattenschicht. Ziehen Sie die andere Schutzschicht und befestigen Sie die obere Schicht auf der Disc Schicht ab. </li><li> Legen Sie das vorläufig montierte Scheibe in der Pressmaschine und genau oben / Klebstoff / Scheibe Schichten unter Verwendung von Align Markierungen in jeder Schicht ausrichten, um jedes Ventil, Kanal verbinden und Kammern. Wenden Sie konformen Druck der Pressmaschine. </li></ol></li></ol> 3. Immunoassay <ol><li> Füllen Sie die Kammern mit 1% BSA-PBS-Puffer mit einer Mikro und brüten die Scheibe bei 37 ° C für 1 Stunde unter Verwendung. Entfernen Sie den Puffer durch Absaugen mit einer Mikropipette. Führen Sie diesen Schritt, um die nicht umgesetzten Stellen zu blockieren und nicht-spezifische Adsorption von Protein zu reduzieren in einer Scheibe. </li><li> Zweimal waschen mit 0,1% BSA-PBS durch Füllen und Absaugen der Kammern mit einer Mikropipette. HINWEIS: In diesem Stadium kann die Scheibe bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li><li> Last 10 ul Antigen-dotierten Vollblut oder CRP-freies Serum für die CRP-Erkennung auf der Disc ein micropipett mite. Für die Herstellung der Eichkurven verwenden Konzentrationen von CRP von 1 pg / ml bis 100 ng / ml; und cTnI von 10 pg / ml bis 100 ng / ml. HINWEIS: Aufgrund der höheren CRP in Vollblut, die in der Regel im Bereich um ist, CRP-freies Serum verwendet wurde, die geringe Nachweisgrenze der Vorrichtung zu demonstrieren. </li><li> Drehen Sie die Scheibe bei 3600 Umdrehungen pro Minute (391 × g) für 60 Sekunden um die roten Blutkörperchen zu trennen. </li><li> Offenes Ventil # 1 durch Laserbestrahlung, und Transfer 4 ul des Überstandes Plasma in die Kammer, die 8 &amp; mgr; l Antikörper, konjugiert mit HRP Detektion durch die Scheibe bei 2.400 Upm für 3 sec dreht. . HINWEIS: Die allgemeinen Verfahren zur Ventilbetätigung und Visualisierung von Disks sind im Detail in einem früheren Bericht beschrieben 21 </li><li> Anwenden eines Mischmodus (15 Hz s -1, 15 °) für 5 sec auf Antikörper des Proteins und Nachweis zu binden. </li><li> Öffnen Sie das Ventil # 2, und die Mischung übertragen, hergestellt in Schritt 6 an die Bindungsreaktionskammer (2400 Umdrehungen pro Minute, 3 sec). Wenden Sie dann einen Mischbetrieb (60 Hz s -1, 2 °) für 20 min eine Immunreaktion zwischen dem Gemisch und den bindenden Antikörpern auf den TiO 2 FNs zu erreichen. Nach der Reaktion wird das offene Ventil # 3 und übertragen die Restmischung in die Abfallkammer (2.400 Upm, 10 s). </li><li> Übertragen Sie den Waschpuffer (600 ul) zu der Bindungsreaktionskammer durch das Ventil # 4 Öffnen und Drehen der Scheibe (2400 rpm, 4 sec). Dann bewerben Sie sich ein Mischbetrieb (30 Hz s -1, 30 °) für 120 Sekunden die TiO 2 FNs in der Kammer zu waschen. </li><li> Waschen Sie die TiO 2 FNs mehr zweimal durch folgende gleiche Bedingung von Schritt 3.8, und entfernen Sie die restliche Waschpuffer vollständig durch die Scheibe bei 2400 Umdrehungen pro Minute für 20 Sekunden drehen. Dann schließen Sie das Ventil # 5. </li><li> Für die Chemilumineszenzreaktion gelten einen Mischmodus (30 Hz s -1, 2 °) für 1 min nach der chemilumineszierenden Substratlösung zu der Bindungsreaktionskammer übertragen durch das Ventil # 6 Öffnen und SpinnAnschließend wird die Platte für 10 Sekunden bei 2.400 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Übertragen Sie die reagierte Substratlösung zu den Nachweiskammern durch Öffnen des Ventils # 7 und Drehen der Scheibe bei 2400 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden. </li><li> Messung der Chemilumineszenz-Signale aus der umgesetzten Substratlösung eine Photovervielfacherröhre (PMT) Modul ausgestattet Detektionssystem verwendet wird. HINWEIS: Das Detektionssystem ist eine maßgeschneiderte Maschine folgende Teile mit: Schrittmotor, mechanische Komponenten, Übersetzungsstufen und im Handel erhältliche PMT. Die optisch-mechanische Teile und Schrittmotor zusammengebaut werden, die Vorrichtung zu halten, und der Motor die Scheibe drehen kann. Die Detektion wird durch PMT fixiert auf den optomechanischen Teilen durchgeführt, und es wird über den Detektionskammern der Vorrichtung angeordnet. Durch den Schrittmotor zu manipulieren, werden die Detektionskammern direkt unter der Nachweiszone von PMT ausgerichtet sind. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+Ultrasensitive+Protein+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection.</a> Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).</li>
<li>Hu, W., Li, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial-based+advanced+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial-based advanced immunoassays.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).</li>
<li>Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYang-Kyu%2C+C+%22Biosensors+and+Cancer%22">Biosensors and Cancer</a>. , Science Publishers. 164-183 (2012).</li>
