Name: Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung synthetischer chemischer Transducer zur Steuerung unnatürlicher Protein-Kommunikation mittels spektroskopischer Methoden. Diese Technik ermöglicht neue Ansätze für die künstliche Signaltransduktionstherapie.

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Diese Arbeit wurde von der Minerva-Stiftung, der HFSP-Organisation und einen Europäischen Forschungsrat Grant (Starting Grant 338.265) unterstützt wurde.

1. Synthese des &quot;Chemical Transducer&quot; <ol><li> Vorläufige Vorbereitungen <ol><li> Bereiten 2 M Triethylammoniumacetat (TEAA) -Puffer durch Mischen von 278 ml Triäthylamin mit 114 ml Essigsäure und 400 ml Reinstwasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7 und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 L. Halten Sie es in einer dunklen Flasche. Hinweis: Diese Lösung seit Jahren stabil ist. </li><li> Bereiten Sie eine 5 mM Ascorbinsäure-Lösung von 18 mg Ascorbinsäure in 20 ml Reinstwasser gelöst wird. Verwenden Sie eine frische Lösung; die Lösung ist für einen Tag stabil. </li><li> Vorbereiten eines 10 mM Cu (II) / Tris (benzyltriazolylmethyl) amin (TBTA) Lösung, die durch Lösen von 25 mg Kupfer (II) -sulfat-pentahydrat in 10 ml Reinstwasser und 58 mg TBTA in 11 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Die beiden Lösungen mischen. Halten Sie es bei Raumtemperatur und schützen Sie es vor Licht. </li></ol></li><li> Konjugation Verfahren <ol><li> Man löst 100 nmol des modifizierten Oligonukleotid (ODN-1) in 80 ulvon frischem Reinstwasser. In 20 ul 2 M TEAA, pH = 7. Fügen Sie 80 ul einer frisch zubereiteten Lösung von Ascorbinsäure (5 mM in Wasser). </li><li> Man löst 1,5 &amp; mgr; Mol (574,5 ug) von Azid-modifizierten Ethacrynsäure in 180 &amp; mgr; l DMSO und fügen Sie ihn in die Lösung. Entgasen der Lösung für 60 Sekunden und fügen Sie schnell 40 &amp; mgr; l aus der Cu (II) / TBTA-Lösung (10 mM in 55% (v / v) DMSO / Wasser) unter Verwendung von Argon. </li><li> Spülen Sie wieder mit Argon, dicht schließen, und über Nacht rühren. </li><li> Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion und reinigen das Konjugat durch RP-HPLC (mobile Phase: A) 5% Acetonitril, 5% TEAA, 90% Reinstwasser; B) 65% Acetonitril, 5% TEAA, 30% Reinstwasser). 24 </li></ol></li></ol> 2. Kontrolle GST-Aktivität von PDGF <ol><li> Vorläufige Vorbereitungen <ol><li> Vorbereitung 50 ml Testpuffer durch 33,9 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBSx1) mit 16,1 ml Reinstwasser Mischen einer 8 mM final Phosphatkonzentration und Anzeige zu erreichen,d 23,8 mg 2 MgCl eine 5 mM Endkonzentration zu erreichen. </li><li> Vorbereitung einer Stammlösung von GST M1-1 durch das Protein in einem Puffer aufgelöst, der 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer Endkonzentration von 30 uM. Teilen Sie diese Lösung in kleinen Portionen und bei -80 ° C. Verdünnen Sie frisch, gemäß Abschnitt 2.1.5.1, in dem Assaypuffer und auf Eis halten. Anmerkung: Die Lösung wird für etwa 5 Stunden stabil sein, oder bis es zu einer Verringerung der Enzymaktivität ist. </li><li> Bereiten Sie das Substrat gemäß den folgenden Anweisungen: <ol><li> Man löst 10 mg reduziertem Glutathion (GSH) in 325 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser in einer Endkonzentration von 100 mM Stammlösung. Verdünnen 21 &amp; mgr; l aus dieser Stammlösung in 979 &amp; mgr; l Assaypuffer für eine Endkonzentration von 2,1 mM Arbeitslösung. </li><li> Man löst 10 mg 2,4-Dinitrochlorbenzol (CDNB) in 492 &amp; mgr; l eTHANOL bis zu einer Endkonzentration von 100 mM Stammlösung. Verdünnte 43,2 &amp; mgr; l der Vorratslösung in 956,8 ul eines Assay-Puffers für eine Endkonzentration von 4,32 mM Arbeitslösung. </li></ol></li><li> In einer 96-Well-Platte, setzen jedes Substrat in einer separaten Zeile (12 Wells). mindestens 60 &amp; mgr; l in jeder Einsatz auch eine schnelle und leichte Entnahme der Lösung zu ermöglichen. Die Platte mit einem Aluminiumblech für Lichtschutz. </li><li> Die folgenden Stammlösungen im Assay-Puffer: <ol><li> Verdünne GST M1-1 um 50 bis zu einer Endkonzentration von 0,6 uM des Dimers. </li><li> Verdünnen Sie die &quot;chemische Wandler&quot; zu einer 30 &amp; mgr; M Stammlösung. </li><li> Verdünnte PDGF zu einer Endkonzentration von 40 uM. </li><li> Verdünnte PDGF-Aptamer mit einer Endkonzentration von 250 uM. </li></ol></li></ol></li><li> Messen Sie die GST-Aktivität in Gegenwart des &quot;chemischen Wandler &#39;und PDGF. <ol><li> Stellen Sie eine experimentelle Verfahren i upn den Plattenleser für die kinetische Messung. <ol><li> Erstellen Sie ein neues Experiment als &quot;Standardprotokoll&quot;. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Verfahren&quot; das Verfahren Einstellungsfenster zu öffnen. </li><li> In der Pop-up-Liste auf der oberen Seite des Fensters, wählen Sie &quot;384 Platte &#39;Typ gemäß der Plattenhersteller. </li><li> Drücken Sie &#39;Read&#39; im linken Menü. </li><li> In Bezug auf das Nachweisverfahren &quot;Absorptions&quot; wählen. </li><li> In Bezug auf die Lesetyp &#39;Endpunkt&#39; wählen. </li><li> Schreib 340 nm auf der Wellenlängenfenster. </li><li> Drücken Sie auf der &#39;Vollplatte &quot;unten auf der rechten oberen Seite und wählen Sie das gut gemessen werden. </li><li> Drücken Sie auf &quot;OK&quot; zu schließen das &quot;Lesen&quot; Fenster. </li><li> Wählen Sie &quot;Start kinetische &#39;im linken Menü. </li><li> Sprechen Sie die Laufzeit 10 min. </li><li> Wählen Sie die Mindestabstände Option. </li><li> Drücken Sie &quot;OK&quot;, um die kinetische Fenster zu schließen. </li><li> Ziehen Sie das &quot;Lesen&quot; der Zeile into die kinetische Messung. </li><li> Drücken Sie die &#39;Bestätigen&#39; Taste und dann die Taste &quot;OK&quot;. </li><li> Speichern Sie das Experiment. </li><li> Drücken Sie die &quot;Play&quot; -Taste. Ein Dialogfeld erscheint - drücken Sie die Taste &quot;OK&quot; nur dann, wenn die Messung gestartet werden soll. </li></ol></li><li> Um die Triplikaten Experiment durchführen, bereiten vier Proben mit jeweils 3,25 ul des &quot;chemischen Wandler&quot; und 3,25 ul GST M1-1. In jeder Probe 0, 1.2, 2.4 oder 4.9 ul PDGF und 123,5, 122,3, 121,1 oder 118,6 ul des Puffers Assay sind. </li><li> Inkubieren der Lösung bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> In einem 384-Well-Platte transparent, legen Sie 40 ul der Probe in jede Vertiefung. Setzen Sie die Proben nur in den ungeraden Brunnen oder nur in den geraden Vertiefungen in der gleichen Linie die Verwendung eines Multi-Pipettor für Substratzugabe zu ermöglichen. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipette, fügen Sie schnell 10 ul von jedem der ter Substrate, die in der 96-Well-Platte (siehe Abschnitt 2.1.4), bereits vorgefertigt wurden. Vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte in das Lesegerät und die kinetische Messung starten. Da GST Kinetik sehr schnell ist, versuchen, die Zeit zwischen der Substratzugabe und dem Beginn der kinetischen Messung zu minimieren. </li></ol></li><li> GST Aktivierung / Hemmung Zyklen durch die &quot;chemische Wandler &#39;Vermittelte. <ol><li> Um die Triplikaten Experiment durchführen, bereiten 5 Proben mit je 84,5 ul Assay-Puffer, 3,25 &amp; mgr; l &#39;chemischen Wandler &quot;und 3,25 ul GST M1-1. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> In 3,65 ul Assaypuffer 1 und 3,65 ul von PDGF auf Probe 2-5 zu den Proben. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> In 3,12 ul Assay-Puffer zu den Proben 1-2 und 3,12 ul PDGF Aptamer Proben 3-5. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> Hinzufügen, 24,4 &amp; mgr; l Assay-Puffer zu den Proben1-3 und 24,4 &amp; mgr; l von PDGF auf die Proben 4-5. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. </li><li> 7.8 &amp; mgr; l Assay-Puffer zu den Proben 1-4 und 7,8 &amp; mgr; l PDGF-Aptamer für 5 min 5. Inkubieren bei Raumtemperatur abzutasten. </li><li> In einem 384-Well-Platte transparent, legen Sie 40 ul der Probe in jede Vertiefung. Legen Sie Proben nur in den ungeraden oder nur in den geraden Vertiefungen in der gleichen Linie. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipette, fügen Sie schnell 10 &amp; mgr; l von jedem Substrat (pre-vorbereitet in der 96-Well-Platte). Vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte in das Lesegerät und die kinetische Messung starten. </li><li> Berechne den V 0 [mOD / min] unter jeder Bedingung durch die OD bei 340 nm bei t gemessen Subtrahieren = 0,5 min von der OD bei 340 nm gemessen bei t = 1,5 min , die Aktivierung / Sperrung Recycelbarkeit zu beurteilen. 25 </li></ol></li><li> Bewerten Sie die Reaktion in Echtzeit des &quot;chemischen Wandler&quot; auf Veränderungen in der Umwelt. <ol> &lt;li&gt; Echtzeit-Wirkung von PDGF hinaus <ol><li> Stellen Sie eine experimentelle Verfahren in der Plattenleser für die kinetische Messung auf. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1.1-2.2.1.10. </li><li> Machen Sie die Laufzeit 3,5 min. </li><li> Wählen Sie die Mindestabstände Option. </li><li> Drücken Sie &quot;OK&quot;, um die kinetische Fenster zu schließen. </li><li> Ziehen Sie das &quot;Lesen&quot; Zeile in die kinetische Messung. </li><li> Wählen Sie Platte Out / In im linken Menü. </li><li> Wählen Sie die Option &quot;plate out (kein Dialog) &#39;. </li><li> Wählen Sie die &quot;Verzögerung&quot; Option im linken Menü auf und geben Sie 30 Sek. </li><li> Wählen Sie Platte Out / In im linken Menü. </li><li> Wählen Sie die Option &quot;Platte in (ohne Dialog) &#39;. </li><li> Erstellen Sie eine zweite kinetische Messung durch die Schritte 2.2.1.4 zu wiederholen - 2.2.1.14 aber in Abschnitt 2.2.1.11 die kinetische gesetzt 25 min anstelle von 10 min zu sein. </li><li> Drücken Sie die &#39;Bestätigen&#39; Taste und dann die Taste &quot;OK&quot;. </li><li> Speichern Sie das Experiment. </li><li> Drücken Sie die &#39;play &#39;Taste. Ein Dialogfeld erscheint - drücken Sie die Taste &quot;OK&quot; nur dann, wenn die Messung gestartet werden soll. </li><li> Bereiten Sie zwei Proben von 1 ul GST M1-1 Mischen und 1 ul des &quot;chemischen Wandler &#39;in 38 ul Puffer Assay. Legen Sie die Proben in zwei Vertiefungen einer 384-Well-Platte transparent, eine leere gut zwischen diesen beiden Brunnen zu verlassen. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipettor, schnell 10 &amp; mgr; l von jedem Substrat hinzufügen, vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden, um die Platte in das Lesegerät einlegen und die kinetische Messung starten. </li><li> Wenn die Platte öffnet sich (nach 3,5 min), fügen Sie schnell 1,125 ul PDGF zu einem der Brunnen, vorsichtig mischen, und lassen Sie die Platte für die verbleibenden kinetischen Messungen zu schließen. </li></ol></li><li> Echtzeit-Effekt der Zugabe des PDGF-Aptamer <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1.1-2.4.1.15. </li><li> Bereiten Sie zwei Proben von 1 ul GST M1-1 Mischen, 1 &amp; mgr; l der &#39;chemische Wandler &quot;und 1,125 &amp; mgr; l PDGF in 36,9 ul Puffer Assay. Legen Sie die Proben in zwei Vertiefungen einer 384-Well-Platte transparent, eine leere gut zwischen diesen beiden Brunnen zu verlassen. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipettor, schnell 10 &amp; mgr; l von jedem Substrat hinzufügen, vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden, um die Platte in das Lesegerät einlegen, und die kinetische Messung starten. </li><li> Wenn die Platte öffnet sich (nach 1,5 min), fügen Sie schnell 1,2 ul PDGF - Aptamer an einem der Brunnen, vorsichtig mischen und lassen Sie die Platte für die verbleibenden kinetischen Messungen zu schließen. </li></ol></li></ol></li><li> Messen Sie JS-K Prodrug-Aktivierung durch GST in der Gegenwart des &quot;chemischen Wandler &#39;und PDGF. <ol><li> Stellen Sie eine experimentelle Verfahren in der Plattenleser für die kinetische Messung auf. <ol><li> Erstellen Sie ein neues Experiment als &quot;Standardprotokoll&quot;. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Verfahren&quot; das Verfahren Einstellungsfenster zu öffnen.</li><li> In der Pop-up-Liste auf der oberen Seite des Fensters &#39;384 Platte&#39; Typ gemäß der Plattenhersteller wählen. </li><li> Drücken Sie &#39;Read&#39; im linken Menü. </li><li> In Bezug auf das Nachweisverfahren &quot;Absorptions&quot; gewählt haben. </li><li> In Bezug auf die Lesetyp &#39;Endpunkt&#39; wählen. </li><li> Schreib 305 nm auf der Wellenlängenfenster. </li><li> Drücken Sie auf die &quot;Vollplatte&quot; -Taste auf der oberen rechten Seite und wählen Sie das gut gemessen werden. </li><li> Drücken Sie auf &quot;OK&quot; zu schließen das &quot;Lesen&quot; Fenster. </li><li> Wählen Sie &quot;Start kinetische &#39;im linken Menü. </li><li> Sprechen Sie die Laufzeit 10 min. </li><li> Wählen Sie die Mindestabstände Option. </li><li> Drücken Sie &quot;OK&quot;, um die kinetische Fenster zu schließen. </li><li> Ziehen Sie das &quot;Lesen&quot; Zeile in die kinetische Messung. </li><li> Drücken Sie die &#39;Bestätigen&#39; Taste und dann die Taste &quot;OK&quot;. </li><li> Speichern Sie das Experiment. </li><li> Drücken Sie die &quot;Play&quot; -Taste. Ein Dialog box erscheint - drücken Sie die Taste &quot;OK&quot; nur dann, wenn die Messung gestartet werden soll. </li></ol></li><li> Für die NO-Produktion Messungen verwenden, um ein Nitrit / Nitrat kalorimetrischen-Kit. In einer 96-Well-Platte 50 ul Testpuffer einfügen in eine Zeile, 70 &amp; mgr; l Griess ich in einer zweiten Reihe Reagens und 70 ul von Griess II Reagenz in einer dritten Reihe. </li><li> Um die Triplikaten Experiment durchführen, bereiten vier Proben mit jeweils 4,8 ul des &quot;chemischen Wandler&quot;. Zu 1 Probe, 155,2 ul Assay-Puffer hinzuzufügen; 2, fügen 3,2 ul GST-M1-1 und 152 &amp; mgr; l Assaypuffer zu probieren; 3, fügen 9,6 ul PDGF und 145,6 ul Assaypuffer zu probieren; und 4 Probe, fügen 3,2 ul GST-M1-1, 9,6 ul PDGF und 142,4 ul Puffer Assay. </li><li> Inkubieren der Lösung bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> In einem 384-Well-Platte transparent, fügen Sie 50 ul der Probe in jede Vertiefung. Legen Sie Proben nur in den ungeraden oder nur in derauch Vertiefungen in der gleichen Linie die Verwendung eines Multi-Pipettor für Substratzugabe zu ermöglichen. </li><li> Hinzufügen, 0,54 ul JS-K (5 mM in DMSO) zu jedem Well. </li><li> Mit einem 12-Kanal-Multi-Pipettor, schnell 10 &amp; mgr; l aus der GSH-Lösung (in der 96-Well-Platte vorbereitete) hinzufügen, vorsichtig mischen und schnell Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte in das Lesegerät und die kinetische Messung starten. </li><li> Unmittelbar nach der kinetischen Messung, ein 12-Kanal-Multipipette, nehmen 50 &amp; mgr; l von jeder Probe in den Testpuffer Zeile in der vorbereiteten 96-Well-Platte und schnell auf sie 50 ul Reagenz Griess ich hinzufügen und 50 ul Griess II Reagenz. Inkubieren während sie von Licht für 10 min bei RT und Messen der Extinktion bei 550 nm zu schützen. Hinweis: Der Testpuffer und Reagenzien Volumen auf der Kits &#39;Protokoll abhängig sind. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling%E2%80%942000+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling—2000 and Beyond.</a> Cell. 100, 113-127 (2000).</li>
