Name: Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie menschliche Tumorzellen aus Maus-Xenografts durch magnetische Zellsortierung mit Anti-Maus-Antikörpern isolieren. Diese Methode ermöglicht unverzerrte Genexpressionsanalysen und verbesserte Sequenzierungsdaten.

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Wir danken Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow und Dorothee Lenhard für die hervorragende technische Unterstützung.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen ethischen und rechtlichen Vorgaben des Regierungspräsidium Freiburg Referat 35 durchgeführt. 1. Vorbereitung der Reagenzien HINWEIS: Vor dem Versuch, die folgenden Reagenzien aus der Dissoziation Kit vorbereiten: <ol><li> Zur Herstellung von Enzym H RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) oder Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) lösen jedes Fläschchen des gefriergetrocknetes Pulver in 3 ml. Um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen vorbereiten geeignete Aliquots zu vermeiden (zB 200 &amp; mgr; l) und speichert sie bei - 20 ° C bis zu 6 Monaten. </li><li> Zur Herstellung von Enzym-R das Fläschchen des gefriergetrocknetes Pulver in 2,7 ml RPMI oder DMEM-Medium aufzulösen. Um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen vorbereiten geeignete Aliquots zu vermeiden (zB 100 &amp; mgr; l) und speichert sie bei - 20 ° C bis zu 6 Monaten. </li><li> Zur Herstellung von Enzym A lösen die vial des gefriergetrocknetes Pulver in 1 ml Puffer A mit dem Kit geliefert, ohne Verwirbelung. Um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen vorbereiten geeignete Aliquots zu vermeiden und lagern Sie sie an (zB 25 &amp; mgr; l.) - 20 ° C bis zu 6 Monaten. Achten Sie darauf, diese Suspension gründlich zu mischen, unmittelbar bevor die erforderliche Reaktionsvolumen zurückziehen. </li><li> Bereiten 250 ml Puffer (1x PBS mit 0,5% BSA) für Zelltrennungsverfahren und Antikörperfärbung. HINWEIS: Bei der Kultivierung von Zellen nach der Entfernung von Mauszellen auswählen, alle Puffer und Enzymlösungen durch ein 0,22 um-Filter. </li></ol> 2. Tumor Distanzierung Protokoll HINWEIS: In dieser Studie Patienten stamm Xenotransplantate von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), wurden Nierenkrebs und Blasen verwendet. Die Tumoren wurden erzeugt , indem Xenotransplantate von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Nierenkrebs und Blasen in 4 Implantieren - 6 Wochen alten weiblichen NMRI nu / nu - Mäusen , wie zuvor beschrieben 13 </sup&gt;. Hinweis: Da dieses Protokoll vollständig unabhängig von dem Tumortyp ist, kann es für jede Art von Patient oder Zelllinie abstammenden Tumoren sowie andere Arten von menschlichen xenotransplantierten Gewebe ohne Modifikation des Protokolls verwendet werden. <ol><li> Bereiten 5 ml Verdauungsmischung pro Gewebeprobe (bis zu 1 g) frisch durch Zugabe von 4,7 ml RPMI 1640 oder DMEM, 200 ul Enzym H, 100 ul Enzym R, und 25 &amp; mgr; l Enzym A in ein zelluläres Dissoziation Rohr ( C-Schlauch). Stellen Sie sicher, Enzym R Suspension gründlich zu mischen, bevor das erforderliche Volumen abzuziehen. </li><li> Opfern, um die Tiere durch Genickbruch unter Narkose. Desinfizieren Maus durch mit kleinen Menge von 80% v / v Ethanol Aufsprühen. </li><li> Ernte subkutanen Tumor aus der Maus Flanke mit einer Pinzette und Schere in einer Gewebekultur Kapuze. Schneiden Sie die Haut offen anstelle der Tumor Schere und trennen sich dann den Tumor von benachbarten gesunden Gewebe mit einer Pinzette und Schere. HINWEIS: In Abhängigkeit von dem Zweckdas Experiment dieser und den folgenden Schritten unter aseptischen Bedingungen durchzuführen. In dieser Studie wurden alle Schritte in einem Zellkulturhaube unter aseptischen Bedingungen, um in der Lage, die Zellen zu kultivieren, durchgeführt wird. </li><li> Bereiten Sie die Tumorprobe für Aufschlüsse durch Fett zu entfernen und Nekrosen (da dies die Probe Schwimmer machen) (da dies zu einer verminderten Rentabilität führen wird) durch Wegschneiden Zange und mit einem Skalpell. Zerkleinern das Gewebe in Stücke von 2 bis 4 mm durch Skalpelle und Pinzetten verwendet wird. </li><li> Übertragen Sie die Gewebestücke in die C-Tube mit der Verdauung Mix. </li><li> Schließen Sie den C-Schlauch und stellen Sie sicher, dass es fest geschlossen ist. Bringen Sie ihn auf den Kopf auf die Hülse des Benchtop Gewebe Dissociator und stellen Sie sicher, dass die Gewebestücke im Bereich des Rotor / Stator befinden. </li><li> Wählen Sie den Modus &quot;h_tumor_01&quot; durch die &quot;nach oben&quot; drücken oder &quot;down&quot; -Taste, bis der Modus im Display angezeigt wird und drücken Sie dann die Schaltfläche &quot;Start&quot;. <ol><li> Wenn dusingen die Heizfunktion des Benchtop Gewebe Dissociator, stellen Sie sicher, auch die Heizung anschließen. Dann führen Sie Modus 37C_h_TDK_1 (für weiche Tumoren), 37C_h_TDK_2 (für mittlere Tumoren) oder 37C_h_TDK_3 (für harte Tumoren), indem Sie den Ordner-Symbol auf dem Touchscreen klicken, bis der Ordner &quot;Miltenyi&quot; erscheint. </li><li> Um den Modus zu wählen, klicken Sie auf den Aufwärts- oder Abwärtspfeil, bis die Dissoziation Modus 37C_h_TDK_2 markiert ist. Die Hülsen des benchtop Gewebe Dissociator werden als Positionen auf der Anzeige der Vorrichtung dargestellt. Wählen Sie die Positionen Proben laufen auf, indem sie auf dem Touchscreen klicken. Drücken Sie auf &quot;Start&quot;, um den Modus laufen und fahren Sie mit Schritt 2.16. HINWEIS: Je nach Art Tumor andere Dissoziation Programm könnte geeignet sein (siehe Schritt 2.7.1). </li></ol></li><li> Beachten Sie ein Fenster &quot;Beendigung des Programms&quot; auf dem Bildschirm. Nach Beendigung des Programms lösen C-Schlauch vom Benchtop Gewebe Dissociator. </li><li> Inkubieren Probe 30 min bei 37° C unter kontinuierlicher Drehung, beispielsweise durch einen Rohr Rotator verwenden. </li><li> Nach der Inkubation befestigen C Rohr den Kopf auf die Hülse des Benchtop Gewebe Dissociator. sicher wieder, dass das Probenmaterial in dem Bereich des Rotor / Stator befindet. </li><li> Führen Sie das Programm Dissoziation h_tumor_02 (für weiche und mittel Tumoren) oder h_tumor_01 (für harte Tumoren), wie in Schritt 2.7.1 beschrieben. </li><li> Nach Beendigung des Programms lösen C-Schlauch vom Benchtop Gewebe Dissociator. </li><li> Inkubieren Probe 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation. </li><li> Bringen Sie C-Schlauch der Oberseite nach unten auf die Hülse des Benchtop Gewebe Dissociator nach der Inkubation. sicher wieder, dass das Probenmaterial in dem Bereich des Rotor / Stator befindet. </li><li> Führen Sie das Programm Dissoziation h_tumor_03 (für weiche Tumoren), h_tumor_02 (für mittlere Tumoren) oder h_tumor_01 (für harte Tumoren), wie in Schritt 2.7 beschrieben. </li><li> So sammeln Sie führen das Probenmaterial auf dem Rohrboden eine short Zentrifugationsschritt (bei 100 xg für 10 sec). </li><li> Resuspendieren der Zellen und gelten mit 70 &amp; mgr; m nesh Größe einer Zelle Sieb auf einem 50 ml Röhrchen gegeben. Waschen Sie die Zelle Sieb mit 20 ml RPMI 1640 oder DMEM. </li><li> Centrifuge Zellsuspension bei 300 g für 7 min. Überstand entfernen vollständig. </li><li> Die Zellen werden in 5 ml Puffer zum Zählen. Fahren Sie mit dem Maus-Zell-Depletion durch magnetische Zellseparation (Abschnitt 3). </li></ol> 3. Maus-Zell-Depletion durch magnetische Zellseparationstechnik HINWEIS: Volumes für magnetische Markierung unten angegeben sind für bis zu 2 x 10 6 Tumorzellen oder 10 7 Zellen insgesamt einschließlich der roten Blutkörperchen. In Abhängigkeit von der Größe des Tumors niedrigere oder höhere Zellzahlen erhalten wird. Bei weniger Zellen, verwenden die gleichen Mengen wie angegeben. Wenn höhere Zellzahlen unter Verwendung maßstabs alle Reagenzienvolumina und Gesamtvolumina entsprechend up (beispielsweise 4 x 10 6 Tumorzellen oder 2 x 10 <sup&gt; 7 gesamt Zellen verwenden das doppelte Volumen aller angegebenen Reagenzienvolumina und Gesamtvolumina). <ol><li> Bestimmen Sie die Zellzahl einer aliquoten von Zellsuspension 2,21 in Schritt ein Mikroskop und geeignete Kammer zum Zählen verwendet wird. HINWEIS: An diesem Punkt ist die Suspensionszell einer heterogenen Mischung von menschlichen Tumorzellen sowie Maus Stromazellen und Blutzellen besteht, einschließlich der roten Blutkörperchen. Die Zusammensetzung der Zellen hängt stark von Tumortyp und der Region für die Transplantation. </li><li> Bei der Durchführung von Analysen durchflusszytometrischen nach dem Entfernen von Mauszellen entziehen 100 ul Aliquots auf geeignete Röhrchen für eine ungefärbte und zwei Einzelfarbkontrollfärbung der für die durchflusszytometrische Analyse. Lagern Sie sie im Kühlschrank bei 2 - 8 ° C bis zur weiteren Färbeschritte (Abschnitt 4). </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 300 xg für 10 min. Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 80 ul Puffer pro 2 x 10 6 Tumorzellen oder 10 7Gesamtzellen In 20 ul des magnetischen Markierungsreagens für Mauszellen. </li><li> Gut mischen und Inkubation für 15 min im Kühlschrank (2 - 8 ° C). Während magnetischen Kennzeichnung, bereiten Groß Spalten (LS Spalten) für die magnetische Trennung, indem sie sie in das Magnetfeld eines geeigneten Magneten platzieren (siehe Tabelle der Materialien und Geräte) nach dem Protokoll des Herstellers. Spülen der Säule mit 3 ml Puffer. </li><li> Stellen Sie das Probenvolumen auf 500 &amp; mgr; l unter Verwendung von Puffer für bis zu 2 x 10 6 Tumorzellen , oder bis zu 10 7 Zellen insgesamt. (Bis zu 1 x 10 7 Tumorzellen oder bis zu 5 x 10 7 Zellen insgesamt kann auf einer LS Spalte bearbeitet werden. Wenn mit mehreren Zellen arbeiten spaltete die Probe auf mehrere LS - Spalten). <ol><li> Wenn die durchflusszytometrische Analyse, molekulare Analyse durchführen oder Fraktionen in Kulturen zu vergleichen, ein 50-ul-Aliquot als unsortierter Probe zurückzuziehen. Bewahren Sie es in einem Kühlschrank bei 2 - 8 ° C bis zur Weiterverarbeitung. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Anwenden 500 ul der Zellsuspension auf der zuvor hergestellten Säule. Sammeln Sie Flow-Through enthält unmarkierten Zielzellen, die die angereicherten menschlichen Tumorzellen. HINWEIS: Wenn mit höheren Zellzahlen arbeiten bis zu 2,5 ml der Zellsuspension, die je 3,5 bis eine Spalte angewendet werden kann, zu Schritt hergestellt. </li><li> Waschkolonne mit 2 x 1 ml Puffer. Sammeln Sie die Zellen, die durchlaufen und verbinden sich mit dem Flow-Through aus Schritt 3.6. Führen Waschschritte durch das 1 ml Puffer Aliquots Zugabe sobald die Säule Reservoir leer ist. HINWEIS: Die Durchfluss enthält gereinigter menschlicher Tumorzellen. </li><li> Um auch die Mauszellen sammeln sich in der Säule zurückgehalten, entfernen Sie Spalte aus dem Separator und legen Sie es auf einem geeigneten Rohr. Pipette 3 ml Puffer auf die Säule und sofort den Kolben verwenden, um die Mauszellen zu spülen, indem Sie ihn fest in die Säule schieben. </li><li> Spin down die Fraktionen und Kontrollproben bei 300 g für 10 min. absaugen Supernatant vollständig und resuspendieren Zellen in Puffer, Kulturmedium oder gefrier Pellet in flüssigem Stickstoff in Abhängigkeit von der stromabwärts Anwendung gewünscht. </li></ol> 4. Downstream-Analysen <ol><li> Die Färbung für Analyse über Durchflusszytometrie HINWEIS: Vor der weiteren Downstream - Analysen durchgeführt wird , ein Teil der Zellen aus der Maus - Zell - Depletion Verfahren erhalten werden , können analysiert werden (zB beurteilen Reinheit und Ausbeute) in der Durchflusszytometrie. <ol><li> Für durchflusszytometrische Analysen spin mindestens 10% der negativen und positiven Fraktion aus magnetischen Zelltrennverfahren erhalten (siehe Abschnitt 3) sowie die Kontrollproben aus Schritt 3.2 und 3.5 bei 300 xg für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen. Zellpellet der Färbung Kontrollproben aus Schritt 3.2 in 90 ul Puffer. Resuspendieren der Fraktionen aus magnetischen Zelltrennverfahren in 80 ul Puffer erhalten. </li><li> In 10 ul Maus FcR Blockierungsreagenz auf alleProben. Gut mischen und Inkubation für 5 min bei 2 - 8 ° C im Kühlschrank. </li><li> In 10 ul Anti-Human-EpCAM-PE und 25 ul Anti-Maus-APC-Cocktail (Antikörperverdünnung von 1:10 entspricht) (Antikörperverdünnung von 1 ist gleich: 4) zu den Proben aus dem Abschnitt 3. 10 &amp; mgr; l anti -Human-EpCAM-PE zu einem einzigen Farbkontrollprobe (entspricht Antikörperverdünnung von 1:10) und 10 ul Anti-Human-EpCAM-APC auf die andere (entspricht Antikörperverdünnung von 1:10). Mischen Sie alle Proben und Inkubation für 10 min bei 2 - 8 ° C im Kühlschrank. HINWEIS: EpCAM ist als Tumorzellmarker jeder Tumortyp nicht geeignet. Für die Tumoren in dieser Studie EpCAM-Expression verwendet wurde, bekannt. </li><li> Zum Waschen der Proben mit 1 ml Puffer jeder und Spin bei 300 g für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und Zellpellet in einer Konzentration für die durchflusszytometrische Analyse. Um auszuschließen, tote Zellen Propidiumiodid (1 ug / ml) hinzufügen. </li><li> Führen Sie die durchflusszytometrische Analyse eines geeigneten f unter Verwendung vonniedrige Zytometer nach Herstellerprotokolle. </li></ol></li><li> Kultivierung humaner Tumorzellen HINWEIS: Zusätzlich Zytometrie zu fließen, aus dem Trennverfahren erhaltenen Zellen können für weitere Tests in vitro kultiviert und verwendet werden. <ol><li> Resuspendieren der sortierten Fraktion aus Abschnitt 3 in Kulturmedium auf eine Konzentration von 5 x 10 5 Zellen / ml. HINWEIS: Je nach Tumorart Beschichtung, geeignet Aussaatdichte und Kultivierungsbedingungen unterscheiden können. </li><li> Hinzufügen 500 ul Zellsuspension in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen, beschichtet mit 0,1% Gelatine. </li><li> Inkubiere Zellen in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5%. HINWEIS: Optimale Kulturbedingungen sind abhängig vom Tumortyp verwendet. Daher Kulturbedingungen geeignet für die Tumortyp gelten verwendet. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenzfärbung von kultivierten Zellen <ol><li> Bereiten Blockierungslösung durch Zugabe von 10% FCS und 0,1%Triton X-100 auf 1x PBS. </li><li> Verwerfen Kulturmedium. In 500 ul 1x PBS pro Well Zellen zu waschen. Inkubieren für 2 min bei Raumtemperatur (RT), dann verwerfen vollständig 1x PBS. </li><li> Fix-Zellen von 300 ul 4% PFA-Lösung hinzugefügt wird. 15 min bei RT inkubiert. </li><li> Entsorgen PFA-Lösung. Waschen fixierten Zellen 3 Mal wie in Schritt 4.3.2 angegeben. </li><li> Führen Sie Permeabilisierung und Blockierung durch Zugabe von 300 &amp; mgr; l pro Vertiefung blockiert. 30 min bei RT inkubiert. </li><li> Entsorgen Lösung blockiert. Wash-Zellen wie in Schritt 4.3.2 angegeben. </li><li> In 300 ul primäre Antikörper verdünnt in den Zellen blockiert Lösung. 200: Anti-Human-EpCAM-Antikörper 01.40 verdünnt, Vimentin-Antikörper 1 verdünnt. Inkubieren über Nacht bei 2 - 8 ° C. Anmerkung: Die verwendeten Antikörper für jeden Tumortyp nicht geeignet sind, wie EpCAM nicht auf Tumorzellen exprimiert werden könnte und / oder Vimentin auch durch die Tumorzellen exprimiert wird. Stellen Sie sicher, dass die verwendeten Antikörper für die Xenograft mo geeignet sinddel. </li><li> Entsorgen primären Antikörperlösung. Waschen Zellen 3 Mal wie in Schritt 4.3.2 angegeben. </li><li> In 300 ul sekundären Antikörper verdünnt in den Zellen blockiert Lösung. 400: Beide Antikörper, anti-Kaninchen-IgG-Alexe594 und anti-Maus-IgG-Alexa488 werden 1 verdünnt. Inkubieren für 1 Stunde im Dunkeln bei RT. </li><li> Entsorgen Sie sekundäre Antikörperlösung. Waschen Zellen 2 mal, wie in Schritt 4.3.2 angegeben. </li><li> Hinzufügen 300 ul DAPI-Lösung (0,1 ug / ml) in jede Vertiefung. Inkubieren für 10 min im Dunkeln bei RT. </li><li> Entsorgen Sie DAPI Lösung. Waschen Zellen 3 Mal wie in Schritt 4.3.2 angegeben. </li><li> In 500 ul 1x PBS in jede Vertiefung. Führen Sie die Fluoreszenzmikroskopie ein geeignetes Mikroskop. </li></ol></li><li> Whole Exome Sequencing <ol><li> Für Whole Exoms Sequenzierung (WES) freeze Pellets aus Schritt 3.9 in flüssigem Stickstoff. Shop und sammeln Proben bei -80 ° C. </li><li> Nach dem Sammeln der Zellen, Exoms Erfassung und ganze Exoms seq ausführenuencing gemäß den Anweisungen des Herstellers des jeweiligen Kits (siehe Tabelle der Materialien und Geräte). </li></ol></li></ol>