<li>Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltazar%2C+R+%22Nanocomposite+Particles+for+Bio-Applications%22">Nanocomposite Particles for Bio-Applications</a>. , Pan Stanford Publishing. 265-282 (2011).</li>
<li>Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO2+Nanotubes%3A+Synthesis+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+Nanofibrous+Membranes%3A+A+Novel+Solid+Substrate+for+Microfluidic+Immunoassays+for+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV.</a> Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).</li>
<li>Chantasirichot, S., Ishihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+phospholipid+polymer+substrate+for+enhanced+performance+in+immunoassay+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system.</a> Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+TiO2+Nanofiber-Based+Cell+Capture+Assay+for+Detecting+Circulating+Tumor+Cells+from+Colorectal+and+Gastric+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients.</a> Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).</li>
<li>Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-epidermal+growth+factor+receptor+conjugated+mesoporous+zinc+oxide+nanofibers+for+breast+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics.</a> Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).</li>
<li>Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+Biofunctionalized+Mesoporous+Electrospun+TiO2+Nanofiber+Based+Interface+for+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).</li>
<li>Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Potential+Photoelectrochemical+Biosensing+Using+Porphyrin-Functionalized+TiO2+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles.</a> Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).</li>
<li>Liu, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coadsorption+of+Horseradish+Peroxidase+with+Thionine+on+TiO2+Nanotubes+for+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing.</a> Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).</li>
<li>Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+biocompatibility+between+TiO2+nanotubes+layer+and+human+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomed.Mater.Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts.</a> J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).</li>
<li>Dettin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+surface+modification+of+titanium+oxide+with+different+adhesive+peptides%3A+Surface+characterization+and+osteoblast-like+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).</li>
<li>Kim, W. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Protein+Immobilization+Efficiency+on+a+TiO2+Surface+Modified+with+a+Hydroxyl+Functional+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group.</a> Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).</li>
<li>Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft+Copolymer-Templated+Mesoporous+TiO2+Films+Micropatterned+with+Poly%28ethylene+glycol%29+Hydrogel%3A+Novel+Platform+for+Highly+Sensitive+Protein+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).</li>
<li>Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+sensitivity+assays+for+human+cardiac+troponin+I+using+TiO2+nanotube+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays.</a> Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).</li>
<li>Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospinning+technique+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Use of electrospinning technique for biomedical applications.</a> Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).</li>
<li>Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanomaterials+for+ultrasensitive+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors.</a> Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).</li>
<li>Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+electrospun+nanofibrous+PVDF+membranes+into+a+microfluidic+chip+assembled+by+PDMS+and+scotch+tape+for+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).</li>
<li>Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -R., Park, Y. -S., Cho, Y. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+TiO2+nanofiber+integrated+lab-on-a-disc+for+ultrasensitive+protein+detection+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood.</a> Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).</li>
<li>Li, D., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Titania+Nanofibers+by+Electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning.</a> Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).</li>
<li>Lombard, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLombard%2C+M+%22SolidWorks+2013+BIBLE%22">SolidWorks 2013 BIBLE</a>. , John Wiley & Sons Inc. Indianapolis, IN. (2013).</li>
<li>Tickoo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTickoo%2C+S+%22EdgeCAM+11.0+for+Manufacturers%22">EdgeCAM 11.0 for Manufacturers</a>. , CADCIM Technologies. Schererville, IN. (2007).</li>
