Nasschemie und Peptid Immobilisation auf Polytetrafluoroethylen für verbesserte Zellhaftung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine nasschemische Oberflächenbehandlung für das florale Kohlenstoffpolymer Polytetrafluorethylen oder PTFE bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Biomaterialien zu beantworten, z. B. wie die Biokompatibilität von medizinischen Polymeren verbessert werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nur ein Minimum an Ausrüstung erforderlich ist und dass die Methode im Vergleich zu anderen Methoden allgemeiner anwendbar ist.

Die Herstellung der Natriumnaphthalinidlösung erfordert streng anhyrdroöse Bedingungen. Schneiden Sie 0,25 Gramm Natriummetall in kleine Stücke, um die Auflösung zu verbessern. Geben Sie das Natriummetall zu einer Lösung von 1,4 Gramm Naphthylin in 20 Millilitern Tetrahydrofuran in einer 100-Milliliter-Glasflasche mit Schraubverschluss, die mit einem PTFE-beschichteten Magnetrührstab ausgestattet ist.

Erhitzen Sie die Lösung leicht, um die Auflösung weiter zu verbessern. Die endgültige Lösung hat eine dunkle, leicht grünliche Farbe und kann unter streng trockenen Bedingungen gelagert werden. Stanzen Sie PTFE-Scheiben mit einem Durchmesser von 12 Millimetern aus 0,5 Millimeter dickem Folienmaterial aus.

Markieren Sie eine Seite und reinigen Sie das Iso-Propanol. Inkubieren Sie PTFE-Proben einzeln ein bis zwei Minuten lang mit einer Pinzette in der Aktivierungslösung. Der Farbwechsel von weiß zu dunkelbraun deutet auf eine erfolgreiche Behandlung hin.

Anschließend zweimal mit THF und dann mit Iso-Propanol spülen. Die behandelten Proben werden drei Stunden lang in 30 % Wasserstoffperoxid mit 20 % Trichloressigsäure oxidiert. Mit Wasser waschen und trocknen.

Die Oberfläche hat nun ein leicht bräunliches Aussehen. Behandeln Sie die oxidierten Scheiben zwei Stunden lang mit 50%HMDI in trockenem THF. Anschließend mit THF abspülen und trocknen lassen.

Zum Schluss werden die Isocyanat-haltigen Proben zwei bis drei Stunden lang in Wasser hydrolysiert und getrocknet. Legen Sie jede aminierte Scheibe mit der markierten Seite nach oben in die einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Fügen Sie 1,5 Milliliter der Epoxidlösung hinzu, um eine vollständige Abdeckung der Proben zu gewährleisten.

Nach zweistündiger Inkubation zweimal mit Wasser und einmal mit Karbonatpuffer waschen. Zu den Böden einzelner Vertiefungen einer frischen 24-Well-Platte werden 50 Mikroliter 0,5 Milligramm pro Milliliter Peptid und 50 Millimolare Karbonatpuffer mit einem pH-Wert von neun hinzugefügt, der 0,1 % Natriumazid enthält. Legen Sie die epoxidfunktionalisierten Scheiben vorsichtig kopfüber auf die Tropfen der Peptidlösung.

Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen dem Boden einer Vertiefung und der PTFE-Scheibe aufgrund der Kapillarwirkung vollständig benetzt ist. Inkubieren Sie die Platte mindestens drei Stunden lang oder über Nacht in einer Nasskammer mit befeuchteter Atmosphäre, indem Sie nasses Seidenpapier auf den Boden der Kammer legen. Nach der Inkubation dreimal mit Wasser waschen und mindestens 30 Minuten in 50%igem iso-Propanol-Wasser sterilisieren.

Vor der Zellaussaat, wie im Textprotokoll beschrieben, spülen Sie die Proben in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Die Ergebnisse der entscheidenden chemischen Reaktionsschritte wurden mittels Infrarotspektroskopie überwacht. Die anfängliche Aktivierung mit Natriumnaphthalamid erzeugt Doppelbindungen und in geringem Maße Hydroxylfunktionalitäten.

Das Signal, das auf Kohlenstoff-Doppelbindungen hinweist, verschwindet bei der Oxidation, so dass eine Oberfläche entsteht, die fast ausschließlich Hydroxylgruppen trägt. Die Farbveränderungen durch Aktivierung und Oxidation stimmen mit der zu erwartenden Chemie überein. Es wird erwartet, dass konjugierte Doppelbindungssysteme bräunlich sind, und der Verlust der Doppelbindungssysteme führt zu einer Aufhellung.

Darüber hinaus wurde das mögliche Ergebnis von Aktivierung und Oxidation auf der Oberflächenmorphologie mittels Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Es wurden praktisch keine nachteiligen Auswirkungen der Behandlung beobachtet. Die Immobilisierung des adhäsiven Peptids der Endothelzelle, Arginin, Glutamin und Asparaginsäure-Valin auf der Polymeroberfläche unterstützt das Wachstum der Endothelzellen.

Während auf unbehandeltem Material praktisch keine Zelladhäsion und -proliferation auftritt, unterstützt die Modifikation die Besiedlung über einen Zeitraum von zwei Wochen stark. Am Beispiel einer klinischen Anwendung wurde die Modifikation identisch an Originalmaterial aus einem kommerziell erhältlichen Transplantat aus expandiertem PTFE mit ähnlichen Ergebnissen über einen Zeitraum von einer Woche durchgeführt. Einmal gemeistert, dauert diese Technik etwa 12 Stunden.

Es ist zu beachten, dass dieses Verfahren spezifisch für PTFE ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man PTFE oberflächenaktiviert und wie man Peptide in den nachfolgenden Schritten immobilisiert. Nach diesem Verfahren können andere Moleküle, wie Polysaccharide oder Nabelschnurfaktoren, auf ähnliche Weise immobilisiert werden.

Denken Sie daran, dass die Arbeit mit hochgiftigen und ätzenden Chemikalien gefährlich ist und dass die üblichen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen.