Ein zellfreien Assay unter Verwendung von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, aus Xenopus-Ei- und Embryonal-Extrakten einen Assay zu erstellen, bei dem große Kerne kleinere schrumpfen lassen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der nukleären Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise, welche Mechanismen die Kerngröße regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Zusammensetzung und Aktivität von Xenopus-Zellfreien-Extrakten leicht verändert werden können, um die Faktoren, die die Kerngröße beeinflussen, zu untersuchen.

Nach der Herstellung von Xenopus-Ei-Extrakten, entmembranisierten Spermien und aufgebauten Kernen gemäß dem Textprotokoll sammeln Sie frisch gelegte Eier, indem Sie die Frösche über einer Glas-Petrischale, die wiederverwendet werden kann, halten. Fördern Sie das Ablegen der Eier, indem Sie sanften Druck auf den unteren Rücken in der Nähe der Kloake ausüben. Stellen Sie die Schale in einem Winkel von etwa 45 Grad schräg, damit sich die Eier entlang des Randes der Schale sammeln können.

Entfernen Sie anschließend den überschüssigen Puffer und geben Sie so viel ein Drittel X MMR hinzu, dass die Eier gerade bedeckt sind. Zerkleinern und homogenisieren Sie mit einem passgenauen Pistill ein Viertel eines Hodens in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 500 Mikrolitern hochsalzhaltigem modifiziertem Barth-Salz (MBS). Geben Sie danach den zerkleinerten Hoden zu den Eiern und lassen Sie die Befruchtung 15 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen.

Nach der Inkubation die Eier mit einem Drittel X MMR überschwemmen. Fünf bis zehn Minuten später die Befruchtung überprüfen, indem man auf eine Kontraktion des dunkel pigmentierten animalen Pols achtet und die Embryonen auf Drehung mit nach oben zeigenden animalen Polen hin untersucht. Mit einer Pipette mit großer Öffnung sorgfältig tote, lysierte oder unbefruchtete, nicht gespaltene Eier entfernen, da diese schnell den Tod benachbarter Embryonen auslösen können.

Zwischen einer und 2,5 Stunden nach der Befruchtung werden die Embryonen in zwei bis drei Prozent Cystein, gelöst in einem Drittel X MMR, das auf pH 7,9 eingestellt wurde, entzottet. Vor der Entzottung nehmen die Embryonen ein relativ großes Volumen ein. Führen Sie zwei Pufferwechsel durch, jeweils drei bis vier Minuten lang.

Anschließend die Embryonen gründlich mit sechs bis zehn kurzen Wechseln von einem Drittel X MMR waschen, um alle Reste von Cystein zu entfernen. Nach dem Entfernen der Eihüllen lagern sich die Embryonen dicht ab und nehmen ein relativ geringes Volumen ein. Danach gesunde, befruchtete Embryonen mittels einer Glaspipette mit großem Durchmesser in eine Petrischale überführen, die frisches ein Drittel X MMR enthält.

Und bei Raumtemperatur die Embryonen bis zum gewünschten Entwicklungsstadium weiterentwickeln lassen. Toten oder lysierten Embryonen, die sich durch das Ausbleiben der ersten Teilung oder ein weißes, aufgequollenes Aussehen bemerkbar machen, wie angegeben entfernen. Wenn die Embryonen das Stadium 11,5 bis 12 erreicht haben, überführen sie in frisches, auf ein Drittel verdünntes X MMR, das mit 0,5 Millimolar Cycloheximid ergänzt wurde, und inkubieren die Embryonen eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um sie im späten Interphasestadium anzuhalten.

Überführen Sie mit einer Pipette mit großer Öffnung aus Glas oder Kunststoff mindestens 15 in der Interphase arrestierte Embryonen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie einen Milliliter Ei-Lysepuffer (ELB) zuzüglich eines Mikroliters LPC-Standardlösung zu den Embryonen hinzu. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um die Embryonen zu waschen.