<li>Levitzki, A., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction therapy of cancer.</a> Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).</li>
<li>Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+signal+transduction+therapy%3A+a+futuristic+approach+to+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment.</a> Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).</li>
<li>Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Communication+and+Enzyme+Activation+Mediated+by+a+Synthetic+Chemical+Transducer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer.</a> J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).</li>
<li>Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Applications+of+Bifunctional+Small+Molecules%3A+Why+Two+Heads+Are+Better+Than+One%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One.</a> ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).</li>
<li>Rutkowska, A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Tango%3A+The+Toolbox+to+Capture+Interacting+Partners%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).</li>
<li>Meyer, C., Köhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+T%C3%AAte-%C3%A0-T%C3%AAte+Arranged+by+a+Designed+Adaptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).</li>
<li>Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+as+a+Regulatory+Mechanism+in+Signal+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction.</a> Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).</li>
<li>DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+signaling+at+will%3A+chemically-inducible+dimerization+%28CID%29+techniques+resolve+problems+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology.</a> Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).</li>
<li>Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+over+protein-protein+interactions%3A+beyond+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors.</a> Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).</li>
<li>Diezmann, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-guided+display+of+proteins+and+protein+ligands+for+the+interrogation+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).</li>
<li>Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Controlled+Reversible+Switching+of+Peptide+Conformation+and+Bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).</li>
<li>Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA-Controlled+Switching+of+Protein+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity.</a> ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).</li>
<li>Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Small+Molecule+Chimera+with+Responsive+Protein-Binding+Ability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).</li>
<li>Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Binding+Molecular+Switches+via+Host-Guest+Stabilized+DNA+Hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).</li>
<li>Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+for+high-performance+bivalent+nucleic+acid+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Logical+Molecular+Circuit+for+Programmable+and+Autonomous+Regulation+of+Protein+Activity+Using+DNA+Aptamer-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).</li>
<li>Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Protein+Surface+Sensors+as+a+Tool+for+Analyzing+Small+Populations+of+Proteins+in+Biological+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).</li>
<li>Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular%2C+DNA-Based+Beacon+for+Single-Step+Fluorescence+Detection+of+Antibodies+and+Other+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).</li>
<li>Franzini, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Structure-Activity+Relationships+from+Screening+a+Structurally+Compact+DNA-Encoded+Chemical+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).</li>
<li>Unger-Angel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+recognition+by+bivalent%2C+%27turn-on%27+fluorescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes.</a> Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).</li>
<li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li>
<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben eine Methode zum Entwerfen und Testen eines "chemischen Wandlers" vorgestellt, der eine künstliche Kommunikation zwischen zwei von Natur aus nicht verwandten Proteinen, GST und PDGF, induzieren kann, ohne die nativen Proteine zu modifizieren. Die unnatürliche GST-PDGF-Kommunikation konnte in Echtzeit nachgewiesen werden, indem enzymatische Assays verwendet wurden, die die Veränderungen der Aktivität von GST in Gegenwart des "chemischen Wandlers" verfolgen und die PDGF-Konzentrationen erhöhen. Zusätzlich zum Nac...

