Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, xenotransplantierte menschliche Tumorzellen schnell aus Mäusen zu isolieren, um die nachgelagerte Analyse der gewünschten Zielzellen zu verbessern. Die Eliminierung der kontuminierenden Mauszellen durch diese Methode ermöglicht die spezifische Beurteilung der Genexpression menschlicher Tumorzellen oder in vitro direkter Reaktionen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die menschlichen Tumorzellen schnell und einfach isoliert werden können, ohne dass Oberflächenmarker auf den Zielzellen identifiziert werden müssen.

Beginnen Sie mit einer Pinzette und einem Skalpell, um das Fett und die nekrotischen Bereiche aus der Tumorprobe zu entfernen. Dann zerkleinern Sie den Tumor in zwei bis vier Millimeter große Stücke. Übertragen Sie anschließend die Gewebefragmente in ein einzelliges Suspensionsdissoziationsröhrchen, das die Verdauungsmischung enthält, und verschließen Sie das Röhrchen fest.

Legen Sie das Röhrchen kopfüber auf eine Tischhalterung für Gewebedissoziatoren und vergewissern Sie sich, dass sich die Gewebestücke im Statorbereich des Rotors befinden. Schließen Sie die Heizung an den Dissoziator an, klicken Sie dann auf das Ordnersymbol auf dem Touchscreen und verwenden Sie die Pfeile nach oben und unten, um den entsprechenden Tumordissoziationsmodus auszuwählen. Wählen Sie als Nächstes die Montierungsposition, in der sich die Probe befindet, und starten Sie die Dissoziation.

Wenn eine Einzelzellensuspension erhalten wurde, zentrifugieren Sie das Röhrchen schnell, um die Zellen am Boden des Röhrchens zu sammeln. Filtern Sie die Zellen durch ein 70-Mikron-Netzsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie das Sieb mit 20 Millilitern Medium, wobei Sie die Wäsche im Probenröhrchen auffangen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen und resuspendieren Sie das Stromazellpellet des menschlichen Tumors in fünf Millilitern PB-Puffer

Nach der Zählung werden die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation entnommen und das Pellet in 80 Mikrolitern PB-Puffer pro einer x 10 bis zur siebten Gesamtzelle resuspendiert. Für diesen Schritt ist es wichtig, ein Mikroskop zu verwenden und zu versuchen, anhand des blauen Ausschlusses anstelle eines Zellzählers eine genaue Zählung der lebensfähigen Zellen zu erhalten. Zellzähler weisen häufig Probleme bei der Handhabung heterogener Proben nach Gewebedissoziation auf.

Mischen Sie anschließend 20 Mikroliter Magnetmarkierungsreagenz für Mauszellen in die Zellsuspension und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang im Kühlschrank. Während die Zellen markiert werden, setzen Sie eine LS-Säule in einen geeigneten Magneten und spülen Sie die Säule mit drei Millilitern PB-Puffer. Am Ende der Inkubation fügen Sie 420 Mikroliter Puffer hinzu, um das Gesamtprobenvolumen auf 500 Mikroliter zu erhöhen, wodurch ein 50-Mikroliter-Aliquot bei zwei bis acht Grad Celsius für die spätere durchflusszytometrische oder molekulare Analyse eingespart wird.

Geben Sie dann die Zellen mit einem äquilibrierten 70-Mikron-Maschensieb auf die Säule. Erfassen Sie den nicht markierten Zielzellenfluss. Sobald das Reservoir leer ist, waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter Puffer und sammeln Sie das Eluent im selben Röhrchen wie die negative Zellfraktion.

Um die magnetischen, perlengebundenen Mauszellen zu sammeln, geben Sie die Säule in ein neues konisches Röhrchen und tauchen Sie drei Milliliter Puffer durch die Säule. Die Verwendung der neuartigen Kombination von Anti-Maus-Antikörpern ist für einen umfassenderen Nachweis von Mauszellen in Zielgeweben für die Xenotransplantation deutlich effizienter als die kombinierte CD45- und MHC-Klasse-1-Markierung. Die Verwendung dieser neuartigen Kombination von Antikörpern für die magnetische Zellsortierung ermöglicht die Isolierung menschlicher Tumorzellen unabhängig von der Tumorart.

Neben der Depletion der Mauszellen werden bei der magnetischen Zelltrennung auch Ablagerungen entfernt. Die mausfreien humanen Tumorzellen können dann kultiviert werden, was zur Erzeugung reiner humaner Tumorzellkulturen führt. Die Entfernung von Mauszellen vor der Durchführung einer Ganz-Exom-Sequenzierung an xenographierten Tumorproben erhöht nicht nur die Gesamtanzahl der Reads erheblich, sondern reduziert auch die Anzahl der vom Wirt abgeleiteten Reads, die dem menschlichen Referenzgenom zugeordnet werden, und die Anzahl der falsch vorhergesagten Einzelnukleotid-Polymorphismen erheblich.

Die in silico-Entfernung von Maus-abgeleiteten Reads durch bioinformatische Methoden kann das experimentelle Verfahren jedoch nicht vollständig ersetzen, da eine eindeutige sequenzbasierte Zuordnung zur Herkunftsspezies nicht für alle Reads möglich ist. Wie hier für die Anzahl der vorhergesagten SNPs gezeigt, kann das In-silico-Verfahren die verbesserte Qualität und die damit einhergehende höhere Leseabdeckung der in vitro depletierten Proben nicht korrigieren. Einmal gemeistert, kann das gesamte Verfahren, einschließlich der Tumorpräparation, Dissoziation, Zählung und magnetischen Trennung, in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Gewebeprobe angemessen für die Dissoziation vorzubereiten, keine aggressiven Enzyme zu verwenden und sicherzustellen, dass eine genaue Zellzahl erhalten wird. Nach diesem Verfahren können die gereinigten menschlichen Tumorzellen für jede Art von nachgelagerter Analyse, Kultivierung oder auch anschließende magnetische oder flussbasierte Zellsortierung verwendet werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsforschung, menschliche Tumor- und Krebsstammzellen aus Patienten- und halbdirekten Xenotransplantaten zu erforschen, ohne dass die Mauszellen verzerrt wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie schnell und einfach es ist, Ihre Downstream-Assays zu verbessern, indem Sie mit reinen Populationen von Zielzellen arbeiten.