Ein zellfreien Assay unter Verwendung von Xenopus laevis Embryo Extrahiert Mechanismen der Kerngröße Verordnung zum Studium

Mechanismen der zellulären und intrazellulären Skalierung bleiben schwer fassbar. Die Verwendung von Xenopus-Embryoextrakten wird immer häufiger, um die Mechanismen der Organellengrößenregulation aufzuklären. Diese Methode beschreibt die Herstellung von Embryonenextrakten und einen neuartigen Kernskalierungsassay, durch den Mechanismen der Kerngrößenregulation identifiziert werden können.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe von Xenopus-Ei- und Embryoextrakten einen Assay herzustellen, bei dem große Zellkerne kleiner schrumpfen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Kernzellbiologie zu beantworten, wie z. B. welche Mechanismen die Kerngröße regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zusammensetzung und die Aktivitäten des zellfreien Xenopus-Extrakts leicht manipuliert werden können, um die Fakten über die Kerngröße zu bewerten.

Nach der Aufbereitung von Xenopus-Eiextrakten, demembranierten Spermien und zusammengesetzten Zellkernen gemäß dem Textprotokoll sammeln Sie frisch gelegte Eier, indem Sie Frösche über eine wiederverwendbare Petrischale aus Glas halten. Fördern Sie die Eiablage, indem Sie sanften Druck auf den unteren Rücken in der Nähe der Kloake ausüben. Stützen Sie die Schüssel in einem Winkel von etwa 45 Grad ab, damit sich die Eier am Rand der Schüssel sammeln können.

Entfernen Sie dann den überschüssigen Puffer und fügen Sie so viel X MMR hinzu, dass die Eier kaum bedeckt sind. Mit einem fest sitzenden Stößel mazerieren und homogenisieren Sie 1/4 eines Hodens in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 500 Mikrolitern salzreicher modifizierter Barth-Kochsalzlösung oder MBS. Geben Sie dann den mazerierten Hoden zu den Eiern und lassen Sie die Befruchtung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur erfolgen.

Nach der Inkubation die Eier mit einem Drittel X MMR fluten. Bestätigen Sie dann, fünf bis 10 Minuten später, die Befruchtung, indem Sie die Kontraktion des dunkel pigmentierten Tierpols überprüfen und die Embryonen mit den tierischen Polen nach oben drehen. Entferne mit einer Plastikpipette mit breiter Bohrung sorgfältig tote, lysierte oder unbefruchtete, ungespaltene Eizellen, da sie bei benachbarten Embryonen schnell zum Tod führen.

Irgendwo zwischen einer und 2,5 Stunden nach der Befruchtung entgalten die Embryonen in zwei bis drei Prozent Cystein, aufgelöst in einem Drittel X MMR, das auf pH 7,9 eingestellt wurde. Vor dem Entgummiern nehmen Embryonen ein relativ großes Volumen ein. Führen Sie zwei Pufferwechsel für jeweils drei bis vier Minuten durch.

Waschen Sie dann die Embryonen gründlich mit sechs bis 10 kurzen Wechseln von einem Drittel X MMR, um alle Spuren von Cystein zu entfernen. Nach der Entgummierung packen die Embryonen dicht zusammen und nehmen ein relativ kleines Volumen ein. Als nächstes übertragen Sie mit einer Glaspipette mit breiter Bohrung gesunde, befruchtete Embryonen in eine Petrischale, die frisches Drittel X MMR enthält.

Lassen Sie sie bei Raumtemperatur bis zum gewünschten Stadium entwickeln. Fahren Sie mit der Entnahme toter oder lysierter Embryonen fort, was durch das Fehlen der ersten Teilung oder ein weißes, geschwollenes Aussehen angezeigt wird. Wenn die Embryonen die Stadien 11,5 bis 12 erreicht haben, überführen Sie sie in frisches Drittel X MMR, das mit 0,5 millimolar Cycloheximid ergänzt wird, und inkubieren Sie die Embryonen eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um sie in der späten Interphase zu fixieren.

Übertragen Sie mit einer Glas- oder Kunststoffpipette mit breiter Bohrung mindestens 15 interphasenarrestierte Embryonen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie einen Millileter Eizelllysepuffer (ELB) zu den Embryonen, ergänzt mit einem Mikroliter LPC-Brühe. Drehen Sie den Schlauch vorsichtig um, um die Embryonen zu waschen.