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David Agorku, Stefan Tomiuk, Stefan Wild, Silvia Rüberg, Lisa Zatrieb, Andreas Bosio und Olaf Hardt sind oder waren Mitarbeiter der Miltenyi Biotec GmbH, Deutschland. Kerstin Klingner und Julia Schüler sind Mitarbeiterinnen der Oncotest GmbH, Deutschland.

Wir haben eine schnelle und einfache Methode entwickelt, um unberührte menschliche Tumorzellen aus xenografted Tumorgewebe isolieren. Dieses Verfahren basiert auf der umfassenden Depletion von Zellen von Maus-Ursprung durch automatisierte Gewebedissoziation Vereinigen und magnetische Zellsortierung. Neben Erschöpfung aller Mauszellen auch die Menge an toten Zellen und Trümmer in der Zielzellfraktion deutlich reduziert. Zusammengenommen, ist dieses Verfahren wesentlich verbessert Molekular Downstream-Analysen und Kultivierung von humanen Tumorzellen. Im Gegensatz zu alternativen Verfahren ist es nicht erforderlich, nach Wissen der Tumorzellen-spezifischen Markern, die Anpassung an Zusammensetzungen Mauszellen oder Schaffung von Algorithmen variiert. Die vorgestellte Methode ist unabhängig von der Mausstamm und Tumorart. Daher wird eine Vorspannung durch Isolierung von humanen Tumor - Subpopulationen auf der Grundlage von einzelnen menschlichen spezifischen Markern , die in der Expression kann variieren, wie für EpCAM 11 gezeigt ist avoided. Darüber hinaus ist es nicht auf Tumormaterial beschränkt, sondern kann für jede Art von xenotransplantierten Gewebe verwendet werden, wie Mauszellen anstelle von spezifischen menschlichen Tumor Subpopulationen ausgerichtet sind (Daten nicht gezeigt). Comprehensive Entfernung von Mauszellen wird durch gezielte Oberflächen Epitope erleichtert ausschließlich auf Zellen von Maus-Ursprung exprimiert wird. Neben dem etablierten Verfahren zur Tumor Dissoziation wie in dieser Studie präsentierten, gibt es viele Verfahren unter Verwendung verschiedener Arten von Enzymen. Erhaltung der Zelloberflächen-Epitope ist eine Voraussetzung für dieses neue Verfahren, sondern auch für die genaue Analyse von humanen Tumorzellpopulationen. Daher ist es entscheidend, dass die schonende Enzyme für die Verdauung von Tumorgewebe verwendet werden. Somit kann Maus-Zell-Depletion nur in Kombination mit enzymatischen Verdau Verfahren verwendet werden, die offenbar nicht Epitope während Maus-Zell-Depletion Verfahren gezielt beeinflussen. Im Zweifelsfall kann dies nur durch den jeweiligen Hersteller überprüft werden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Diese Methode funktioniert auch für den menschlichen zirkulierenden Tumorzellen (CTCs). Wie jedoch Frequenzen von Zielzellen sind in der Regel &lt;0,1% Entfernung von Mauszellen erfordert zusätzlich rote Blutkörperchen Lyse und Reinheiten von mehr als 50% kann nicht erwartet werden. In diesem Fall kann der Maus-Zell-Depletion als Voranreicherung von CTCs durch eine Anreicherung unter Verwendung positiver Marker (Daten nicht gezeigt), gefolgt verwendet werden. Entfernen von Mauszellen verbessert signifikant die Kultur von menschlichen Tumorzellen durch die Kultur überwuchern von Maus-Fibroblasten zu vermeiden. Darüber hinaus ist die Analyse der menschlichen Tumorxenografte von Next-Generation-Sequenzierung deutlich verbessert und standardisiert. Da dieser Effekt beobachtet wurde, obwohl eine gezielte menschliche sequenzspezifische Auswahl wurde bei Exoms Anreicherung durchgeführt worden, der Einfluss auf die gesamte Genom und ganze Transkriptom-Sequenzierung wird erwartet, dass noch mehr im Vordergrund. Darüber hinaus erleichtert das vorgestellte Verfahren accurate molekulare Untersuchungen von Tumor Subpopulationen innerhalb xenotransplantiert menschlichen Tumoren. Entfernen von Mauszellen aus einer entsprechenden Probe in dem ersten Schritt und anschließend Zellen menschlichen Tumor in zwei verschiedenen Subpopulationen ermöglicht den direkten Vergleich molekularer des Tumors Subpopulation von Interesse für menschlichen bulk Tumorzellen 20 zu sortieren. Differentielle Genexpression zwischen Tumorzellsubtypen kann mehr zuverlässig beurteilt, da sie nicht durch Kreuzhybridisierung von Maus-abgeleitete Moleküle beeinflusst wird.

Feste menschlichen Tumoren bestehen aus mehreren physiologischen sowie neoplastischen Zelltypen. Sie bilden heterogene Gewebe mit komplexen biologischen Strukturen. Biologische Prozesse wie Tumorbildung, Progression und Reaktionen auf Therapien sind noch nicht vollständig verstanden. In - vitro - Zellkultur - Modellen ein nützliches Instrument darstellen , zu studieren und Tumorbiologie zu verstehen. Jedoch können sie nur teilweise in Tumorgeweben gefunden Strukturen und Prozesse widerspiegeln. Zuverlässige und stabile preclinical humanen Tumormodelle sind eine Voraussetzung für die Entwicklung von Anti-Tumor - Medikamente und Therapien 4,6 sowie für Tumorbiologie zu verstehen und die Wechselwirkung der Tumorzellen und ihrer Umgebung. Menschliche Tumor Xenotransplantatmodellen von primären Patiententumoren abgeleitet zeigen hohe Beziehungen zum Ursprungsgewebe in Bezug auf histologischen Architektur, die Wechselwirkungen mit Mikro-Umwelt-Strukturen, metastatische Potential und Reaktionen auf Medikamente 7 </sup&gt;. Selbst wenn Tumorxenotransplantaten werden aus kultivierten Zellen oder Zelllinien abgeleitet mehr sie eng Patiententumoren imitieren, damit höhere Gültigkeit zeigt in den meisten Assays im Vergleich zu in vitro Zellkulturmodellen. Diese Eigenschaften machen sie der Goldstandard der präklinischen Modellen 4. Neben der Anwendung in der Krebsforschung, der Xenotransplantation von menschlichen Zellen in Mäuse auch häufig in der Stammzellforschung 8 die stemness und Differenzierungspotential einer Zielpopulation zu bestimmen. Es hat sich gezeigt , dass die menschliche microvasculature und humanen Immunzellen auf in vivo Vermehrung von menschlichen Tumoren 2,9 ersetzt ist. Faktoren wie die Tumorsubtyp, Wachstumsrate, und in der Region der Transplantation haben erhebliche Auswirkungen auf die globale Ebene der Infiltration sowie die Zusammensetzung der Maus Zelltypen gefunden. Selbst wenn jedoch diese Faktoren konstant gehalten werden, sind die Menge und Zusammensetzung der Mauszellen sehr variabel. Downstream Analysen xenografted Geweben werden oft von Zellen murinen Ursprungs in Frage gestellt. Primärkulturen von menschlichen Tumorzellen aus Xenotransplantate werden durch Fibroblasten häufig überwuchert. Neben behindert die Bildung von Tumorzelllinien in vitro, stromabwärts Assays wie Arzneimittel Zytotoxizität Tests oder Pharmakokinetik da für Effekte in silico - Korrektur vorgespannt sind , aus dem Ursprungs kontaminierenden Mauszellen in den meisten Fällen nicht möglich ist. Darüber hinaus hat das nur teilweise aufgeklärt Übersprechen zwischen Maus - Fibroblasten und humanen Tumorzellen einen direkten Einfluss auf experimentelle Ergebnisse der Studien 10. Darüber hinaus verschärft die am weitesten unberechenbar Variation infiltrieren Mauszellen genaue molekulare Downstream-Analysen. In NGS oder Proteom analysiert jede Maus stammenden Signal anstelle eines menschlichen Tumors gemessenen Signalsequenzierungs Empfindlichkeit direkt abnimmt. Auch Microarray-basierten Expressionsanalysen werden von murinen Nuk herausgefordertleic Säuren möglicherweise Kreuz hybridisiert menschlichen Sonden. Um die Hindernisse von kontaminierenden Mauszellen in Downstream-Analysen von humanen Tumorzellen von Xenograft-Modellen verschiedene Ansätze vorgeschlagen worden, zu umgehen. In vielen Studien Downstream-Analyse gewünschten Zielzellen für isoliert werden durch Markierungen oder Kombinationen von Markern unter Verwendung ausgedrückt ausschließlich auf menschlichen Tumorzellen. Allerdings stellt das Fehlen zuverlässiger Marker für eine positive Identifizierung von humanen Tumorzellen häufig eine große Hürde. Auch im Großen und Ganzen ausgedrückt Marker, wie EpCAM auf humanen Karzinomen, zeigen häufig Tumor intrinsische Expressionsunterschiede 11. Dies erhöht das Risiko , die niedrig exprimierenden Subpopulationen, beispielsweise Tumorzellen epithelialen-to-mesenchymale Transition erfahren, sind bei der Isolierung verloren. Darüber hinaus könnte die direkte Bindung eines Selektionsmittels an die Zielzelle die nachfolgenden Analyseergebnisse beeinflussen. Versuche von abbauenden Zellen der Maus durchverwenden , haben eine Kombination von Antikörpern , die spezifisch für murine CD45 und MHC - Klasse - I - Epitope auch 12 gemacht worden. Jedoch nur diese Markerkombination detektiert eine Teilmenge von Mauszellen. Ein weiterer Ansatz ist die Analyse von Prozessen durch Software zu verbessern. Doch alle diese Ansätze sind entweder nicht geeignet für jede Art von Versuchsaufbau oder für jede Tumorart und Transplantationsmethode. In dieser Studie stellen wir eine neue und schnelle Methode zur Mauszellen aus xenografted Gewebe unabhängig von der Mausstamm und Ursprungsgewebe umfassend erschöpfen. In Vorführungen auf mehreren Zielorganen und Geweben zur Transplantation von Xenotransplantaten (einschließlich Haut, Lunge, Gehirn, Niere und Skelettmuskel) konnten wir eine Kombination von Antikörpern zu ermöglichen, dass Zellen umfassend Erkennung Maus zu identifizieren. Diese Antikörper wurden an superparamagnetische Partikel gekoppelt, titriert und zur Abreicherung optimiert durch magnetische Zellsortierung verwendet wird. Da nur Maus spezifischeAntikörper werden verwendet, menschliche Zielzellen bleiben &quot;unberührt&quot; und das Verfahren ist nicht auf xenotransplantierten Tumorgewebe beschränkt. Wir zeigen, dass umfassend Entfernen von Mauszellen aus xenografted Tumorproben standardisiert und erleichtert Kulturen von humanen Tumorzellen. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Analyse von menschlichen Tumorfremdtransplantaten durch Sequenzierung der nächsten Generation deutlich verbessert. Da dieser Effekt wurde beobachtet, wenn auch ein menschlicher sequenzspezifische Selektion während Exoms Anreicherung durchgeführt wurde, werden der Einfluss auf die gesamte Genom und ganze Transkriptom Sequenzierung erwartet noch deutlicher werden. Zusammengenommen Entfernung von Mauszellen Dieses neuartige Verfahren unter Verwendung erleichtert Kultivierung von menschlichen Tumorzellen und verbessert signifikant die Downstream-Analysen von humanen Tumor-Xenotransplantaten.

<table><tbody><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>enthält die Enzyme H, R und A; siehe Datenblatt für Rekonstitutionsanleitung</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C-Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissoziator mit Heizern</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainer (70 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 100 mm</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Verschiedenes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Zellverarmungskit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-694</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Vielseitig</td><td></td><td>einsetzbar 1x PBS für PEB-Puffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3610</td><td>Verwendung Endkonzentration von 2 mM in PEB-Puffer</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>oder verwenden Sie 5 mg/L BSA in PEB-Puffer</td></tr><tr><td>MACS LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>PreSep Filter (70 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Röhrenrotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>CD326-FITC, humaner</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-301</td><td>Verwendung 1:40 für Immunfluoreszenzfärbung&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin-Antikörper</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus IgG-Alexa488</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen IgG-Alexa594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>verdünnen auf eine Endkonzentration von 0,1 & Mikro; g/ml in 0,1 M Natriumbicarbonat</td></tr><tr><td>Inside Stain Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-477</td><td>InsideFix aus diesem Kit kann für den Fixierungsschritt während der Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS Verschiedenes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blockierungsreagenz, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500-100g</td><td></td></tr><tr><td>Nextera Rapid Capture Enrichment Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-140-1000</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzkit v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

depletion von maus-zellen aus menschlichem tumorxenografte deutlich verbessert downstream-analyse von zielzellen

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Die Verwendung von in - vitro - Zelllinie Modelle für die Krebsforschung hat ein nützliches Werkzeug gewesen. Es hat sich jedoch gezeigt , dass diese Modelle zuverlässig nicht gezeigten Patiententumoren in verschiedenen Assays 1 nachahmt. Menschliche Tumorxenografte stellen den Goldstandard in Bezug auf Tumorbiologie, Arzneimittelforschung und Metastasierung Forschung 2-4. Tumor - Xenotransplantate können aus verschiedenen Arten von Material , wie Tumorzelllinien, Tumorgewebe von Patienten primären Tumoren 4 oder seriell transplantierten Tumoren ableiten. Wenn in vivo propagiert wird xenografted Gewebe infiltriert und durch Zellen der Maus Herkunft vaskularisiert. Mehrere Faktoren wie die Tumor Einheit, beeinflussen die Entstehung von xenografted Material, Wachstumsrate und der Region der Transplantation, die Zusammensetzung und die Menge an Mauszellen in Tumorxenografte. Allerdings sind, auch wenn diese Faktoren konstant gehalten wird, ist der Grad der Mauszell Kontamination sehr variabel. Contaminating Mauszellen beeinträchtigen signifikant Downstream-Analysen von menschlichen Tumorfremdtransplantaten. Als Maus-Fibroblasten hohe Plattierung Wirksamkeiten und Proliferationsraten zeigen, neigen sie Kulturen von menschlichen Tumorzellen zu überwuchern, besonders langsam Subpopulationen wuchernden. Maus - Zell - DNA, mRNA und Protein - Komponenten können Bias nachgelagerten Genexpressionsanalyse, der nächsten Generation Sequenzierung, sowie Proteomanalyse 5 abgeleitet. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine schnelle und einfache Methode zur Isolierung unberührt menschlichen Tumorzellen aus xenografted Tumorgewebe entwickelt. Dieses Verfahren basiert auf der umfassenden Depletion von Zellen von Maus-Ursprung, indem sie mit dem Gewebe benchtop Dissociator und magnetische Zellsortierung automatisierten Gewebedissoziation kombiniert. Hier zeigen wir, dass die menschliche Zielzellen werden kann, kann mit Reinheiten von mehr als 96% innerhalb von weniger als 20 min unabhängig vom Tumortyp erhalten werden.