Signaltransduktionswege spielt eine bedeutende Rolle in praktisch allen zellulären Prozess und damit die Zelle rasch auf Umgebungssignale zu reagieren. 1 Diese Wege häufig durch die Bindung eines Signalmoleküls an einen extrazellulären Rezeptor ausgelöst werden, die in der Aktivierung von intrazellulären Enzymen führt. Verstärkung und Ausbreitung dieses Signals innerhalb der Zelle wird durch die Funktion vermittelt Proteine ​​von Signalisierungs, die ein Netzwerk von Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden, in denen Enzyme mit hoher Spezifität reversibel aktiviert werden. Da Dysregulation dieser Netze führt häufig zur Entwicklung von Krebs, hat es bei der Einrichtung &quot;Signaltransduktion Therapie von Krebs&quot; viel Interesse gewesen, 2 , wobei Medikamente wurden entwickelt , um bösartige Signalwege zu stören. Vor kurzem haben wir einen alternativen Ansatz zur Signaltransduktion Therapie, die beruht auf der Fähigkeit von Arzneimitteln zu erzeugen unnatürliche Signaltransduktionswege vorgeschlagen. <sup&gt; 3 Insbesondere glauben wir, dass synthetische Wirkstoffe durch die Gestaltung, die die Funktion von Signalproteinen nachahmen, wäre es möglich , die Zelle die Funktion indirekt zu modulieren. Beispielsweise können diese künstlichen Netzwerken Proteinbiomarker ermöglichen Enzyme zu aktivieren, die Prodrugs abspalten. Alternativ könnten diese Signalprotein-Mimetika können unnatürliche Zelle Signalwege zu aktivieren, in therapeutischen Wirkungen zur Folge hat. Um die Machbarkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, haben wir vor kurzem eine synthetische &quot;chemische Wandler &#39;4 , die durch Aktivierung von Glutathion-s-Transferase (GST), das von Blutplättchen abstammenden Wachstumsfaktor (PDGF) auszulösen , die Spaltung eines Antikrebs - Prodrug ermöglicht ist nicht seine natürlichen Bindungspartner. Die Struktur dieses &quot;Wandler&quot; besteht aus einem anti-PDGF-Aptamer-DNA, die mit einem bivalenten Inhibitor für GST modifiziert wird. Daher gehört diese synthetische Mittel auf eine Familie von Molekülen mit Bindungsstellenverschiedene Proteine, 5-7 wie chemische Induktoren der Dimerisierung (CIDs) 8-10 und auch an die Gruppe von Protein-Bindemittel auf Basis von Oligonukleotid-synthetisches Molekül - Konjugate. 11-21 Die allgemeinen Prinzipien der Konstruktion solcher Systeme zugrundeliegende Aufgabe wird hierin beschrieben und detaillierte Protokolle zum Synthetisieren und Testen der Funktion dieses &quot;Wandler&quot; mit herkömmlichen enzymatischen Assays bereitgestellt. Diese Arbeit soll zusätzlichen &quot;Wandler&quot; dieser Klasse zu erleichtern entwickeln, die verwendet werden können intrazelluläre Protein-Protein-Kommunikation zu vermitteln und folglich künstliche Zellsignalwege induzieren. 1 schematisch beschreibt die Arbeitsweise von synthetischen &quot;chemische Sensoren&quot; , die unnatürliche Protein-Protein - Kommunikation vermitteln kann. In dieser Darstellung eine &quot;chemische Wandler&quot;, die für Prot synthetische Bindemittel integrierteins I und II (Bindemittel I und II), ermöglicht Protein II die katalytische Aktivität des Proteins auszulösen I, die nicht ihren natürlichen Bindungspartner ist. In Abwesenheit von Protein II bindet der Wandler die katalytische Stelle des Enzyms (Proteins I) und inhibiert seine Aktivität (Abbildung 1, Zustand II). Die Bindung des &quot;Transducer&quot; zum Protein II, jedoch fördert Wechselwirkungen zwischen Bindemittel I und der Oberfläche des Protein II (Abbildung 1, Zustand III), die als Ergebnis ihrer Affinität zu Protein I. reduziert, die effektive Konzentration des &#39; frei &quot;Wandler in der Lösung verringert wird , was dazu führt zur Dissoziation des Wandlers-Protein - Komplex I und Reaktivierung von Protein I (Abbildung 1, Zustand iv). Zusammengenommen markieren diese Schritte drei Grundsätze für die Gestaltung effizienter &quot;Wandler&quot; zugrunde liegen: (1) ein &quot;Wandler&quot; sollte für jeden der Protein-Targets ein spezifisches Bindemittel haben, (2) die Interaktion between Bindemittel II und Protein sollte II als die Wechselwirkung zwischen Bindemittel I und Protein I, und (3) Bindemittel stärker I der Lage mit der Oberfläche des Proteins zu interagieren II sein müssen. Das letzte Prinzip erfordert nicht unbedingt, dass Bindemittel Ich hätte allein eine hohe Affinität und Selektivität gegenüber Protein II. Stattdessen wird es auf unserer jüngsten Studien basieren , die zeigten , daß ein Protein , ein synthetisches Molekül in die Nähe bringen wahrscheinlich Wechselwirkungen zwischen diesem Molekül und der Oberfläche des Proteins zu fördern. 