Name: Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung synthetischer chemischer Transducer zur Steuerung unnatürlicher Protein-Kommunikation mittels spektroskopischer Methoden. Diese Technik ermöglicht neue Ansätze für die künstliche Signaltransduktionstherapie.

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Diese Arbeit wurde von der Minerva-Stiftung, der HFSP-Organisation und einen Europäischen Forschungsrat Grant (Starting Grant 338.265) unterstützt wurde.

1. Synthese des &quot;Chemical Transducer&quot; <ol><li> Vorläufige Vorbereitungen <ol><li> Bereiten 2 M Triethylammoniumacetat (TEAA) -Puffer durch Mischen von 278 ml Triäthylamin mit 114 ml Essigsäure und 400 ml Reinstwasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7 und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 L. Halten Sie es in einer dunklen Flasche. Hinweis: Diese Lösung seit Jahren stabil ist. </li><li> Bereiten Sie eine 5 mM Ascorbinsäure-Lösung von 18 mg Ascorbinsäure in 20 ml Reinstwasser gelöst wird. Verwenden Sie eine frische Lösung; die Lösung ist für einen Tag stabil. </li><li> Vorbereiten eines 10 mM Cu (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amin (TBTA) Lösung, die durch Lösen von 25 mg Kupfer (II) -sulfat-pentahydrat in 10 ml Reinstwasser und 58 mg TBTA in 11 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Die beiden Lösungen mischen. Halten Sie es bei Raumtemperatur und schützen Sie es vor Licht. </li></ol></li><li> Konjugation Verfahren <ol><li> Man löst 100 nmol des modifizierten Oligonukleotid (ODN-1) in 80 ulvon frischem Reinstwasser. In 20 ul 2 M TEAA, pH = 7. Fügen Sie 80 ul einer frisch zubereiteten Lösung von Ascorbinsäure (5 mM in Wasser). </li><li> Man löst 1,5 &amp; mgr; Mol (574,5 ug) von Azid-modifizierten Ethacrynsäure in 180 &amp; mgr; l DMSO und fügen Sie ihn in die Lösung. Entgasen der Lösung für 60 Sekunden und fügen Sie schnell 40 &amp; mgr; l aus der Cu (II) / TBTA-Lösung (10 mM in 55% (v / v) DMSO / Wasser) unter Verwendung von Argon. </li><li> Spülen Sie wieder mit Argon, dicht schließen, und über Nacht rühren. </li><li> Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion und reinigen das Konjugat durch RP-HPLC (mobile Phase: A) 5% Acetonitril, 5% TEAA, 90% Reinstwasser; B) 65% Acetonitril, 5% TEAA, 30% Reinstwasser). 24 </li></ol></li></ol> 2. Kontrolle GST-Aktivität von PDGF <ol><li> Vorläufige Vorbereitungen <ol><li> Vorbereitung 50 ml Testpuffer durch 33,9 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBSx1) mit 16,1 ml Reinstwasser Mischen einer 8 mM final Phosphatkonzentration und Anzeige zu erreichen,d 23,8 mg 2 MgCl eine 5 mM Endkonzentration zu erreichen. </li><li> Vorbereitung einer Stammlösung von GST M1-1 durch das Protein in einem Puffer aufgelöst, der 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer Endkonzentration von 30 uM. Teilen Sie diese Lösung in kleinen Portionen und bei -80 ° C. Verdünnen Sie frisch, gemäß Abschnitt 2.1.5.1, in dem Assaypuffer und auf Eis halten. Anmerkung: Die Lösung wird für etwa 5 Stunden stabil sein, oder bis es zu einer Verringerung der Enzymaktivität ist. </li><li> Bereiten Sie das Substrat gemäß den folgenden Anweisungen: <ol><li> Man löst 10 mg reduziertem Glutathion (GSH) in 325 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser in einer Endkonzentration von 100 mM Stammlösung. Verdünnen 21 &amp; mgr; l aus dieser Stammlösung in 979 &amp; mgr; l Assaypuffer für eine Endkonzentration von 2,1 mM Arbeitslösung. </li><li> Man löst 10 mg 2,4-Dinitrochlorbenzol (CDNB) in 492 &amp; mgr; l eTHANOL bis zu einer Endkonzentration von 100 mM Stammlösung. Verdünnte 43,2 &amp; mgr; l der Vorratslösung in 956,8 ul eines Assay-Puffers für eine Endkonzentration von 4,32 mM Arbeitslösung. </li></ol></li><li> In