Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Das übergeordnete Ziel dieses subkutanen Xenotransplantat-Verfahrens mit patientenabgeleiteten Tumoren ist die Untersuchung der Wirksamkeit neuartiger Therapien, der prädiktiven Entdeckung von Biomarkern und arzneimittelresistenter Signalwege bei Tumoren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Onkologie zu beantworten, ob ein bestimmtes Medikament eine Aktivität gegen einen bestimmten Tumortyp zeigt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Patient Derived Tumor Xenographen die für die Ursprungstumoren typische molekulare, genetische und histologische Heterogenität beibehalten, wodurch das Modell klinisch relevanter wird.

Verfahren wird von Stacey Bagby, einer professionellen Forschungsassistentin und zertifizierten Veterinärtechnikerin aus unserem Labor, vorgeführt. Nachdem ein bis zwei Milliliter Blut in einem Blutzelltrennröhrchen mit Natriumcitrat entnommen wurden, zentrifugieren Sie die Proben und überführen die mononukleäre Zellschicht des peripheren Blutes in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Füllen Sie das Röhrchen bis zum Rand mit sterilem PBS.

Drehen Sie dann die Zellen wieder nach unten. Gefolgt von einer schnellen Wäsche mit einem Milliliter PBS, wobei darauf zu achten ist, das PMBC-Pellet nicht zu stören. Verwenden Sie dann eine Pipette, um das Plasma aus dem Blutzellenentnahmeröhrchen in ein steriles 1,5-Milliliter-Kryofläschchen zu übertragen, und lagern Sie das Plasma und das PBMC-Pellet bei minus 80 Grad Celsius.

Übertragen Sie das menschliche Tumorgewebe in einen sterilen Becher mit vollständigem Medium in die tierische Einrichtung und stellen Sie den Becher in eine Laminar-Flow-Haube. Übertragen Sie das Gewebe so bald wie möglich nach der Entnahme in eine sterile Kunststoff-Schneideschale in einer kleinen Menge des Rückgewinnungsmediums. Schneiden Sie dann mit einer im Autoklaven sterilisierten kleinen Schere und Pinzette das Gewebe in etwa drei mal drei mal drei Milliliter Stücke und legen Sie 10 bis 12 Stücke in ein autoklaviersterilisiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 Mikrolitern gallertartiger Proteinmischungslösung auf Eis für die Implantation.

Für die schockgefrorene Lagerung geben Sie die entsprechende Anzahl von Tumorstücken in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie das Fläschchen in einen Flüssigstickstoff-Doer. Dann in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius stellen. Für die formale Fixierung und Paraffineinbettung legen Sie drei kleine Tumorstücke für 24 Stunden in einen 10-Milliliter-Becher mit 10 % Formalin.

Nachdem das Gewebe zu in Paraffin eingebetteten Blöcken verarbeitet wurde, übertragen Sie alle verbleibenden Gewebestücke in ein Kryoröhrchen. Geben Sie dann einen Milliliter des vollständigen Mediums, das mit 10 % DMSO angereichert ist, zum Gewebe und lagern Sie die Röhrchen auf Eis, bis sie in einen Isopropylalkohol-Gefrierbehälter umgefüllt werden können. Und stellen Sie diesen Behälter in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius.

Um das Tumorgewebe zu injizieren, laden Sie die in der gallertartigen Proteinmischungslösung gelagerten Tumorstücke in autoklavierte 12-Gauge-Trokare, wobei darauf zu achten ist, dass jedes Tumorstück vollständig in den Trokar eingeführt wird. Bestätigen Sie als nächstes, dass bei einer sechs bis acht Wochen alten athymischen Nacktmaus nicht auf das Zehenkneifen reagiert und übertragen Sie die Maus in einer sterilen Laminar-Flow-Haube auf ein sauberes Feld. Der F0-Tumor wird subkutan in die dorsale Halsregion und auf jede Seite der Mausflanke abgegeben, gefolgt von der subkutanen Verabreichung der Analgesie distal an eine der Flankenstellen der Tumorinjektion

Setzen Sie die Maus dann wieder in ihren Käfig mit Überwachung ein, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Überwachen Sie das Wachstum und die Gesundheit der xenographisch implantierten Mäuse mindestens einmal pro Woche, indem Sie die Tumorgröße, die Tumorentstehung, das Datum der Tumorinjektion und den Gesundheitszustand der Mäuse in einem geeigneten Tracking-System aufzeichnen. Wenn ein Tumor eine Größe von etwa 1.500 bis 2.000 Kubikmillimetern erreicht, verwenden Sie autoklavierte Scheren und Pinzetten, um den Tumor herauszuschneiden und den F1-Tumor in die nächste Generation von fünf Tieren zu überführen, wie gerade gezeigt, wobei darauf zu achten ist, schockgefrorenes Formalin und lebensfähige Tumorproben zu sammeln, wie für jeden Tumor gezeigt.

Wenn die verbleibenden Mäuse aus der F0-Tumorgruppe Tumoren mit einer Größe von etwa 1.500 bis 2.000 Kubikmillimetern aufweisen, sammeln Sie diese Tumoren, wie gerade für die Entnahme gezeigt. Wenn das Stadium der Tumorentstehung F15 erreicht ist, verwenden Sie die früheste Generation lebensfähiger Tumorstücke, die in Flüssigstickstofflagern verfügbar sind, für die nächste Serie von Tumorinjektionen. Wenn der gewünschte Tumor sehr groß ist, 1.500 bis 2.000 Kubikmillimeter, befolgen Sie die oben genannten Verfahren, um den Tumor zu sammeln und ihn in die gewünschte Anzahl von Mäusen zu erweitern.

Dosieren Sie die Mäuse mit dem Medikament und wiegen und messen Sie sie zweimal pro Woche. Randomisieren Sie die Mäuse in Behandlungsgruppen mit 10 Tumoren pro Gruppe und einem Gruppentumorvolumen von durchschnittlich 100 bis 300 Kubikmillimetern innerhalb weniger Standardabweichungen voneinander. Sortieren Sie dann die Mäuse in die entsprechenden Gruppen für die Behandlung.

Die zweifarbige Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung für die von Mensch und Maus gefangene DNA zeigt, dass die menschlichen Stromazellen im F0-Tumor durch die Maus-Stromazellen im F1-Tumor ersetzt werden. Während der gesamte vom Menschen stammende Hepatozyten-Wachstumsfaktor in der F0-Generation durch den Maus-Hepatozyten-Wachstumsfaktor in der F1-Generation ersetzt wird, besteht der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor-Ligand in der F1-Generation sowohl aus humanem als auch aus Mausprotein. Die Behandlung verschiedener Generationen desselben Tumors ändert das Ansprechen auf die Behandlung nicht.

Die Resistenz oder Empfindlichkeit des Tumors scheint eher tumorstammspezifisch als tumorentstehungsspezifisch zu sein. Darüber hinaus ist die Häufigkeit von Mutationen in diesen häufig mutierten Genen zwischen dem Krebsgenomatlas und der kolorektalen Patienten-Xenographenbank sehr ähnlich. Dies deutet darauf hin, dass die häufigen Mutationen, die in der kolorektalen Patientenpopulation beobachtet wurden, im kolorektalen Xenotransplantatmodell gut repräsentiert sind.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, ein geschlossenes klinisches Team zu haben, um die Krebspatienten zu identifizieren und die Zustimmung der Krebspatienten einzuholen sowie das Tumorgewebe zu entfernen und zu vergrößern. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Untersuchung von Anti-Krebs-Wirkstoffen als Einzel- oder Kombinationswirkstoffe, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Durchführbarkeit dieser Strategien für Patienten mit einer bestimmten Tumorart zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Onkologie, um neuartige Krebstherapeutika, Tumorheterogenität, behandlungsresistente Mechanismen, Krebsstammzellbiologie und Tumorstroma-Wechselwirkungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein patientenabgeleitetes Tumor-Xenograph-Modell zur Bewertung neuartiger Krebstherapeutika entwickeln und pflegen können.