<li>Zhu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+adhesion+of+interconnected+TiO2+nanofiber+network+on+conductive+substrate+and+its+application+in+polymer+photovoltaic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices.</a> Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102(2008).</li>
<li>Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiO2+single-crystalline+nanorod+electrode+for+quasi-solid-state+dye-sensitized+solar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells.</a> Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113(2005).</li>
<li>Katsuhiro, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+processed+nanofibrous+TiO2+membranes+for+photovoltaic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications.</a> Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).</li>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der Assay auf TiO 2 NF integrierten Platte eine schnelle, kostengünstige und praktische Technik für die ultrasensitiver Detektion niedriger reichlich vorhandene Proteine ​​in sehr geringen Blutvolumen. Diese Technik hat den Vorteil der Verwendung von kleinen Probenvolumina (10 ul) und ist für die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig zugänglich. Dies stellt ein großes Potential als Multiplexing-Immunoassay-Gerät. Die Vorrichtung hat den zusätzlichen Vorteil, dass es nicht Probevorbehandlungsschritte wie Pl...

Mehrere Plattformen für die Diagnose von Krankheiten wurden auf Basis von nanoskaligen Materialien 1,2 wie Nanodrähte entwickelt, 3 - Nanopartikel, 4 - Nanoröhrchen, 5 und Nanofasern (NFS) 6-8. Diese Nanomaterialien bieten hervorragende Perspektiven bei der Gestaltung neuer Technologien für die hochsensiblen Biotests aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel haben mesoporösen Zinkoxid - Nanofasern für die Femto-molar empfindlichen Nachweis von Brustkrebs Biomarkern verwendet worden. 9 Kürzlich Basis Nanomaterialien auf Titandioxid (TiO 2) wurden für bioanalytische Anwendungen 10 unter Berücksichtigung ihrer chemischen Stabilität, 11 vernachlässigbar Proteindenaturierung untersucht , 12 und Biokompatibilität. 13 Außerdem erleichtern die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche der TiO 2 chemische Modifikation und die kovalente Anlagerung von Biomolekülen. 14,15 Patterned TiO 2 thin Filme 16 oder TiO 2 -Nanoröhren 17 die Detektionsempfindlichkeit eines Zielproteins zu verbessern , verwendet worden sind , durch den Oberflächenbereich zu erhöhen; jedoch ist das Herstellungsverfahren ziemlich komplex und erfordert eine teure Ausrüstung. Auf der anderen Seite, elektro NFs Aufmerksamkeit wegen ihrer hohen Oberfläche erhalten sowie einfache und kostengünstige Herstellungsverfahren; 18,19 noch die zerbrechliche oder lose Charakteristik des elektro TiO 2 NF Matte macht es schwierig zu handhaben und Integration mit mikrofluidischen Systemen. 6,20 Daher wurden die TiO 2 NF Matten selten in bioanalytischen Anwendungen eingesetzt, insbesondere solche , erfordern harte Waschbedingungen. In dieser Studie wurden diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir durch die Verwendung eines dünnen Polydimethylsiloxan (PDMS) Haftschicht, eine neue Technologie für die Übertragung der NF elektroMatten auf die Oberfläche eines beliebigen Zielsubstrat entwickelt. Furthermore haben wir erfolgreich zeigte die Integration der elektro TiO 2 NF Matten auf eine zentrifugale Mikrofluidikvorrichtung aus Polycarbonat (PC) hergestellt. Mit diesem Gerät wird eine hochempfindliche, vollautomatische und integrierte Detektion von C-reaktivem Protein (CRP) sowie kardialem Troponin I (cTnI) wurde aus 10 &amp; mgr; l Vollblut innerhalb von 30 min erreicht. 21 aufgrund der kombinierten Vorteile der Eigenschaften des NFS- und die zentrifugale Plattform der Assay einen breiten dynamischen Bereich von sechs Größenordnungen von 1 pg / ml (~ 8 fM) bis 100 ng / ml (~ 12.08) mit einer unteren Nachweisgrenze zeigten von 0,8 pg / ml (~ 6 fM) für CRP und einem dynamischen Bereich von 10 pg / ml (~ 12.04) bis 100 ng / ml (~ 4 nM) mit einer Nachweisgrenze von 37 pg / ml (~ 01.05) für cTnI. Diese Nachweisgrenzen sind ~ 300 und ~ 20-fach niedriger im Vergleich zu ihren entsprechenden herkömmlichen ELISA-Ergebnisse. Diese Technik könnte zum Nachweis von irgendwelchen Zielproteine ​​verwendet werden, mit entsprechenden Antikörpern. Insgesamt ist dieses Gerät could tragen wesentlich zur in-vitro - Diagnostik und biochemische Tests , da sie auch von sehr geringen Mengen an biologischen Proben selten Mengen von Zielproteinen mit großer Sensibilität erkennen kann, beispielsweise 10 &amp; mgr; l Vollblut. Obwohl wir nur die Serumproteinnachweis mittels ELISA in dieser Studie gezeigt, die Übertragung und Integration Technologie der elektro NFs mit mikrofluidischen Vorrichtungen breiter in anderen biochemischen Reaktionen angewendet werden kann, die eine große Oberfläche für eine hohe Detektionsempfindlichkeit erfordern.