Die Embryonen dann am Boden des Röhrchens absetzen lassen. Vor dem Entfernen des Puffers den Waschschritt noch zweimal wiederholen. Die Embryonen in 500 µL ELB resuspendieren, zuzüglich 0,5 µL LPC-Grundlösung, 5 µL 19,7 mM Cycloheximid und 5 µL 35,5 mM Cytochalasin D, um die Aktinpolymerisation zu hemmen.

Zentrifugieren Sie die Proben in einer Tischzentrifuge bei 200 × g für eine Minute, entfernen Sie dann den überschüssigen Puffer und zerkleinern Sie die Embryonen gründlich mit einem Stößel. Geben Sie die zerkleinerten Proben in einen Schwenkrotor und zentrifugieren Sie bei 10.000 × g und 16 °C für 10 Minuten. Durchbohren Sie mit einer 200 µL-Pipettenspitze die Lipidschicht von oben und entnehmen Sie mithilfe einer sauberen Pipettenspitze die mittlere, zytoplasmatische, bernsteinfarbene Schicht in ein passendes Gefäß.

Ergänzen Sie den Embryo-Extrakt mit den folgenden Reagenzien. Anschließend vorsichtig den Probengefäß umstülpen, um zu mischen. Danach, nachdem endogene embryonale Kerne im Extrakt durch Herstellung eines Präparats gemäß dem schriftlichen Protokoll sichtbar gemacht wurden, entfernen Sie die Kerne aus dem Extrakt, indem Sie zunächst ein gleiches Volumen ELB hinzufügen, das die hier aufgeführten Reagenzien enthält.

Vorsichtig den Probenschlauch umstülpen, um zu mischen. Die Probe in einem Schwenkrotor bei 17.000 × g und 16 °C 15 Minuten lang zentrifugieren. Anschließend das Überstand aufsammeln, wobei darauf geachtet werden sollte, jegliches verbleibende Lipid an der Oberfläche zu vermeiden, und die pelletierten Kerne am Boden ungestört lassen.

Bereiten Sie eine Aufschlämmung wie im textlichen Protokoll beschrieben vor, um sicherzustellen, dass die meisten Kerne entfernt wurden. Verwenden Sie anschließend das frische Extrakt oder portionieren Sie die Probe und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Isolieren Sie im Ei-Extrakt gebildete Kerne, indem Sie 25 bis 150 Mikroliter vorgebildeter Kerne in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter ELB verdünnen.

Zentrifugieren bei 1600 × g und vier Grad Celsius für drei Minuten. Anschließend den Überstand entfernen, wobei darauf zu achten ist, den Pellet nicht zu stören. Zum Pellet ein Volumen an Embryo-Extrakt hinzufügen, das dem ursprünglichen Volumen des Ei-Extrakts entspricht, und das Röhrchen vorsichtig antippen, um den Pellet aufzulösen und die Kerne erneut in Suspension zu bringen.

90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dabei alle 15 bis 30 Minuten vorsichtig den Kolben antippen, um die Probe zu mischen. Vor dem Hinzufügen von 500 µL ELB mit 15 % Glycerin und 2,6 % Paraformaldehyd den Kolben antippen, um die Kerne erneut in Suspension zu bringen. Den Kolben unmittelbar nach dem Zugabe umdrehen und anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator platzieren.

Bereiten Sie Spin-down-Röhrchen vor, indem Sie 15-Milliliter-Rundboden-Glasröhrchen mit Rundboden-Kunststoffeinsätzen ausstatten. Geben Sie 5 Milliliter Kern-Puffer unterlage hinzu und legen Sie eine kreisförmige Deckglasplatte mit 12 Millimeter Durchmesser vorsichtig in das Röhrchen, wobei sichergestellt werden muss, dass sie flach auf dem Kunststoffeinsatz liegt. Schichten Sie mithilfe einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser die fixierten Zellkerne vorsichtig auf die Kern-Pufferunterlage auf.

Zentrifugieren Sie es in einem Schwenkkorbrotor bei 1.000 × g und 16 °C für 15 Minuten. Entfernen Sie anschließend mit einem Aspirator sämtlichen Puffer und halten Sie den Kunststoffeinsatz an die Oberseite des Röhrchens. Entfernen Sie dann mit einer feinen Pinzette die Deckglas, wobei Sie darauf achten sollten, welche Seite des Deckglases die spinierten Kerne enthält.