einer 96-Well-Platte, setzen jedes Substrat in einer separaten Zeile (12 Wells). mindestens 60 &amp; mgr; l in jeder Einsatz auch eine schnelle und leichte Entnahme der Lösung zu ermöglichen. Die Platte mit einem Aluminiumblech für Lichtschutz. </li><li> Die folgenden Stammlösungen im Assay-Puffer: <ol><li> Verdünne GST M1-1 um 50 bis zu einer Endkonzentration von 0,6 uM des Dimers. </li><li> Verdünnen Sie die &quot;chemische Wandler&quot; zu einer 30 &amp; mgr; M Stammlösung. </li><li> Verdünnte PDGF zu einer Endkonzentration von 40 uM. </li><li> Verdünnte PDGF-Aptamer mit einer Endkonzentration von 250 uM. </li></ol></li></ol></li><li> Messen Sie die GST-Aktivität in Gegenwart des &quot;chemischen Wandler &#39;und PDGF. <ol><li> Stellen Sie eine experimentelle Verfahren i upn den Plattenleser für die kinetische Messung. <ol><li> Erstellen Sie ein neues Experiment als &quot;Standardprotokoll&quot;. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Verfahren&quot; das Verfahren Einstellungsfenster zu öffnen. </li><li> In der Pop-up-Liste auf der oberen Seite des Fensters, wählen Sie &quot;384 Platte &#39;Typ gemäß der Plattenhersteller. </li><li> Drücken Sie &#39;Read&#39; im linken Menü. </li><li> In Bezug auf das Nachweisverfahren &quot;Absorptions&quot; wählen. </li><li> In Bezug auf die Lesetyp &#39;Endpunkt&#39; wählen. </li><li> Schreib 340 nm auf der Wellenlängenfenster. </li><li> Drücken Sie auf der &#39;Vollplatte &quot;unten auf der rechten oberen Seite und wählen Sie das gut gemessen werden. </li><li> Drücken Sie auf &quot;OK&quot; zu schließen das &quot;Lesen&quot; Fenster. </li><li> Wählen Sie &quot;Start kinetische &#39;im linken Menü. </li><li> Sprechen Sie die Laufzeit 10 min. </li><li> Wählen Sie die Mindestabstände Option. </li><li> Drücken Sie &quot;OK&quot;, um die kinetische Fenster zu schließen. </li><li> Ziehen Sie das &quot;Lesen&quot; der Zeile into die kinetische Messung. </li><li> Drücken Sie die &#39;Bestätigen&#39; Taste und dann die Taste &quot;OK&quot;. </li><li> Speichern Sie das Experiment. </li><li> Drücken Sie die &quot;Play&quot; -Taste. Ein Dialogfeld erscheint - drücken Sie die Taste &quot;OK&quot; nur dann, wenn die Messung gestartet werden soll. </li></ol></li><li> Um die Triplikaten Experiment durchführen, bereiten vier Proben mit jeweils 3,25 ul des &quot;chemischen Wandler&quot; und 3,25 ul GST M1-1. In jeder Probe 0, 1.2, 2.4 oder 4.9 ul PDGF und 123,5, 122,3, 121,1 oder 118,6 ul des Puffers Assay sind. </li><li> Inkubieren der Lösung bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> In einem 384-Well-Platte transparent, legen Sie 40 ul der Probe in jede Vertiefung. Setzen Sie die Proben nur in den ungeraden Brunnen oder nur in den geraden Vertiefungen in der gleichen Linie die Verwendung eines Multi-Pipettor für Substratzugabe zu ermöglichen. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipette, fügen Sie schnell 10 ul von jedem der ter Substrate, die in der 96-Well-Platte (siehe Abschnitt 2.1.4), bereits vorgefertigt wurden. Vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte in das Lesegerät und die kinetische Messung starten. Da GST Kinetik sehr schnell ist, versuchen, die Zeit zwischen der Substratzugabe und dem Beginn der kinetischen Messung zu minimieren. </li></ol></li><li> GST Aktivierung / Hemmung Zyklen durch die &quot;chemische Wandler &#39;Vermittelte. <ol><li> Um die Triplikaten Experiment durchführen, bereiten 5 Proben mit je 84,5 ul Assay-Puffer, 3,25 &amp; mgr; l &#39;chemischen Wandler &quot;und 3,25 ul GST M1-1. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> In 3,65 ul Assaypuffer 1 und 3,65 ul von PDGF auf Probe 2-5 zu den Proben. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> In 3,12 ul Assay-Puffer zu den Proben 1-2 und 3,12 ul PDGF Aptamer Proben 3-5. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> Hinzufügen, 24,4 &amp; mgr; l Assay-Puffer zu den Proben1-3 und 24,4 &amp; mgr; l von PDGF auf die Proben 4-5. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> 7.8 &amp; mgr; l Assay-Puffer zu den Proben 1-4 und 7,8 &amp; mgr; l PDGF-Aptamer für 5 min 5. Inkubieren bei Raumtemperatur abzutasten. </li><li> In einem 384-Well-Platte transparent, legen Sie 40 ul der Probe in jede Vertiefung. Legen Sie Proben nur in den ungeraden oder nur in den geraden Vertiefungen in der gleichen Linie. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipette, fügen Sie schnell 10 &amp; mgr; l von jedem Substrat (pre-vorbereitet in der 96-Well-Platte). Vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte in das Lesegerät und die kinetische Messung starten. </li><li> Berechne den V 0 [mOD / min] unter jeder Bedingung durch die OD bei 340 nm bei t gemessen Subtrahieren = 0,5 min von der OD bei 340 nm gemessen bei t = 1,5 min , die Aktivierung / Sperrung Recycelbarkeit zu beurteilen. 25 </li></ol></li><li> Bewerten Sie die Reaktion in Echtzeit des &quot;chemischen Wandler&quot; auf Veränderungen in der Umwelt. <ol> &lt;li&gt; Echtzeit-Wirkung von PDGF hinaus <ol><li> Stellen Sie eine experimentelle Verfahren in der Plattenleser für die kinetische Messung auf. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1.1-2.2.1.10. </li><li> Machen Sie die Laufzeit 3,5 min. </li><li> Wählen Sie die Mindestabstände Option. </li><li> Drücken Sie &quot;OK&quot;, um die kinetische Fenster zu schließen. </li><li> Ziehen Sie das &quot;Lesen&quot; Zeile in die kinetische Messung. </li><li> Wählen Sie Platte Out / In im linken Menü. </li><li> Wählen Sie die Option &quot;plate out (kein Dialog) &#39;. </li><li> Wählen Sie die &quot;Verzögerung&quot; Option im linken Menü auf und geben Sie 30 Sek. </li><li> Wählen Sie Platte Out / In im linken Menü. </li><li> Wählen Sie die Option &quot;Platte in (ohne Dialog) &#39;. </li><li> Erstellen Sie eine zweite kinetische Messung durch die Schritte 2.2.1.4 zu wiederholen - 2.2.1.14 aber in Abschnitt 2.2.1.11 die kinetische gesetzt 25 min anstelle von 10 min zu sein. </li><li> Drücken Sie die &#39;Bestätigen&#39; Taste und dann die Taste &quot;OK&quot;. </li><li> Speichern Sie das Experiment. </li><li> Drücken Sie die &#39;play &#39;Taste. Ein Dialogfeld erscheint - drücken Sie die Taste &quot;OK&quot; nur dann, wenn die Messung gestartet werden soll. </li><li> Bereiten Sie zwei Proben von 1 ul GST M1-1 Mischen und 1 ul des &quot;chemischen Wandler &#39;in 38 ul Puffer Assay. Legen Sie die Proben in zwei Vertiefungen einer 384-Well-Platte transparent, eine leere gut zwischen diesen beiden Brunnen zu verlassen. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipettor, schnell 10 &amp; mgr; l von jedem Substrat hinzufügen, vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden, um die Platte in das Lesegerät einlegen und die kinetische Messung starten. </li><li> Wenn die Platte öffnet sich (nach 3,5 min), fügen Sie schnell 1,125 ul PDGF zu einem der Brunnen, vorsichtig mischen, und lassen Sie die Platte für die verbleibenden kinetischen Messungen zu schließen. </li></ol></li><li> Echtzeit-Effekt der Zugabe des PDGF-Aptamer <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1.1-2.4.1.15. </li><li> Bereiten Sie zwei Proben von 1 ul GST M1-1 Mischen, 1 &amp; mgr; l der &#39;chemische Wandler &quot;und 1,125 &amp; mgr; l PDGF in 36,9 ul Puffer Assay. Legen Sie die Proben in zwei Vertiefungen einer 384-Well-Platte transparent, eine leere gut zwischen diesen beiden Brunnen zu verlassen. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipettor, schnell 10 &amp; mgr; l von jedem Substrat hinzufügen, vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden, um die Platte in das Lesegerät einlegen, und die kinetische Messung starten. </li><li> Wenn die Platte öffnet sich (nach 1,5 min), fügen Sie schnell 1,2 ul PDGF - Aptamer an einem der Brunnen, vorsichtig mischen und lassen Sie die Platte für die verbleibenden kinetischen Messungen zu schließen. </li></ol></li></ol></li><li> Messen Sie JS-K Prodrug-Aktivierung durch GST in der Gegenwart des &quot;chemischen Wandler &#39;und PDGF. <ol><li> Stellen Sie eine experimentelle Verfahren in der Plattenleser für die kinetische Messung auf. <ol><li> Erstellen Sie ein neues Experiment als &quot;Standardprotokoll&quot;. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Verfahren&quot; das Verfahren Einstellungsfenster zu öffnen.</li><li> In der Pop-up-Liste auf der oberen Seite des Fensters &#39;384 Platte&#39; Typ gemäß der Plattenhersteller wählen. </li><li> Drücken Sie &#39;Read&#39; im linken Menü. </li><li> In Bezug auf das Nachweisverfahren &quot;Absorptions&quot; gewählt haben. </li><li> In Bezug auf die Lesetyp &#39;Endpunkt&#39; wählen. </li><li> Schreib 305 nm auf der Wellenlängenfenster. </li><li> Drücken Sie auf die &quot;Vollplatte&quot; -Taste auf der oberen rechten Seite und wählen Sie das gut gemessen werden. </li><li> Drücken Sie auf &quot;OK&quot; zu schließen das &quot;Lesen&quot; Fenster. </li><li> Wählen Sie &quot;Start kinetische &#39;im linken Menü. </li><li> Sprechen Sie die Laufzeit 10 min. </li><li> Wählen Sie die Mindestabstände Option. </li><li> Drücken Sie &quot;OK&quot;, um die kinetische Fenster zu schließen. </li><li> Ziehen Sie das &quot;Lesen&quot; Zeile in die kinetische Messung. </li><li> Drücken Sie die &#39;Bestätigen&#39; Taste und dann die Taste &quot;OK&quot;. </li><li> Speichern Sie das Experiment. </li><li> Drücken Sie die &quot;Play&quot; -Taste. Ein Dialog box erscheint - drücken Sie die Taste &quot;OK&quot; nur dann, wenn die Messung gestartet werden soll. </li></ol></li><li> Für die NO-Produktion Messungen verwenden, um ein Nitrit / Nitrat kalorimetrischen-Kit. In einer 96-Well-Platte 50 ul Testpuffer einfügen in eine Zeile, 70 &amp; mgr; l Griess ich in einer zweiten Reihe Reagens und 70 ul von Griess II Reagenz in einer dritten Reihe. </li><li> Um die Triplikaten Experiment durchführen, bereiten vier Proben mit jeweils 4,8 ul des &quot;chemischen Wandler&quot;. Zu 1 Probe, 155,2 ul Assay-Puffer hinzuzufügen; 2, fügen 3,2 ul GST-M1-1 und 152 &amp; mgr; l Assaypuffer zu probieren; 3, fügen 9,6 ul PDGF und 145,6 ul Assaypuffer zu probieren; und 4 Probe, fügen 3,2 ul GST-M1-1, 9,6 ul PDGF und 142,4 ul Puffer Assay. </li><li> Inkubieren der Lösung bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> In einem 384-Well-Platte transparent, fügen Sie 50 ul der Probe in jede Vertiefung. Legen Sie Proben nur in den ungeraden oder nur in derauch Vertiefungen in der gleichen Linie die Verwendung eines Multi-Pipettor für Substratzugabe zu ermöglichen. </li><li> Hinzufügen, 0,54 ul JS-K (5 mM in DMSO) zu jedem Well. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipettor, schnell 10 &amp; mgr; l aus der GSH-Lösung (in der 96-Well-Platte vorbereitete) hinzufügen, vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte in das Lesegerät und die kinetische Messung starten. </li><li> Unmittelbar nach der kinetischen Messung, ein 12-Kanal-Multipipette, nehmen 50 &amp; mgr; l von jeder Probe in den Testpuffer Zeile in der vorbereiteten 96-Well-Platte und schnell auf sie 50 ul Reagenz Griess ich hinzufügen und 50 ul Griess II Reagenz. Inkubieren während sie von Licht für 10 min bei RT und Messen der Extinktion bei 550 nm zu schützen. Hinweis: Der Testpuffer und Reagenzien Volumen auf der Kits &#39;Protokoll abhängig sind. </li></ol></li></ol>