Unterschiedliche Ansätze wurden vorgeschlagen, Mauszellen von xenotransplantierten menschlichen Tumoren zu identifizieren oder zu führen, beispielsweise eine Kombination von Maus-spezifische Antikörper gegen CD45 und MHC Klasse I. jedoch nur Subpopulationen von Mauszellen nachgewiesen wurden diese Kombinationen verwendet, während die vorgeschlagene Kombination CD45 nachgewiesen und MHC - Klasse - I - Maus - Zellen, sowie den Rest der Mauszellen in Zielgeweben für die Transplantation gefunden (Abbildung 1). Unter Verwendung dieser neuartigen Kombination von Antikörpern für die magnetische Zellsortierung, könnte menschlichen Tumorzellen isoliert von Tumortyp unabhängigen werden (Abbildung 2). Zellen aus magnetischen Zelltrennverfahren Basis erhalten Mauszellentfernung kann kultiviert werden, um reine Kulturen von humanen Tumorzellen (Abbildung 4) führt. Zusätzlich könnte lebensfähigen Zellen der Maus aus dem erhaltenen und kultiviert werden,gleiche Probe. Neben der Entfernung von Mauszellen wurde auch Ablagerungen auf Maus - Zell - Depletion (MCD) (Abbildung 3) entfernt wird . Die umfassende Abreicherung von Mauszellen sowie Schmutzentfernung führen zu einer verbesserten molekularen Downstream-Analysen. Dies zeigte erhaltenen Ergebnisse aus ganzen Exoms Sequenzierung (WES) durchgeführt auf Bulk - Tumorstücke und Maus - Zell - Depletion - Proben von drei verschiedenen Patienten stamm Xenograft Tumormodellen (Figuren 5 bis 9) zu vergleichen. Unsere Daten zeigen , dass die Entfernung von Mauszellen vor WES auf Xenograft Tumorproben durchführt , nicht nur signifikant die Gesamtmenge von Lesevorgängen erhöht (Abbildung 5) , sondern verringert auch erheblich die Anzahl der Host für das menschliche Bezugsgenom liest kartiert abgeleitet (6B). Da diese fälschlicherweise abgebildet Maus häufig mit SNP Berufung stören liest, beobachteten wir eine starke Reduktion von falsch vorhergesagtSNPs nach MCD (Figuren 7 - 8). Schließlich haben wir gezeigt, dass die in silico Entfernung von der Maus stamm liest durch Bioinformatik Methoden konnte nicht vollständig das experimentelle Verfahren ersetzen, da eine eindeutige sequenzbasierte Zuordnung zu der Ursprungsarten nicht möglich war, alle liest. Ferner ist die in - silico - Verfahren könnte nicht korrekt für die verbesserte Qualität und gleichzeitige höhere Lese Bedeckung der in vitro abgereicherten Proben (Abbildung 9). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig1.jpg" /> Abbildung 1. ein Antikörper - Cocktail -Einsatzes aller Zellen der Maus über mehrere Organe 14. Screenings in mehreren Organen, einschließlich der Haut, Lunge, Gehirn, Niere und Skelettmuskulatur erkennen, durchgeführt wurden. Diese Organe stellen eine große Zielgewebe für die Xenotransplantation. Kombinationen wie diese Erkennung mouse CD45 und MHC-Klasse-I-Epitope wurden bereits verwendet, um Maus-Zellen nach der Xenotransplantation zu verarmen. Allerdings sind diese Marker-Kombinationen nur eine Untergruppe von Zellen der Maus in allen untersuchten Geweben erkannt. In früheren Screenings eine Kombination von fünf Antikörper wurde für die umfassende Detektion aller Zellen aus Maus-Herkunft identifiziert ermöglicht. Dieses beinhaltet auch den roten Blutkörperchen und ist unabhängig von dem Ursprungsgewebe (A, B, und Daten nicht gezeigt). Geändert von 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zuverlässige und schnelle Depletion von Mauszellen 15. Konjugate des Antikörpers Kombination mit superpara nanoparticles wurden ein optimiertes Protokoll für die Depletion von Mauszellen aus menschlichen Tumorxenotransplantaten durch magnetische Zellsortierung ( - Magnetzellseparation) (A) zu entwickeln , verwendet. Dieses neuartige Protokoll zur Eliminierung von&gt; 99% an kontaminierenden Zellen der Maus in weniger als 20 min, unabhängig von der Tumorart erlaubt. Zellfraktionen aus magnetischen Zelltrennverfahren erhalten wurden , wurden mit der pan-Maus - Antikörper - Cocktail und ein menschliches spezifischen Antikörper gegen CD326 (EpCAM) (B) bezeichnet. Geändert von 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig3.jpg" /> Abbildung 3. Isolierung von humanen Glioblastomzellen. Maus - Zell - Depletion Kit wurde verwendet , um menschliche Glioblastomzellen aus adulten mous isolierene Gehirn. Während Dissoziation von neuralem Gewebe große Mengen an Ablagerungen wird gewöhnlich erzielt. MCDK depletes effizient toten Zellen und Trümmer, wie durch die graphische Darstellung der Zellgröße im Vergleich zu Zell Granularität gesehen. Mit diesem Konjugat - Cocktail, war es möglich , &gt; 99% der verunreinigenden Mauszellen zu eliminieren und&gt; 60% der Trümmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig4.jpg" /> Abbildung 4. Depletion von Mauszellen Erleichtert Downstream Kulturen von menschlichen Tumorzellen 14. Maus - Fibroblasten häufig die Kultivierung von humanen Tumorzellen nach der Dissoziation von transplantierten Gewebe behindern oder zu heterogenen Kulturen führen. Fibroblasten attach und erweitern effizienter, wodurch Ziel c zuwachs<html> ells. Dies stört in vitro Zellkultur - Assays (beispielsweise Arzneimittel Zytotoxizität Tests), da mathematische Korrektur für die Wirkung von kontaminierenden Mauszellen entsteht , ist unmöglich , in den meisten Fällen. Die negative (B) und positive Fraktionen (C) , nachdem die Maus - Zell - Depletion wurden für drei Tage fixiert und für eine Maus - Fibroblasten-spezifischen Marker (Vimentin) und die human-spezifischen Tumormarker CD326 (EpCAM) gefärbt. Als Kontrolle wurde der ursprüngliche Anteil ungetrennten Zellen (A) enthält , kultiviert und auch gefärbt. Selbst nach drei Tagen der Kultur, eine nahezu reine Population von humanen Tumorzellen wurde in der negativen Fraktion (B) beobachtet, während die unsortierten Fraktion (A) durch Fibroblasten fast bewachsen war. Nur ein geringer Teil der Zielzellen wurde auf die positive Fraktion (C) verloren. Geändert von 14.