Fixieren Sie die Deckglasprobe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in kaltem Methanol. Legen Sie das Deckglas mit der Kernseite nach oben auf eine Folie aus Paraffinfolie, die eine große, plastische Petrischale auskleidet. Anschließend platzieren Sie feuchte Einweg-Tücher entlang der Seitenwand der Schale, um Austrocknung zu verhindern.

Mit 500 Mikrolitern PBS NP40 die Kerne auf der Deckglasprobe für fünf bis zehn Sekunden rehydrieren und anschließend aspirieren. Danach vorsichtig 75 Mikroliter PBS mit 3 % BSA auf das Deckglas auftragen und eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 Grad Celsius blockieren lassen. Den Blockierpuffer entfernen und mit primärem Antikörper, der in PBS mit 3 % BSA verdünnt wurde, inkubieren.

Anschließend die Proben mit fünfmaligem sofortigem Wechsel von PBS NP40 waschen. Die Inkubations- und Waschschritte mit sekundären Antikörpern wiederholen. Mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Hoechst, verdünnt in PBS 3 % BSA, fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Anschließend fünfmal mit PBS NP40 waschen und sämtlichen überschüssigen Puffer entfernen. Zum Schluss die Deckglas auf einen Objektträger mit fünf Mikrolitern Anti-Fade-Montagemedium aufbringen. Das Deckglas mit klarem Nagellack versiegeln und unverzüglich mit einem Epifluoreszenzmikroskop abbilden oder zur späteren Bildaufnahme bei 40 Grad Celsius lagern.

Diese Abbildung zeigt die Assembly von Kernen aus Ei-Extrakten. 30–45 Minuten nach Start der Reaktion sollten sich die dünnen, S-förmigen Spermienkerne zu schleimig geformten Chromatinmassen verdicken. Nach der Kern-Assembly sollte die Kernform runder werden und das Kernvolumen zunehmen, während sich die Kernmembran ausdehnt und Kernproteine importiert werden.

Wie hier gezeigt, zeigt eine mit Hoechst angefärbte Ausstrichprobe einer kleinen Portion des Embryo-Extrakts viele gefärbte Kerne, was darauf hinweist, dass die Herstellung des Extrakts erfolgreich war. Nach der Entfernung der Kerne durch Zentrifugation sollten im Vergleich zum ersten Ausstrich nur noch sehr wenige Kerne im Extrakt verbleiben, wie in diesem Panel dargestellt, um sicherzustellen, dass endogene Kerne die nachfolgende Analyse nicht stören. Falls weiterhin Kerne vorhanden sind, ist eine zweite Zentrifugationsrunde erforderlich.

Bei diesem Kernschrumpf-Assay verkleinern sich in späten Embryo-Extrakten resuspendierte Eizell-Extrakt-Kerne im Laufe der Zeit erfolgreich. Kerne, die jedoch mit hitzeinaktiviertem Embryo-Extrakt inkubiert werden, zeigen diese Verkleinerung nicht. Wiederholungen des Experiments mehrfach sind wichtig, um die inhärente Variabilität des Assays zu berücksichtigen.

Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann das gesamte Protokoll innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden, wobei der Kernschrumpf-Test selbst etwa vier Stunden in Anspruch nimmt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Eier und Embryonen während des gesamten Prozesses qualitätszukontrollieren und bei der Gewinnung des zytoplasmatischen Extrakts nach der Zentrifugation darauf zu achten, den Pellet- und den Lipidschicht-Bereich sorgfältig zu vermeiden. Die mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sollten validiert werden.

Beispielsweise meine Embryoinjektion oder die Transfektion von Zellkulturen. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die Größenregulation anderer Organellen zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Zellkernbiologie den Weg, um die regulatorischen Mechanismen der Kerngröße sowie die funktionelle Rolle der Kerngröße bei Entwicklung und Karzinogenese zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kerne aus Xenopus-Ei-Extrakten zusammenbaut und isoliert, Xenopus-Embryonen und Embryo-Extrakte herstellt, den Kernschrumpf-Test durchführt und die Ergebnisse visualisiert.