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<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben eine Methode zum Entwerfen und Testen eines "chemischen Wandlers" vorgestellt, der eine künstliche Kommunikation zwischen zwei von Natur aus nicht verwandten Proteinen, GST und PDGF, induzieren kann, ohne die nativen Proteine zu modifizieren. Die unnatürliche GST-PDGF-Kommunikation konnte in Echtzeit nachgewiesen werden, indem enzymatische Assays verwendet wurden, die die Veränderungen der Aktivität von GST in Gegenwart des "chemischen Wandlers" verfolgen und die PDGF-Konzentrationen erhöhen. Zusätzlich zum Nac...

Signaltransduktionswege spielt eine bedeutende Rolle in praktisch allen zellulären Prozess und damit die Zelle rasch auf Umgebungssignale zu reagieren. 1 Diese Wege häufig durch die Bindung eines Signalmoleküls an einen extrazellulären Rezeptor ausgelöst werden, die in der Aktivierung von intrazellulären Enzymen führt. Verstärkung und Ausbreitung dieses Signals innerhalb der Zelle wird durch die Funktion vermittelt Proteine ​​von Signalisierungs, die ein Netzwerk von Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden, in denen Enzyme mit hoher Spezifität reversibel aktiviert werden. Da Dysregulation dieser Netze führt häufig zur Entwicklung von Krebs, hat es bei der Einrichtung &quot;Signaltransduktion Therapie von Krebs&quot; viel Interesse gewesen, 2 , wobei Medikamente wurden entwickelt , um bösartige Signalwege zu stören. Vor kurzem haben wir einen alternativen Ansatz zur Signaltransduktion Therapie, die beruht auf der Fähigkeit von Arzneimitteln zu erzeugen unnatürliche Signaltransduktionswege vorgeschlagen. <sup&gt; 3 Insbesondere glauben wir, dass synthetische Wirkstoffe durch die Gestaltung, die die Funktion von Signalproteinen nachahmen, wäre es möglich , die Zelle die Funktion indirekt zu modulieren. Beispielsweise können diese künstlichen Netzwerken Proteinbiomarker ermöglichen Enzyme zu aktivieren, die Prodrugs abspalten. Alternativ könnten diese Signalprotein-Mimetika können unnatürliche Zelle Signalwege zu aktivieren, in therapeutischen Wirkungen zur Folge hat. Um die Machbarkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, haben wir vor kurzem eine synthetische &quot;chemische Wandler &#39;4 , die durch Aktivierung von Glutathion-s-Transferase (GST), das von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF) auszulösen , die Spaltung eines Antikrebs - Prodrug ermöglicht ist nicht seine natürlichen Bindungspartner. Die Struktur dieses &quot;Wandler&quot; besteht aus einem anti-PDGF-Aptamer-DNA, die mit einem bivalenten Inhibitor für GST modifiziert wird. Daher gehört diese synthetische Mittel auf eine Familie von Molekülen mit Bindungsstellenverschiedene Proteine, 5-7 wie chemische Induktoren der Dimerisierung (CIDs) 8-10 und auch an die Gruppe von Protein-Bindemittel auf Basis von Oligonukleotid-synthetisches Molekül - Konjugate. 