Lassen Sie dann die Embryonen auf den Boden der Röhre fallen. Bevor Sie den Puffer entfernen, wiederholen Sie die Wäsche noch zwei weitere Male. Resuspendieren Sie die Embryonen in 500 Mikrolitern ELB plus 0,5 Mikroliter LPC-Stamm, 5 Mikroliter 19,7 millimolare Cycloheximide und 5 Mikroliter 35,5 millimolare Cytochalasin D, um die Aktinpolymerisation zu hemmen.

Zentrifugieren Sie die Proben in einer Tischzentrifuge eine Minute lang bei 200 mal G, entfernen Sie dann den überschüssigen Puffer und zerkleinern Sie die Embryonen mit einem Stößel gründlich. Geben Sie die zerkleinerten Proben in einen schwingenden Rotor und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 10.000 G und 16 Grad Celsius. Stechen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze die Lipidschicht von oben ein und entfernen Sie mit einer sauberen Pipettenspitze die mittlere zytoplasmatische bernsteinfarbene Schicht in ein Röhrchen geeigneter Größe.

Ergänzen Sie den Embryoextrakt mit den folgenden Reagenzien. Drehen Sie dann das Röhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Dann, nach der Visualisierung der endogenen embryonalen Kerne im Extrakt durch Vorbereitung eines Kürbisses gemäß dem Textprotokoll, entfernen Sie die Kerne aus dem Extrakt, indem Sie zuerst ein gleiches Volumen ELB hinzufügen, das die hier aufgeführten Reagenzien enthält.

Drehen Sie das Röhrchen zum Mischen vorsichtig um. Zentrifugieren Sie die Probe in einem schwingenden Schaufelrotor bei 17.000 μm bei 16 Grad Celsius für 15 Minuten. Sammeln Sie dann den Überstand, achten Sie darauf, dass oben kein Lipid übrig bleibt, und lassen Sie die pelletierten Kerne unten ungestört.

Bereiten Sie einen Kürbis vor, wie im Textprotokoll beschrieben, um sicherzustellen, dass die meisten Kerne entfernt wurden. Verwenden Sie dann den frischen Extrakt oder aliquotieren Sie die Probe und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Isolieren Sie die im Eiextrakt zusammengesetzten Kerne, indem Sie 25 bis 150 Mikroliter vormontierter Zellkerne in einem Millileter ELB in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen verdünnen.

Zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 1600 μg und vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Puffer und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Geben Sie dem Pellet ein Volumen Embryoextrakt, das dem ursprünglichen Volumen des Eiextrakts entspricht, und klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um das Pellet aufzubrechen und die Zellkerne wieder zu suspendieren.

90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dabei alle 15 bis 30 Minuten vorsichtig auf das Röhrchen klopfen, um es zu mischen. Klopfen Sie nach der Inkubation auf das Röhrchen, um die Zellkerne zu resuspendieren, bevor Sie 500 Mikroliter ELB mit 15 % Glycerin und 2,6 % Paraformaldehyd hinzufügen. Drehen Sie das Rohr sofort um und legen Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rotator.

Bereiten Sie Spin-Down-Röhrchen vor, indem Sie 15-Milliliter-Glasröhrchen mit rundem Boden mit Kunststoffeinsätzen mit rundem Boden ausstatten. Fügen Sie 5 Milliliter nuklearen Puffer hinzu und lassen Sie dann ein 12 Millimeter langes kreisförmiges Deckglas in das Röhrchen fallen, wobei Sie darauf achten, dass es flach auf dem Kunststoffeinsatz liegt. Mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung die fixierte Kernlösung vorsichtig auf das Kernpolster aufschichten.

Zentrifugieren Sie es in einem schwingenden Schaufelrotor bei 1.000 mal G und 16 Grad Celsius für 15 Minuten. Verwenden Sie als Nächstes einen Aspirator, um den gesamten Puffer zu entfernen, und halten Sie den Kunststoffeinsatz an der Oberseite des Rohrs. Entfernen Sie dann mit einer feinen Pinzette das Deckglas, wobei Sie darauf achten, auf welche Seite des Deckglases die Kerne gesponnen wurden.