<table><tbody><tr><td>Si-Wafer</td><td>LG SILTRON</td><td>Polierter Wafer, Prüfgüte</td><td>Ø (mm) = 150, Ausrichtung = < 100>, Dotierung = Bor, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, Dicke (&mu; m) = 650 - 700</td></tr><tr><td>Polycarbonat (PC) &nbsp;</td><td>Daedong Kunststoff</td><td>PCS#6900</td><td>Dicke (mm) = 1 und 5&nbsp;</td></tr><tr><td>Titantetraisopropoxid, 98%,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon, Mw = 1.300.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreies Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorsilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMS und Härter</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>GPDES</td><td>Gelest Inc</td><td>SIG5832.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>J T Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM</td><td></td></tr><tr><td>Röntgen-Photoelektronenspektroskopie</td><td>ThermoFisher</td><td>K-alpha</td><td></td></tr><tr><td>3D-Modellierungsmaschine</td><td>M& I CNC Lab, Korea</td><td></td><td>CNC-Fräsmaschine</td></tr><tr><td>Wachsdosiermaschine</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td><td></td><td>Kundenspezifisches</td></tr><tr><td>doppelseitiges Klebeband</td><td>FLEXcon, USA</td><td>DFM 200 klar 150 POLY H-9 V-95</td><td></td></tr><tr><td>Schneideplotter</td><td>Graphtec Corporation, Japan</td><td>Graphtec CE3000-60 MK2</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>MIDAS</td><td>SPIN-3000D</td><td></td></tr><tr><td>Ofen (Kalzinierung)</td><td>R. D. WEBB COMPANY</td><td>WEBB 99</td><td></td></tr><tr><td>Rheometer (Haftprobe)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Haake MARS&nbsp; III - ORM-Paket</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffplasmasystem</td><td>FEMTO</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonale Maus antihuman hsCRP</td><td>Hytest Ltd., Finnland</td><td>4C28</td> <td>(Klon # C5)</td></tr><tr><td>Monoklonale Maus Anti-cTnI</td><td>Hytest Ltd., Finnland</td><td>4T21</td> <td>(Klon # 19C7)</td></tr><tr><td>HRP konjugierte Ziege polyklonal anti-hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab19175</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjugierte monoklonale Maus anti-cTnI</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab24460</td> <td>(Klon # 16A11)</td></tr><tr><td>hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab111647</td><td></td></tr><tr><td>cTnI</td><td>Fitzgerald, MA</td><td>30-AT43</td><td></td></tr><tr><td>Rinderalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Amresco Inc</td><td>E404</td><td></td></tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen</td><td>BD Vacutainer</td><td>367844</td><td>K2 EDTA 7,2 mg plus Blut -Entnahmeröhrchen</td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA femto</td><td>Invitrogen</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Modularer Multilabel-Plattenleser</td><td>Perkin Elmer</td><td>Envision 