11-21 Die allgemeinen Prinzipien der Konstruktion solcher Systeme zugrundeliegende Aufgabe wird hierin beschrieben und detaillierte Protokolle zum Synthetisieren und Testen der Funktion dieses &quot;Wandler&quot; mit herkömmlichen enzymatischen Assays bereitgestellt. Diese Arbeit soll zusätzlichen &quot;Wandler&quot; dieser Klasse zu erleichtern entwickeln, die verwendet werden können intrazelluläre Protein-Protein-Kommunikation zu vermitteln und folglich künstliche Zellsignalwege induzieren. 1 schematisch beschreibt die Arbeitsweise von synthetischen &quot;chemische Sensoren&quot; , die unnatürliche Protein-Protein - Kommunikation vermitteln kann. In dieser Darstellung eine &quot;chemische Wandler&quot;, die für Prot synthetische Bindemittel integrierteins I und II (Bindemittel I und II), ermöglicht Protein II die katalytische Aktivität des Proteins auszulösen I, die nicht ihren natürlichen Bindungspartner ist. In Abwesenheit von Protein II bindet der Wandler die katalytische Stelle des Enzyms (Proteins I) und inhibiert seine Aktivität (Abbildung 1, Zustand II). Die Bindung des &quot;Transducer&quot; zum Protein II, jedoch fördert Wechselwirkungen zwischen Bindemittel I und der Oberfläche des Protein II (Abbildung 1, Zustand III), die als Ergebnis ihrer Affinität zu Protein I. reduziert, die effektive Konzentration des &#39; frei &quot;Wandler in der Lösung verringert wird , was dazu führt zur Dissoziation des Wandlers-Protein - Komplex I und Reaktivierung von Protein I (Abbildung 1, Zustand iv). Zusammengenommen markieren diese Schritte drei Grundsätze für die Gestaltung effizienter &quot;Wandler&quot; zugrunde liegen: (1) ein &quot;Wandler&quot; sollte für jeden der Protein-Targets ein spezifisches Bindemittel haben, (2) die Interaktion between Bindemittel II und Protein sollte II als die Wechselwirkung zwischen Bindemittel I und Protein I, und (3) Bindemittel stärker I der Lage mit der Oberfläche des Proteins zu interagieren II sein müssen. Das letzte Prinzip erfordert nicht unbedingt, dass Bindemittel Ich hätte allein eine hohe Affinität und Selektivität gegenüber Protein II. Stattdessen wird es auf unserer jüngsten Studien basieren , die zeigten , daß ein Protein , ein synthetisches Molekül in die Nähe bringen wahrscheinlich Wechselwirkungen zwischen diesem Molekül und der Oberfläche des Proteins zu fördern. 19,22,23 <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Abb . 1: Funktionsprinzipien von &quot;chemischen Wandler&quot; Wenn die &quot;chemische Wandler&quot; zu einem aktiven Protein hinzugefügt I (Zustand i), bindet es an seine aktive Stelle durch Bindemittel I und hemmt ihre Aktivität (Zustand ii). In Gegenwart von Protein II jedoch die ungebundene &quot;chemische transducer &#39;in Wechselwirkung mit Protein II durch Bindemittel II, die II Wechselwirkungen zwischen Bindemittel I und der Oberfläche des Proteins fördert. Dieser induzierte Bindemittel I-Protein II Wechselwirkung reduziert die effektive Konzentration des Bindemittels I, die zur Dissoziation des &#39;transducer&#39;-Protein führt I - Komplex und zur Protein Reaktivierung I (Stand iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a>