19,22,23 <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Abb . 1: Funktionsprinzipien von &quot;chemischen Wandler&quot; Wenn die &quot;chemische Wandler&quot; zu einem aktiven Protein hinzugefügt I (Zustand i), bindet es an seine aktive Stelle durch Bindemittel I und hemmt ihre Aktivität (Zustand ii). In Gegenwart von Protein II jedoch die ungebundene &quot;chemische transducer &#39;in Wechselwirkung mit Protein II durch Bindemittel II, die II Wechselwirkungen zwischen Bindemittel I und der Oberfläche des Proteins fördert. Dieser induzierte Bindemittel I-Protein II Wechselwirkung reduziert die effektive Konzentration des Bindemittels I, die zur Dissoziation des &#39;transducer&#39;-Protein führt I - Komplex und zur Protein Reaktivierung I (Stand iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a>

<table><tbody><tr><td>1-Chlor-2,4-dinitrobenzol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acetnitril</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Biologische Industrie</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Ethacrynsäure</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-s-Transferase M1-1</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathion-reduziertes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>kolorimetrisches Nitrat/Nitrit-Assay-Kit</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotide</td><td>W. M. Keck Foundation Biotechnologie an der Yale University</td><td></td><td>Sonderanfertigung</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Entsalzungssäule</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Säulen</td> HPLC Wasser<td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;</td><td>2695 Trennmodul</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Säule</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 Säule (2,5 &mu; M, 4,6 mm & mal; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Säule</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18 Säule (2,5&nbsp; &mu; M, 10 mm & mal; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

imitieren die funktion von signalproteinen: gegen künstliches signal transduction therapie

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Signaltransduktionswege, die die Reaktion von Zellen auf verschiedene Umweltsignale steuern, werden durch die Funktion von Signalproteinen vermittelt, die miteinander interagieren und sich gegenseitig mit hoher Spezifität aktivieren. Synthetische Wirkstoffe, die die Funktion dieser Proteine nachahmen, könnten daher verwendet werden, um unnatürliche Signaltransduktionsschritte zu erzeugen und damit die Funktion der Zelle zu verändern. Wir stellen Richtlinien für die Entwicklung von "chemischen Wandlern" vor, die eine künstliche Kommunikation zwischen nativen Proteinen induzieren können. Darüber hinaus stellen wir detaillierte Protokolle für die Synthese und Prüfung eines spezifischen "Transducers" vor, der die Kommunikation zwischen zwei nicht verwandten Proteinen induzieren kann: dem Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF) und der Glutathion-S-Transferase (GST). Die Art und Weise, wie diese unnatürliche PDGF-GST-Kommunikation zur Kontrolle der Spaltung eines Krebsmedikaments verwendet werden könnte, wird ebenfalls vorgestellt, was auf das Potenzial für den Einsatz solcher Systeme in der "künstlichen Signaltransduktionstherapie" hinweist. Diese Arbeit soll die Entwicklung weiterer "Wandler" dieser Klasse erleichtern, die zur Vermittlung der intrazellulären Protein-Protein-Kommunikation und damit zur Induktion künstlicher Zellsignalwege verwendet werden können.

Das Design, die Synthese und Wirkungsmechanismus eines &quot;chemischen Wandler &#39; , die künstliche Verbindung zwischen PDGF und GST induzieren kann in Abbildung 2 dargestellt. Die Struktur des&quot; Transducer &quot;integriert eine PDGF DNA - Aptamer und einem bis-Ethacrynic amid (bea ), die eine bekannte GST - Inhibitor (2a) ist. 19. Diese Bindemittel die &quot;Wandler&quot; ermöglichen sowohl PDGF und GST mit unterschiedlichen Affinitäte...

Wir stellen Richtlinien für die Entwicklung synthetischer 'chemischer Wandler' vor, die die Kommunikation zwischen natürlich nicht verwandten Proteinen induzieren können. Darüber hinaus werden detaillierte Protokolle für die Synthese und Prüfung eines spezifischen "Schallkopfs" vorgestellt, der es einem Wachstumsfaktor ermöglicht, ein entgiftendes Enzym zu aktivieren und folglich die Spaltung eines Krebsprodrugs zu regulieren.

Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die künstliche Kommunikation zwischen zwei Proteinen, die durch einen synthetischen chemischen Transduzenten ausgelöst wird, spektroskopisch zu verfolgen. Dies wird die Möglichkeit aufzeigen, synthetische Analoga von Signalproteinen zu entwickeln, die in der Lage sind, Signaltransduktionswege auszuführen, die in der Natur nicht vorkommen. Die Fähigkeit, künstliche Protein-Protein-Kommunikation mithilfe eines gängigen Spektrophotometers zu verfolgen, könnte zur Entwicklung und Verbesserung der Funktion künstlicher chemischer Transduzenten beitragen und uns einem künstlichen Signaltransduktions-Therapieansatz näherbringen.Der chemische Transduktor besteht aus einem aus Thrombozyten stammenden Wachstumsfaktor oder einem PDGF-Aptamer, einem bivalenten Ethacrynsäureamid-GST-Inhibitor, einem Fluorophor und einem Quencher. Die Synthese des chemischen Transduktors wird in diesem Video nicht demonstriert.Doch wird im Textprotokoll beschrieben. Die Wirkungsweise des chemischen Transduktors wird hier veranschaulicht. Der chemische Transduktor hemmt die enzymatische Aktivität von GST, wenn die beiden EA-Gruppen an die aktiven Stellen des Enzyms binden.Die Zugabe von PDGF führt zur Bildung des PDGF-Chemotransduktor-Komplexes, wodurch die Interaktion zwischen Transduktor und GST gestört wird und somit die enzymatische Aktivität von GST wiederhergestellt wird. Die anschließende Zugabe eines unmodifizierten PDGF-Aptamers setzt den Chemotransduktor frei und ermöglicht es ihm, das Enzym erneut zu hemmen.Bevor Sie mit den Experimenten zur Untersuchung der Kontrolle der GST-Aktivität durch PDGF beginnen, richten Sie ein experimentelles Verfahren im Plattenreader für kinetische Messungen ein. Erstellen Sie ein neues Experiment als Standardprotokoll. Wählen Sie „Procedure“, um das Fenster „Procedure Settings“ zu öffnen.Wählen Sie in der Popup-Liste an der Oberseite des Fensters den 384-Plattentyp gemäß dem Hersteller der Platte aus. Wählen Sie im linken Menü „Read“ (Lesen). Wählen Sie „Absorbance“ (Absorption) als Nachweismethode.Und Endpunkt für den Messmodus. Geben Sie im Wellenlängenfenster 340 Nanometer ein. Wählen Sie Vollplatte aus und bestimmen Sie die zu messenden Wells.Klicken Sie dann auf „OK“, um das Lese-Fenster zu schließen. Wählen Sie im linken Menü „Kinetik starten“. Stellen Sie die Laufzeit auf 10 Minuten ein.Wählen Sie die Option „Mindestintervalle“ aus. Klicken Sie dann auf „OK“, um das Fenster „Kinetik“ zu schließen. Ziehen Sie die Lesezeile in die kinetische Messung.Wählen Sie die Schaltfläche „Validieren“ und anschließend die Schaltfläche „OK“. Speichern Sie das Experiment. Wählen Sie die Wiedergabetaste.Ein Dialogfeld wird angezeigt, klicken Sie jedoch nicht auf die Schaltfläche „OK“, bis Sie bereit sind, die kinetische Messung zu starten. Nachdem der Plattenreader eingerichtet wurde, folgt als nächster Schritt die Vorbereitung der Proben zur Messung der GST-Aktivität in Gegenwart des chemischen Transduktors und von PDGF. Um vier Konzentrationen von PDGF in dreifacher Ausführung zu testen, bereiten Sie vier Proben vor, von denen jede 3,25 µL des chemischen Transduktors und 3,25 µL GST M-1 enthält.Fügen Sie jeder Probe entsprechend null, 1,2, 2,4 oder 4,9 Mikroliter PDGF hinzu. Anschließend geben Sie das entsprechende Volumen des Assay-Puffers zu jeder Probe hinzu, um ein Gesamtvolumen von 130 Mikrolitern zu erreichen. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur.Nach 10 Minuten übertragen Sie 40 Mikroliter jeder Probe in die Vertiefungen einer 384er-transparenten Mikrotiterplatte. Übertragen Sie jede der vier Proben ausschließlich in die ungeraden oder geraden Vertiefungen derselben Reihe, um die Verwendung eines Mehrkanalpipettiersystems für die Substratzugabe zu ermöglichen.Als Nächstes verwenden Sie einen 12-kanaligen Mehrkanalpipettierer, um jeder Probe schnell 10 µL jedes zuvor in einer 96-Loch-Platte vorbereiteten Substrats hinzuzufügen. Mischen Sie rasch, aber vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden. Setzen Sie die Platte unverzüglich in das Plattenlesegerät ein und starten Sie die kinetische Messung, indem Sie im Dialogfeld die Schaltfläche „OK“ auswählen.Um die durch den chemischen Transduktor vermittelten Hemmzyklen der GST-Aktivierung zu untersuchen, bereiten Sie fünf Proben vor, die jeweils 84,5 Mikroliter Assaypuffer, 3,25 Mikroliter chemischen Transduktor und 3,25 Mikroliter GST M1-1 enthalten. Inkubieren Sie drei Minuten bei Raumtemperatur.Fügen Sie 3,65 µL Assaypuffer zu Probe eins und 3,65 µL PDGF zu den Proben zwei, drei, vier und fünf hinzu. Inkubieren Sie für drei Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie 3,12 µL Assaypuffer zu den Proben eins und zwei sowie 3,12 µL PDGF-Aptamer zu den Proben drei, vier und fünf hinzu.Ansatz bei Raumtemperatur drei Minuten lang inkubieren. 24,4 µL Assaypuffer zu den Proben eins, zwei und drei hinzufügen. Und 24,4 µL PDGF zu den Proben vier und fünf hinzufügen.Ansatz bei Raumtemperatur drei Minuten lang inkubieren. 