2104</td><td></td></tr><tr><td>Disc-Bedienmaschine</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea</td><td></td><td>Kundenspezifische</td></tr><tr><td>Photomultiplier-Röhre (PMT)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>H1189-210</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td>Version 2012</td><td>Konstruktionssoftware</td></tr><tr><td>SolidWorks 3D CAD-Software&nbsp;</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Version 2013</td><td>3D-Design-Software,</td></tr> <tr><td>Edgecam</td><td>Vero</td><td>Software-Version 2009.01.06928</td><td>Code-Generierungssoftware</td></tr><tr><td>DeskCNC</td><td>Carken Co.</td><td>Version 2.0.2.18</td><td>CNC-Fräsmaschinen-Software</td></tr></tbody></table>

vollautomatische schleuder mikrofluidik-vorrichtung zur ultrasensitive proteindetektion aus vollblut

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist eine vielversprechende Methode, um kleine Mengen an Proteinen in biologischen Proben nachzuweisen. Die Geräte, die eine Plattform für ein reduziertes Probenvolumen und eine reduzierte Assay-Zeit sowie eine vollständige Automatisierung bieten, sind für den potenziellen Einsatz in der Point-of-Care-Diagnostik erforderlich. Kürzlich haben wir den ultrasensitiven Nachweis von Serumproteinen, C-reaktivem Protein (CRP) und kardialem Troponin I (cTnI) unter Verwendung eines Lab-on-a-Disc demonstriert, das aus TiO2-Nanofasermatten (NF) besteht. Es zeigte einen großen Dynamikbereich mit Nachweisempfindlichkeit bei femtomolaren (fM) ab einem kleinen Volumen Vollblut in 30 min. Das Gerät besteht aus mehreren Komponenten für die Bluttrennung, Dosierung, Mischung und Reinigung, die automatisiert sind, um die Empfindlichkeit bei geringen Probenvolumina zu verbessern. Hier, in der Videodemonstration, zeigen wir die experimentellen Protokolle und das Know-how für die Herstellung von NFs sowie die Scheibe, ihre Integration und den Betrieb in der folgenden Reihenfolge: Prozesse zur Herstellung von TiO2 NF mat; Transferdruck von TiO2 NF Matte auf die Disc; Oberflächenmodifikation für Immunreaktionen, Scheibenmontage und -betrieb; On-Disc-Nachweis und repräsentative Ergebnisse für Immunoassays. Die Verwendung dieses Geräts ermöglicht die Multiplex-Analyse mit minimalem Verbrauch von Proben und Reagenzien. Angesichts der Vorteile sollte das Gerät in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden und sich als vorteilhaft erweisen, um die Analyse von Proteinen mit geringen Häufigkeiten zu erleichtern.

Unter Verwendung dieses Protokolls, ein vollautomatisiertes zentrifugalen Mikrofluidik-Vorrichtung zum Proteinnachweis aus Vollblut mit hoher Empfindlichkeit hergestellt. Die TiO 2 NF Matten wurden durch Prozesse der Elektrospinnen und Calcinieren hergestellt. Um die FNs der gewünschten Durchmesser, Morphologie und Dicke, Elektroverspinnen Bedingungen wie Strömungsgeschwindigkeit, Spannung und Spinn Zeit wurden optimiert herzustellen. Wenn die Bedingungen nicht optimiert wurde...