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig5.jpg" /> Abbildung 5. Ganze Exome Sequencing (WES) von Tumorproben Vor und nach der Maus - Zell - Depletion (MCD) 15. Wir haben WES auf drei verschiedenen Xenotransplantatmodellen aus menschlichen Niere, Lunge und Blasenkrebs , um die Auswirkungen von MCD auf zu bewerten die Qualität der Sequenzierungsdaten der nächsten Generation. DNA von Bulk-Tumor und von isolierten Tumorzellen nach Maus-Zell-Depletion wurde verwendet, um ein Exoms Capture Kit Exoms-Capture-Sequenzierungsbibliotheken zu erzeugen Anwendung. Für die Sequenzierung auf einem Desktop-Sequenzer Instrument, einem Desktop-Sequenzer Reagenzienkit 150 Zyklen wurde verwendet 75-bp zu erzeugen, gepaart-Ende liest. Ein signifikanter Anstieg (p &lt;0,05) in Cluster-Dichte (A) sowie eine aveWut Anstieg der Lesezählungen von 33% (B) wurde für die Proben beobachtet von Mauszellen aufgebraucht, was auf eine verbesserte Probenqualität. Entsprechend ist eine starke Verminderung der Ablagerungen und toten Zellen auf MCD auch durch Durchflusszytometrie - Analyse nachgewiesen werden konnte (siehe Abbildung 3). Geändert von 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig6.jpg" /> Abbildung 6. Maus - Zell - Depletion (MCD) Stark Reduziert die Anzahl der Irrtümlich Mapped Maus Liest nach Whole Exome Sequencing (WES) 15. Als Fänger - Oligonukleotide für die gezielte Anreicherung von Protein-kodierenden Sequenzen wurden verwendet , um auf das menschliche Genom auf Basis entworfen, eine erste Pre- Anreicherung von DNA-Fragmenten menschlichen Ursprungs from die Mischung von Maus- und menschlichen Zellen erwartet wurde. Um die Anzahl der Fänger-Oligonukleotide zu bewerten, die mit Maus-Genom-DNA-Kreuz hybridisieren könnten, führten wir BLAST-Suchen der einzelnen schnellen Erfassung Exoms Sonde gegen Maus-Genom. Die resultierenden wurden Ausrichtungsparameter verwendet, um mögliche Kreuzhybridisierung zu ermitteln. (.. Ausrichtung Länge, keine Mismatches, keine Lücken) In Abhängigkeit von den Auswahlschwellen, sagten wir voraus, eine Kreuzreaktivität von 5 - 10% der Fangsonden mit Maus-Transkripte (Daten nicht gezeigt). Nach dem Adapter Ausschnitt (trimmomatic V0.32 16), kartiert wir die liest aller Proben gegen Mensch und Maus - Genome (BWA v0.7.12 17) und bestimmt ihre vermeintlichen Herkunft auf der Grundlage der jeweiligen Ausrichtungsparameter (Linux - Shell, Kommandozeilen - Perl) (A). Ein Durchschnitt von 12% der aus bulk Tumorproben abgeleitet liest wurde auf Mauszellen zugeschrieben. Dieser Betrag könnte durch vorherige Erschöpfung der Mauszellen auf 0,3% reduziert werden (B </strong&gt;). Wie im Durchschnitt 15% der Maus stamm liest fälschlicherweise für das menschliche Genom kartiert, auf 1,9% der gesamten entsprechenden liest die bulk Tumorproben und 0,04% in der isolierten Tumorzellen, die einen starken positiven Einfluss von Maus-Zell-Depletion auf Downstream-Analysen zu erwarten. 6B veranschaulicht die detaillierte Lesezuweisung aus der Xenotransplantat Blasenkrebs abgeleitet für bulk Tumor und isolierten menschlichen Tumorzellen. Geändert von 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig7.jpg" /> Abbildung 7. MCD stark reduziert die Anzahl der fälschlich Prognostizierte SNPs 15. Um die Auswirkungen der Maus zu bestimmen , liest das menschliche Genom kartiert, stellten wir fest , die Anzahl der predicted SNPs für die Xenotransplantat-Proben vor und nach der MCD. Da kein gesundes Gewebe zum Vergleich zur Verfügung stand, wurde ein SNP als eine Differenz zwischen der sequenzierten Probe und dem Referenzgenom (hg19) definiert. Nach dem Entfernen von doppelten liest, SNP und INDEL Berufung wurde 18 durchgeführt und in die Regionen von einem Exoms Capture Kit gezielt eingeschränkt. 63 ± 10% aller SNPs vorhergesagt für den Großtumorproben wurden nicht mehr erkannt , nachdem die Maus - Zell - Depletion, 18 ± 1% waren für die isolierten menschlichen Tumorzellen (A) spezifisch. Während erstere vor allem durch irrtümlich zugeordnet Maus verursacht wurden, liest die letztere schien aufgrund der höheren Lesezählungen erkannt werden und entsprechend höhere Abdeckung innerhalb der isolierten humanen Tumorzellproben. Dieser Effekt war auch sichtbar vorhergesagt INDELs (B). Geändert von 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen</a>Zahl. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig8.jpg" /> Abbildung 8. MCD verbessert die Prognose von High-impact SNPs 15. (A) Auswirkung der MCD auf SNP Vorhersage innerhalb eines Protein-kodierenden Exons des POLA1 Gen 19 veranschaulicht wird. Während fälschlicherweise abgebildet Maus eine Anzahl von fälschlicherweise vorausgesagt SNPs in der Masse Nierenkrebs Xenotransplantat verursacht liest, fehlten diese SNPs nach MCD. Darüber hinaus verbessert MCD auch die Vorhersage der high-impact SNPs. Zum Beispiel liest der Maus mit dem menschlichen Referenzgenom in der Tumorprobe bulk kartiert ergab die falsch vorhergesagte Zerstörung des Startcodons des GRIA3 Gen (B). Geändert von 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54259/54259fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> s = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="9" src="/files/ftp_upload/54259/54259fig9.jpg" /> Abbildung 9. In Silico Depletion von der Maus stamm Liest nicht vollständig I n - vitro - MCD 15 ersetzen. Die vorhergesagte liest der Maus Ursprungs zu sein wurden rechnerisch aus der Sequenzierungsdaten entfernt und SNP Berufung wurde wiederholt. Durch diesen Ansatz vorhergesagte Anzahl von SNPs für die Bulk - Tumorproben wurde von 63% auf 8,5% der Gesamtzahl der SNPs erheblich reduziert (vergleiche Figur 8). Dies könnte jedoch in silico - Ansatz nicht vollständig in vitro MCD ersetzen, insbesondere , wenn die verbesserte Probenqualität und die damit einhergehende Erhöhung der Lesezählungen und Abdeckung betrachtet. Geändert von 15.&quot;_blank&quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Menschliche Tumorxenotransplantate sind vaskularisiert und durch Zellen von Maus - Ursprung während der Wachstumsphase in vivo infiltriert. Um die Vorspannung, die durch diese kontaminierenden Zellen während nachgeschalteten Analyse verursacht umgehen, entwickelten wir ein Verfahren erlaubt eine umfassende Depletion aller Mauszellen durch magnetische Zellsortierung.