Fixieren Sie das Deckglas fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in kaltem Methanol. Übertragen Sie das Deckglas mit der Keimseite nach oben auf eine Folie aus Plastikparaffinfolie, die eine große Petrischale aus Kunststoff auskleidet. Legen Sie dann feuchte Einwegtücher an den Rand der Schüssel, um ein Austrocknen zu verhindern.

Mit 500 Mikrolitern PBS NP40 rehydrieren Sie die Zellkerne auf dem Deckglas für fünf bis 10 Sekunden und aspirieren. Schichten Sie dann vorsichtig 75 Mikroliter PBS 3%BSA auf das Deckglas und lassen Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht vier Grad Celsius trocknen. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und inkubieren Sie ihn mit einem in PBS 3%BSA verdünnten Primärantikörper.

Waschen Sie dann die Proben mit fünf sofortigen Wechseln von PBS NP40. Wiederholen Sie diese Inkubations- und Waschschritte mit Sekundärantikörpern. Inkubieren Sie mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Hoechst, dilatiert in PBS 3%BSA für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Dann fünfmal mit PBS NP40 waschen und den überschüssigen Puffer entfernen. Montieren Sie abschließend das Deckglas auf ein Objektträger mit fünf Mikrolitern lichtechtem Eindeckmedium. Verwenden Sie klaren Nagellack, um das Deckglas zu versiegeln und sofort mit einem Epifluoreszenzmikroskop abzubilden oder für die spätere Bildgebung bei 40 Grad Celsius zu lagern.

Diese Abbildung zeigt die Assemblierung der Eizellextraktkerne. 30-45 Minuten nach Beginn der Reaktion sollten die dünnen, S-förmigen Spermienkerne beginnen, sich zu schneckenförmigen Chromatinmassen zu verdicken. Nach dem Zusammenbau des Kerns sollte die Kernform runder werden, und das Kernvolumen sollte zunehmen, wenn sich die Kernhülle ausdehnt und Kernproteine importiert werden.

Wie hier gezeigt, zeigt ein Hoechst-gefärbter Kürbis eines kleinen Aliquots des Embryoextrakts viele gefärbte Zellkerne, was darauf hindeutet, dass die Extraktherstellung erfolgreich war. Nach der Kernentfernung durch Zentrifugation sollten im Vergleich zum ersten Kürbis nur sehr wenige Kerne im Extrakt verbleiben, wie in diesem Panel gezeigt, um sicherzustellen, dass endogene Kerne die nachgelagerte Analyse nicht beeinträchtigen. Sind noch Zellkerne vorhanden, ist eine zweite Zentrifugationsrunde erforderlich.

In diesem Kernschrumpfungstest werden die Kerne des Eiextrakts, die im Embryoextrakt im Spätstadium resuspendiert sind, im Laufe der Zeit erfolgreich kleiner. Zellkerne, die mit hitzeinaktiviertem Embryoextrakt inkubiert wurden, tun dies jedoch nicht. Die mehrmalige Wiederholung des Experiments ist wichtig, um die inhärente Variabilität des Assays zu berücksichtigen.

Einmal gemeistert, kann das gesamte Protokoll in zwei Tagen durchgeführt werden, wobei der Kernschrumpfungsassay selbst etwa vier Stunden dauert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Qualität der Eizellen und Embryonen durchgehend zu überprüfen und sehr vorsichtig zu sein, um die Pellet- und Lipidschichten zu vermeiden, wenn zytoplasmatische Extrakte nach der Zentrifugation entnommen werden. Die Ergebnisse, die durch Befolgen dieses Verfahrens erzielt werden, sollten validiert werden.

Zum Beispiel die Mikroinjektion meines Embryos oder die Transfektion von Zellkulturen. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die Größenregulation anderer Organellen zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kernzellbiologie, um die Regulationsmechanismen der Kerngröße und die funktionelle Rolle der Kerngröße bei der Entwicklung und Karzinogenese zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Xenopus-Eizellextraktkerne zusammensetzt und isoliert, Xenopus-Embryonen und Embryoextrakt erzeugt, den Kernschrumpfungsassay durchführt und die Ergebnisse visualisiert.