<table><tbody><tr><td>1-Chlor-2,4-dinitrobenzol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acetnitril</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Biologische Industrie</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Ethacrynsäure</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-s-Transferase M1-1</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathion-reduziertes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>kolorimetrisches Nitrat/Nitrit-Assay-Kit</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotide</td><td>W. M. Keck Foundation Biotechnologie an der Yale University</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Entsalzungssäule</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Säulen</td> HPLC Wasser<td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>2695 Trennmodul</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Säule</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 Säule (2,5 &mu; M, 4,6 mm & mal; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Säule</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 Säule (2,5&nbsp; &mu; M, 10 mm & mal; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

imitieren die funktion von signalproteinen: gegen künstliches signal transduction therapie

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Signaltransduktionswege, die die Reaktion von Zellen auf verschiedene Umweltsignale steuern, werden durch die Funktion von Signalproteinen vermittelt, die miteinander interagieren und sich gegenseitig mit hoher Spezifität aktivieren. Synthetische Wirkstoffe, die die Funktion dieser Proteine nachahmen, könnten daher verwendet werden, um unnatürliche Signaltransduktionsschritte zu erzeugen und damit die Funktion der Zelle zu verändern. Wir stellen Richtlinien für die Entwicklung von "chemischen Wandlern" vor, die eine künstliche Kommunikation zwischen nativen Proteinen induzieren können. Darüber hinaus stellen wir detaillierte Protokolle für die Synthese und Prüfung eines spezifischen "Transducers" vor, der die Kommunikation zwischen zwei nicht verwandten Proteinen induzieren kann: dem Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und der Glutathion-S-Transferase (GST). Die Art und Weise, wie diese unnatürliche PDGF-GST-Kommunikation zur Kontrolle der Spaltung eines Krebsmedikaments verwendet werden könnte, wird ebenfalls vorgestellt, was auf das Potenzial für den Einsatz solcher Systeme in der "künstlichen Signaltransduktionstherapie" hinweist. Diese Arbeit soll die Entwicklung weiterer "Wandler" dieser Klasse erleichtern, die zur Vermittlung der intrazellulären Protein-Protein-Kommunikation und damit zur Induktion künstlicher Zellsignalwege verwendet werden können.

Das Design, die Synthese und Wirkungsmechanismus eines &quot;chemischen Wandler &#39; , die künstliche Verbindung zwischen PDGF und GST induzieren kann in Abbildung 2 dargestellt. Die Struktur des&quot; Transducer &quot;integriert eine PDGF DNA - Aptamer und einem bis-Ethacrynic amid (bea ), die eine bekannte GST - Inhibitor (2a) ist. 19. Diese Bindemittel die &quot;Wandler&quot; ermöglichen sowohl PDGF und GST mit unterschiedlichen Affinitäte...

Wir stellen Richtlinien für die Entwicklung synthetischer 'chemischer Wandler' vor, die die Kommunikation zwischen natürlich nicht verwandten Proteinen induzieren können. Darüber hinaus werden detaillierte Protokolle für die Synthese und Prüfung eines spezifischen "Schallkopfs" vorgestellt, der es einem Wachstumsfaktor ermöglicht, ein entgiftendes Enzym zu aktivieren und folglich die Spaltung eines Krebsprodrugs zu regulieren.

Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die künstliche Kommunikation zwischen zwei Proteinen, die durch einen synthetischen chemischen Transduzenten ausgelöst wird, spektroskopisch zu verfolgen. Dies wird die Möglichkeit aufzeigen, synthetische Analoga von Signalproteinen zu entwickeln, die in der Lage sind, Signaltransduktionswege auszuführen, die in der Natur nicht vorkommen. Die Fähigkeit, künstliche Protein-Protein-Kommunikation mithilfe eines gängigen Spektrophotometers zu verfolgen, könnte zur Entwicklung und Verbesserung der Funktion künstlicher chemischer Transduzenten beitragen und uns einem künstlichen Signaltransduktions-Therapieansatz näherbringen.Der chemische Transduktor besteht aus einem aus Thrombozyten stammenden Wachstumsfaktor oder einem PDGF-Aptamer, einem bivalenten Ethacrynsäureamid-GST-Inhibitor, einem Fluorophor und einem Quencher. Die Synthese des chemischen Transduktors wird in diesem Video nicht demonstriert.Doch wird im Textprotokoll beschrieben. Die Wirkungsweise des chemischen Transduktors wird hier veranschaulicht. Der chemische Transduktor hemmt die enzymatische Aktivität von GST, wenn die beiden EA-Gruppen an die aktiven Stellen des

mimicking-function-signaling-proteins-toward-artificial-signal

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Dieses Protokoll beschreibt eine optogenetische Strategie zur Modulation der mitogenaktivierten Proteinkinase (MAPK) Aktivität während der Zelldifferenzierung und der Xenopus embryonalen Entwicklung. Diese Methode ermöglicht die reversible Aktivierung des MAPK-Signalwegs in der Säugerzellkultur und in multizellulären Lebendorganismen wie Xenopus- Embryonen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Lichtvermittelte reversible Modulation des mitogenaktivierten Proteinkinase-Pathways während der Zelldifferenzierung und<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Entwicklung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Antikörper-Arrays zu Veränderungen im Signalwege in verschiedenen zellulären Modellen zu identifizieren. Diese Veränderungen, verursacht durch Medikamente/Hypoxie/ultra-violet Licht/Strahlung oder durch Überexpression/Herabregulation/Knockouts, sind wichtig für die verschiedenen Krankheitsmodelle und können angeben, ob eine Therapie wirksam werden oder Mechanismen der Drogen identifizieren kann Widerstand.

Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen Tyrosin-Kinase-Inhibitoren durch eine Befragung von Signal Transduction Bahnen durch Antikörper-Arrays

Die optogenetische Manipulation von Signalwegen kann eine leistungsfähige Strategie sein, um zu untersuchen, wie Signale in der Entwicklung, Regeneration, Homöostase und Krankheit entschlüsselt werden. Dieses Protokoll enthält praktische Richtlinien für die Verwendung von Licht-Sauerstoff-Spannungs-Sensordomänen-basierten Knoten- und knochenmorphogenen Protein-Signalaktivatoren (BMP) im frühen Zebrafischembryo.

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Die Proteinzusammensetzung des menschlichen Mitralklappens ist noch teilweise unbekannt, weil seine Analyse durch niedrige Zellularität und damit durch eine geringe Proteinbiosynthese kompliziert wird. Diese Arbeit liefert ein Protokoll zur effizienten Extraktion von Protein für die Analyse des Mitralklappenproteoms.

Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Diese Methode beschreibt die Klonen, Ausdruck und Reinigung von rekombinanten Nsa1 zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie und kleine Winkel Röntgenstreuung (SAXS) und gilt für die Hybrid-Strukturanalyse von anderen Proteinen mit beiden bestellt und Domänen ungeordnet.

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

Wir zeigen eine neuartige Methode für das Konstruieren einer Einzel-Zell-basierte 3-dimensionale (3D) Montage ohne eine künstliche Gerüst.

Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen

Dieses Protokoll beschreibt die Kombination von Größenausschlusschromatographie mit Multi-Winkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) zur absoluten Charakterisierung von Proteinen und Komplexen in Lösung. SEC-MALS bestimmt das Molekulargewicht und die Größe reiner Proteine, nativer Oligomere, Heterokomplexe und modifizierter Proteine wie Glykoproteine.

Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Erfahren Sie die Entwicklung synthetischer chemischer Transducer zur Steuerung unnatürlicher Protein-Kommunikation mittels spektroskopischer Methoden. Diese Technik ermöglicht neue Ansätze für die künstliche Signaltransduktionstherapie.

Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie

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