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, xenotransplantierte humane Tumorzellen rasch aus Mäusen zu isolieren, um die nachgeschaltete Analyse der gewünschten Zielzellen zu verbessern. Die Eliminierung der kontaminierenden Mauszellen durch diese Methode ermöglicht die gezielte Untersuchung der Genexpression humaner Tumorzellen oder deren direkte Reaktionen in vitro. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die humanen Tumorzellen schnell und einfach isoliert werden können, ohne dass Oberflächenmarker an den Zielzellen identifiziert werden müssen.Entfernen Sie zunächst mithilfe von Pinzette und Skalpell das Fett- und Nekrosegewebe aus der Tumorprobe. Anschließend zerkleinern Sie den Tumor in zwei bis vier Millimeter große Stücke. Danach überführen Sie die Gewebefragmente in eine Zelldissoziationsröhrchen mit dem Verdauungsgemisch und verschließen das Röhrchen fest.Stellen Sie das Gefäß kopfüber auf eine Pult-Tissue-Dissoziator-Halterung und vergewissern Sie sich, dass sich die Gewebestücke im Rotor-Stator-Bereich befinden. Befestigen Sie die Heizung am Dissoziator, klicken Sie anschließend auf das Ordnersymbol am Touchscreen und verwenden Sie die Pfeiltasten nach oben und unten, um den geeigneten Tumor-Dissoziationsmodus auszuwählen. Wählen Sie danach die Halterungsposition aus, an der sich die Probe befindet, und starten Sie die Dissoziation.Wenn eine Einzelzell-Suspension erhalten wurde, zentrifugieren Sie das Röhrchen schnell, um die Zellen am Boden des Röhrchens zu sammeln. Filtern Sie die Zellen durch ein Sieb mit 70-Mikrometer-Maschenweite in ein 50-Milliliter-Konischglas und spülen Sie das Sieb mit 20 Millilitern Medium aus, wobei Sie die Spülflüssigkeit im Probenröhrchen auffangen. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet aus menschlichen Tumor-Maus-Stromazellen in fünf Millilitern PB-Puffer.Nach der Zellzählung die Zellen durch eine weitere Zentrifugation sammeln und das Pellet in 80 µL PB-Puffer pro 1 × 10⁷ Gesamtzellen resuspendieren. Für diesen Schritt ist es wichtig, ein Mikroskop zu verwenden und die Zellzählung mithilfe der Ausschlussfärbung mit Blauem statt mit einem Zellzähler durchzuführen, um eine genaue Bestimmung der lebensfähigen Zellen zu erhalten. Zellzähler weisen häufig Probleme beim Umgang mit heterogenen Proben nach der Gewebedissoziation auf.Mischen Sie anschließend 20 Mikroliter magnetischen Markierungsreagenz für Mauszellen in die Zellsuspension und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang im Kühlschrank. Während die Zellen markiert werden, setzen Sie eine LS-Säule in einen geeigneten Magneten ein und spülen die Säule mit drei Millilitern PB-Puffer. Am Ende der Inkubation geben Sie 420 Mikroliter Puffer hinzu, um das Gesamtvolumen der Probe auf 500 Mikroliter aufzustocken, und heben Sie ein 50-Mikroliter-Aliquot bei zwei bis acht Grad Celsius für eine spätere Durchflusszytometrie- oder molekularbiologische Analyse auf.Geben Sie dann die Zellen unter Verwendung eines vorgewaschenen 70-Mikrometer-Netzfilters auf die Säule. Sammeln Sie den ungefärbten Zielzell-Durchlauf. Sobald das Reservoir leer ist, waschen Sie die Säule zweimal mit je einem Milliliter Puffer und sammeln Sie den Eluat im selben Gefäß wie die negativen Zellfraktion.Um die magnetischen Perlen-gebundenen Mauszellen zu sammeln, überführen Sie die Säule in ein neues kegelförmiges Reagenzglas und spülen drei Milliliter Puffer durch die Säule. Die Verwendung der neuartigen Kombination von Anti-Maus-Antikörpern ist deutlich effizienter für eine umfassendere Detektion von Mauszellen in Zielgeweben nach Xenotransplantation im Vergleich zur kombinierten Markierung mit CD45 und MHC-Klasse-I. Tatsächlich ermöglicht die Anwendung dieser neuartigen Antikörperkombination für die magnetische Zellsortierung die Isolierung menschlicher Tumorzellen unabhängig vom Tumortyp.Zusätzlich zur Mauszellen-Depletion werden auch Zelltrümmer während der magnetischen Zellseparation entfernt. Die mausfreien humanen Tumorzellen können anschließend kultiviert werden, wodurch reine humane Tumorzellkulturen entstehen. Die Entfernung von Mauszellen vor der Durchführung der Ganz-Exom-Sequenzierung an xenografierten Tumorproben erhöht nicht nur signifikant die Gesamtanzahl an Reads, sondern reduziert auch erheblich die Anzahl an wirtszell-abgeleiteten Reads, die an das humane Referenzgenom aligniert werden, sowie die Anzahl an falsch vorhergesagten Einzelnukleotid-Polymorphismen.Die bioinformatische, in silico durchgeführte Entfernung von mausstämmigen Reads kann jedoch das experimentelle Verfahren nicht vollständig ersetzen, da für alle Reads keine eindeutige, sequenzbasierte Zuordnung zur Art des Ursprungs möglich ist. Wie hier anhand der Anzahl vorhergesagter SNPs gezeigt, kann das in silico-Verfahren die verbesserte Qualität und die damit einhergehende höhere Read-Abdeckung der in vitro angereicherten Proben nicht korrigieren. Wenn das Verfahren einmal beherrscht ist, kann das gesamte Protokoll – einschließlich Tumorzubereitung, Dissoziation, Zählung und magnetischer Trennung – bei sachgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Gewebeprobe angemessen für die Dissoziation vorzubereiten, keine aggressiven Enzyme zu verwenden und eine genaue Zellzählung sicherzustellen. Nach Abschluss dieses Protokolls können die gereinigten humanen Tumorzellen für jegliche Art von nachgeschalteter Analyse, Kultivierung oder sogar für eine anschließende magnetische oder fluorbasierte Zellsortierung verwendet werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg, humane Tumor- und Krebsstammzellen aus Patientenproben und semidirekten Xenotransplantaten ohne Verzerrung durch Mauszellen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie schnell und einfach es ist, Ihre nachgeschalteten Assays zu verbessern, indem Sie mit reinen Populationen von Zielzellen arbeiten.