7,8&nbsp;Mikroliter Assaypuffer zu den Proben eins bis vier und 7,8&nbsp;Mikroliter PDGF-Aptamer zu Probe fünf hinzufügen. Ansatz bei Raumtemperatur fünf Minuten lang inkubieren.Überführen Sie die Proben in eine 384er-transparente Mikrotiterplatte. Führen Sie das Experiment im Dreifachansatz durch und geben Sie schnell das Substrat zu den Proben hinzu. Platzieren Sie die Platte in das Messgerät und starten Sie die kinetische Messung.Um diesen Assay zu beginnen, richten Sie ein experimentelles Verfahren im Plattenreader für kinetische Messungen ein, wie im Protokolltext beschrieben. Bereiten Sie zwei Proben in zwei Vertiefungen einer 384-transparenten Mikrotiterplatte vor. Geben Sie für jede Vertiefung ein Mikroliter GST M1-1 und ein Mikroliter des chemischen Transduktors in 38 Mikroliter Assaypuffer.Lassen Sie eine leere Vertiefung zwischen den beiden Vertiefungen. Fügen Sie mit einem 12-Kanal-Mehrfachpipettierer schnell 10 Mikroliter Substrat zu jeder Vertiefung hinzu und mischen Sie vorsichtig und rasch, um Blasenbildung zu vermeiden.Setzen Sie die Platte unmittelbar in das Messgerät ein und starten Sie die kinetische Messung. Wenn sich das Plattenlesegerät nach 3,5 Minuten öffnet, geben Sie schnell 1,125 µL PDGF in einen der Wells, mischen Sie vorsichtig und lassen Sie die Platte erneut in das Gerät zurückkehren, um die verbleibenden kinetischen Messungen durchzuführen. Bevor Sie die Proben für dieses Experiment vorbereiten, richten Sie im Plattenlesegerät gemäß dem beschriebenen Verfahren im Protokolltext eine Versuchsablauf für die kinetische Messung ein.Ein colorimetrisches Kit zur Bestimmung von Nitrit/Nitrat wird zur Messung der Stickstoffmonoxid-Produktion verwendet. Geben Sie in eine 96-Well-Platte je 50 Mikroliter Assaypuffer pro Well in die erste Reihe und je 70 Mikroliter Griess-Eins-Reagenz pro Well in die zweite Reihe.Und 70 µL Griess-Zweite-Reagenz pro Bohrung in die dritte Reihe. Bereiten Sie vier Proben vor, die jeweils 4,8 µL des chemischen Transduktors enthalten. Geben Sie zu Probe eins 155,2 µL Assaypuffer hinzu.Fügen Sie für Probe zwei 3,2 µL GST M1-1 und 152 µL Assaypuffer hinzu. Fügen Sie für Probe drei 9,6 µL PDGF und 145,6 µL Assaypuffer hinzu. Und fügen Sie für Probe vier 3,2 µL GST M1-1, 9,6 µL PDGF und 142,4 µL Assaypuffer hinzu.Die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 50 Mikroliter Probe pro Vertiefung in einer 384er-transparenten Mikrotiterplatte ansätzen, um das Experiment im Dreifachansatz durchzuführen. Die Proben nur in die ungeraden oder geraden Vertiefungen einer Reihe pipettieren, um die Verwendung eines Mehrkanalpipettiersystems für die Substratzugabe zu ermöglichen.Fügen Sie 0,54 Mikroliter JS-K-Prodrug zu jeder Probe hinzu. Geben Sie schnell 10 Mikroliter Glutathionlösung zu jeder Probe und mischen Sie vorsichtig und rasch, um Blasenbildung zu vermeiden. Platzieren Sie die Platte im Reader und starten Sie die kinetische Messung.Unmittelbar nach der kinetischen Messung 50 Mikroliter jeder Probe in jedes Loch der ersten Reihe der 96-Loch-Platte mit Assay-Puffer überführen. Anschließend 50 Mikroliter aus jedem Loch der zweiten Reihe der Platte in die Löcher der ersten Reihe der Platte übertragen. Und jeweils 50 Mikroliter pro Loch aus der dritten Reihe der Platte in die Löcher der ersten Reihe der Platte geben.10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Vor der Messung der Extinktion bei 550 Nanometern. Die Messung der GST-Aktivität ohne den chemischen Transduktor und mit dem chemischen Transduktor zeigte, dass der chemische Transduktor die GST-Aktivität hemmt.Die GST wird durch die Zugabe steigender Konzentrationen von PDGF zum GST-chemischen Transduktor-Komplex reaktiviert. Aufeinanderfolgende Zugaben von PDGF sowie eines unveränderten PDGF-Aptamers zum GST-chemischen Transduktor-Komplex zeigten, dass die Kommunikation zwischen PDGF und GST reversibel ist. Die Zugabe von PDGF zum GST-Transduktor-Komplex führte zu einem schnellen Anstieg der GST-Aktivität, 3,5 Minuten nach Zugabe der Substrate.Während die Zugabe eines PDGF-Aptamers zu einem Gemisch aus GST, PDGF und dem chemischen Transduktor zu einer Abnahme der GST-Aktivität führte, zeigen diese Ergebnisse, dass das System in Echtzeit auf Veränderungen in seiner Umgebung reagiert. Anschließend wurde die Fähigkeit dieses Systems zur Steuerung der Prodrug-Aktivierung anhand von JS-K untersucht, einem anticancerogenen Prodrug, das durch GST aktiviert wird, um toxisches Stickstoffmonoxid freizusetzen.Die Messungen der Mengen an Stickstoffmonoxid, die bei Zugabe von JS-K zum chemischen Transduktor und zu verschiedenen Kombinationen aus GST und PDGF freigesetzt wurden, bestätigten, dass nur das gleichzeitige Vorhandensein von GST und PDGF JS-K aktiviert. Dies zeigt insgesamt, wie ein synthetisches Agens ein Wachstumsfaktor ermöglichen kann, die katalytische Aktivität der Glutathion-S-Transferase auszulösen, die nicht sein natürliches Enzym-Partner ist. Biomimetika dieser Klasse könnten daher zukünftig dazu verwendet werden, die Reaktion von Zellen auf Umweltsignale zu verändern oder ihnen neue Eigenschaften zu verleihen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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