Dieses Protokoll zeigt, wie eine femtomolare Nachweisempfindlichkeit von Proteinen in 10 μl Vollblut innerhalb von 30 min erreicht werden kann. Dies kann durch die Verwendung von elektrogesponnenen Nanofasermatten erreicht werden, die in eine Lab-on-a-Disc integriert sind und eine große Oberfläche sowie effektives Mischen und Waschen für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bieten.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Nachweisempfindlichkeit von ELISA unter Verwendung natürlicher gesponnener Nanofasern zu verbessern. Dieses Video zeigt, wie eine femtomolare Nachweisempfindlichkeit von Proteinen in 10 Mikrolitern Vollblutproben innerhalb von 30 Minuten erreicht werden kann. Bei einer Lab-on-a-Disc-Plattform wird die Zentrifugalkraft genutzt, um die Flüssigkeit durch die Kammern zu befördern, und der gesamte Prozess ist vollständig automatisiert.Die Detektionsempfindlichkeit könnte durch die Integration von Nanofasern stark erhöht werden. Das Problem war allerdings, dass die Nanofaser sehr zerbrechlich und schwer zu handhaben ist. In diesem Video stellen wir ein einfaches Verfahren vor, um zerbrechliche Titandioxid-Nanofasermatten auf einer Kunststoffscheibe zu befestigen.Um Titandioxid-Nanofasermatten auf Silikonsubstrat durch Elektrospinnen herzustellen, wird das Silikonsubstrat zunächst silanisiert, mit PDMS beschichtet und vorgehärtet. Eine Nanofasermatte wird dann auf dieses vorgehärtete PDMS übertragen und dieses Produkt wird gestanzt, um ein kreisförmiges Stück für die Befestigung herzustellen. Beschichten Sie die Reaktionskammer mit einem Tropfen PDMS als Klebstoff und befestigen Sie das kreisförmige Stück am Boden der Kammer.Härten Sie dann das PDMS im Ofen aus. Setzen Sie abschließend die Disc-Schichten zu einem kompletten Gerät für ELISA zusammen. Diese Nanofaser-Transfertechnik ermöglicht es uns, die große Oberfläche von Nanofasern für die Bioanalytik zu nutzen.Das zentrifugale mikrophylitische Gerät bietet die vollständige Integration und Automatisierung aller für ELISA erforderlichen Prozesse. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden besteht darin, dass sie femtomolare Konzentrationen von Proteinen aus nur 10 Mikrolitern Vollblut nachweisen kann. Bereiten Sie die Vorläuferlösungen vor, wie im beigefügten Prüfprotokoll beschrieben.Laden Sie dann die Lösung in den Elektrospinner und stellen Sie die Nanofasern durch Elektrospinnen unter den optimalen Bedingungen her. Wenn die Polymer-Nanofasermatten vorbereitet sind, kalzinieren Sie sie in einem Ofen unter Vakuum. Nach der Kalzinierung werden schließlich die Titandioxid-Nanofasermatten vorbereitet.Bereiten Sie das mikrophylitische Layout mit Hilfe von 3D-Konstruktionssoftware wie SOLIDWORKS vor und übertragen Sie die Konstruktion auf die CNC-Fräsmaschine. Bedienen Sie die CNC-Fräsmaschine, um die Scheibe mit Kanälen und Kammern herzustellen. Die Scheibe und die Nanofasermatte sind nun bereit für die Integration.Bereiten Sie eine Vakuumkammer, Silikonsubstrat und Fluorsilan vor. Silanisieren Sie das Silikonsubstrat 30 Minuten lang unter Vakuum mit Fluorsilan. Bereiten Sie das Gast-PDMS vor, indem Sie das Prepolymer mit einem Härter im Verhältnis 10 zu eins vorbereiten und die Beschichtung auf das silanisierte Silikonsubstrat bei 650 U/min für 60 Sekunden aufwirbeln.Härten Sie das auf dem silanisierten Wafer beschichtete PDMS 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius aus, um es haftend zu machen. Übertragen Sie nun diese Nanofasermatten auf das PDMS-beschichtete Silikon, indem Sie mit einem flachen Gegenstand, z. B. einem Objektträger, entsprechenden Druck ausüben. Backen Sie die Probe eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius, um den Klebstoff PDMS vollständig auszuhärten.Geben Sie ein paar Tropfen Ethanol auf die Nanofasermatten, die auf der PDMS-Schicht befestigt sind, und bohren Sie mit einem PunchIt ein Loch mit einem Durchmesser von sechs Millimetern. Ziehen Sie dann die gestanzten Nanofasermatten, die auf dem PDMS befestigt sind, vom Silikonsubstrat ab. Beschichten Sie als Nächstes die Bindungsreaktionskammer in der Scheibe mit etwa 20 Mikrolitern PDMS-Gemisch und platzieren Sie die auf dem PDMS befestigten Nanofasern in den Kammern.Inkubieren Sie dann die in die Nanofasermatte integrierte Scheibe eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Lösung von GPDES mit 1 Vol.