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Medicine

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Das erfindungsgemäße Protokoll in der vorliegenden Studie berichtet ermöglicht selektiven Nachweis von Lungenmetastasen in einzelne Zelle Auflösung in Mäusen durch...

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Die Generierung und Charakterisierung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit humanisierten Mäusen wird hier beschrieben. Menschliche Thymus-Gewebe und gentechnisch veränderten humanen hämatopoetischen Stammzellen in immungeschwächten Mäusen transplantiert. Hierdurch ergibt sich der Rekonstitution eines konstruierten menschliche Immunsystem so zur in vivo-Untersuchung von Anti-Tumor-Immunantwort.

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Dieses Video zeigt einen Assay zur Generierung eines humanisierten Xenotransplantat-Mausmodells. Einer immungeschwächten Maus wird Cyclophosphamid injiziert, um eine Depletion der Immunzellen zu verursachen. Vom Patienten stammende Tumorzellen, die mit humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in einem Hydrogel vermischt sind, werden subkutan in die Maus injiziert, wodurch ein Tumor mit infiltrierenden T-Zellen entsteht.

Eine Technik zur Generierung eines humanen PBMC-transplantierten humanisierten Xenotransplantat-Mausmodells

Menschen Tumorxenotransplantaten in immundefizienten Mäusen sind wertvolle Werkzeuge, um Krebsbiologie zu studieren. Spezifische Protokolle subkutane und intra-Heterotransplantate aus menschlichen Leberzellkarzinom-Zellen oder Tumorfragmente zu erzeugen, werden beschrieben. Leberregeneration nach partieller Hepatektomie in Empfängermäuse induziert wird, als eine Strategie, um intra-Transplantation zu erleichtern präsentiert.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

Wir beschreiben ein Verfahren zur stabilen Markierung von Patienten stamm Xenotransplantaten (PDXs) mit lentivirale Partikel exprimieren grün fluoreszierenden Protein und Luziferase-Reporter. Diese Methode ermöglicht es, das Wachstum von PDXs am primären Standort zum Verfolgen sowie Detektieren spontaner und experimentelle Metastasen in vivo Bildgebungssysteme verwendet werden .

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

Wir beschreiben die Etablierung von orthotopen kolorektalen Tumoren durch Injektion von Tumorzellen oder Organoiden in den Cecum von Mäusen und die anschließende Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus diesem Modell.

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Mantel-Zell-Lymphom (MCL) ist ein schwer zu B-Zell-Störung zu behandeln, und es ist ebenso schwierig, zur Einrichtung eines Xenograft-Maus-Modell der primären MCL zu studieren und Therapeutika zu entwickeln. Hier beschreiben wir die erfolgreiche Etablierung von MCL Xenotransplantate bei Mäusen zu helfen, die zugrunde liegende Biologie zu verstehen.

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Hier beschreiben wir eine Methode zum Trennen und Bestandteil der Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebung in etablierte subkutane Tumoren zu bereichern. Diese Technik ermöglicht die separate Analyse der Tumor immun infiltrieren und nicht-immunen Tumor Fraktionen die umfassende Charakterisierung der Tumor immun Mikroumgebung ermöglichen können.

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen mit menschlichem Immunsystem (KIS) für immunonkologische Studien. Anweisungen und Überlegungen zur Verwendung dieses Modells zum Testen von humanen Immuntherapeutika an menschlichen Tumoren, die in dieses Modell implantiert wurden, werden vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Reaktion des menschlichen Immunsystems auf den Tumor liegt.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

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Dissoziation von humanen und Maus-Tumorgewebeproben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Erfahren Sie, wie Sie menschliche Tumorzellen aus Maus-Xenografts durch magnetische Zellsortierung mit Anti-Maus-Antikörpern isolieren. Diese Methode ermöglicht unverzerrte Genexpressionsanalysen und verbesserte Sequenzierungsdaten.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

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