-% in Ethanol vor. Behandeln Sie dann die Nanofasern in der Scheibe mit Sauerstoffplasma.Geben Sie 100 Mikroliter GPDES-Lösung auf jede Nanofasermatte und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Behälter. Entfernen Sie nach der Inkubation die GPDES-Lösung, indem Sie mit der Scheibe auf einen Wischer klopfen. Mit Ethanol waschen, herausnehmen und eine Stunde bei 80 Grad Celsius backen.Nach dem Backen mit Ethanol waschen und zum Entfernen klopfen. Diesen Vorgang wiederholen und mit einem Stickstoffstrahl trocken föhnen. Für die Immobilisierung von Antikörpern ist verdünnte eingefangene Antikörperlösung zu dispensieren.Bewahren Sie die Scheiben in einer befeuchteten Kammer auf und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad. Waschen Sie die restliche Lösung mit Waschpuffer ab. Montieren Sie nun die Scheibe mit einem doppelseitigen Klebeband.Üben Sie angemessenen Druck aus, um die Schichten zu einer vollständigen Scheibe zusammenzusetzen. Füllen Sie die Bindungsreaktionskammern mit Blockierungspuffer und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Scheibe zweimal mit Waschpuffer und lagern Sie die Scheibe bis zur Verwendung bei 40 Grad Celsius.Laden Sie die Reagenzien, Waschpuffer und 10 Mikroliter Vollblut in die Reagenz- und Probenkammern. Legen Sie die Disc in eine speziell angefertigte Visualisierungsmaschine für den automatisierten Immunoassay. Das Visualisierungssystem besteht aus einem Rotor, der mit einem Computer für den automatisierten Disc-Betrieb verbunden ist, zusammen mit einem Stroboskoplicht und einer CCD-Kamera für die Bildaufnahme.Drehen Sie die Scheibe 60 Sekunden lang mit 3.600 U/min, um die roten Blutkörperchen zu trennen. Mischen Sie Plasma mit den Nachweisantikörpern. Übertragen Sie das Gemisch in die Reaktionskammer, in die die Titandioxid-Nanofasermatte integriert ist.Waschen Sie die Nanofasern nach der Immunreaktion, indem Sie den Waschpuffer in die Reaktionskammer überführen. Übertragen Sie dann die chemilumineszierende Substratlösung in die Bindungsreaktionskammer und inkubieren Sie sie eine Minute lang in einem Mischmodus. Übertragen Sie abschließend die umgesetzte Substratlösung in die Detektionskammer.Wenn die gesamte Reaktion abgeschlossen ist, übertragen Sie die Scheibe auf ein Detektionssystem und lesen Sie das Chemilumineszenzsignal mit Hilfe einer speziell entwickelten Software aus. Der Disc-Betrieb und das Detektionssystem können in einer einzigen Plattform integriert werden. Durch die Optimierung der Spannung und des Fluorats wurden gleichmäßige Nanofasermatten erhalten, wie in diesem REM-Bild zu sehen ist.Um die Aushärtezeit des PDMS zu optimieren, wurde die Adhäsionskraft gemessen. War sie zu kurz, wurde die Nanofasermatte in PDMS eingebettet, oder bei zu langer Länge abgezogen. Nach der Optimierung wurde die Nanofasermatte dann stabil auf dem PDMS befestigt.Der lineare Bereich für den Nachweis von C-reaktiven Proteinen von zwei Plattformen ist in dieser Grafik dargestellt. Mit dem Nanofaser-Integritätslabor auf der Disc konnten wir innerhalb von 30 Minuten eine stark verbesserte Nachweisempfindlichkeit von C-reaktivem Protein aus nur 10 Mikrolitern Serum erreichen. Derzeit verfügbare Technologien, wie z. B. der plattenbasierte 96-Well-ELISA, erfordern ein größeres Probenvolumen und eine längere Nachweiszeit.Insgesamt zeigte der in Nanofasern integrierte scheibenbasierte ELISA einen breiten, dynamischen Bereich von sechs Größenordnungen mit einer Nachweisgrenze von sechs Femtomol des C-reaktiven Proteins. Diese Nachweisempfindlichkeit, unterstützt durch die hohe Oberfläche der in die Scheibe integrierten Nanofaser, übertraf die des herkömmlichen ELISA, der auf 2.000 Femtomol begrenzt war. Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein zentrifugales mikrophylitisches Gerät vorbereitet, wie man phasale Nanofasern integriert und wie man den Proteinnachweis mit ELISA durchführt.Diese Technik kann nützlich sein, um niedrig gebundene Proteine in einer sehr kleinen Menge biologischer Proben nachzuweisen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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