Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie
29. September 2016
Wir stellen Richtlinien für die Entwicklung synthetischer 'chemischer Wandler' vor, die die Kommunikation zwischen natürlich nicht verwandten Proteinen induzieren können. Darüber hinaus werden detaillierte Protokolle für die Synthese und Prüfung eines spezifischen "Schallkopfs" vorgestellt, der es einem Wachstumsfaktor ermöglicht, ein entgiftendes Enzym zu aktivieren und folglich die Spaltung eines Krebsprodrugs zu regulieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die unnatürliche Kommunikation zwischen zwei Proteinen, die durch einen synthetischen chemischen Wandler induziert wird, spektroskopisch zu verfolgen. Sie werden die Möglichkeit aufzeigen, synthetische Analoga von Signalproteinen zu entwickeln, die in der Lage sein werden, Signaltransduktionswege auszuführen, die in der Natur nicht vorkommen. Die Fähigkeit, die unnatürliche Protein-zu-Protein-Kommunikation mit einem herkömmlichen Spektralphotometer zu verfolgen, könnte dazu beitragen, die Funktion künstlicher chemischer Wandler zu entwickeln und zu verbessern und uns dem Erreichen einer künstlichen Signaltransduktionstherapie näher zu bringen.
Der chemische Wandler besteht aus einem von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktor oder PDGF-Aptamer. Ein bivalenter Ethacrynamide GST-Inhibitor, ein Fluorophor und ein Quencher. Die Synthese des chemischen Wandlers wird in diesem Video nicht demonstriert.
Ist aber im Textprotokoll beschrieben. Die Funktionsprinzipien des chemischen Wandlers werden hier veranschaulicht. Der chemische Wandler hemmt die enzymatische Aktivität von GST, wenn die beiden EA-Gruppen die aktiven Zentren des Enzyms binden.
Die Zugabe von PDGF führt zur Bildung des PDGF-Komplexes für chemische Wandler. Dadurch wird die Wechselwirkung zwischen Schallkopf und GST unterbrochen und somit die enzymatische Aktivität von GST wiederhergestellt. Die anschließende Zugabe eines unmodifizierten PDGF-Aptamers setzt den chemischen Wandler frei und ermöglicht es ihm, das Enzym wieder zu hemmen.
Bevor Sie mit den Experimenten zur Untersuchung der Kontrolle der GST-Aktivität durch PDGF beginnen, richten Sie im Plattenleser ein experimentelles Verfahren für die kinetische Messung ein. Erstellen Sie ein neues Experiment als Standardprotokoll. Wählen Sie Prozedur aus, um das Fenster Prozedureinstellungen zu öffnen.
Wählen Sie in der Popup-Liste auf der oberen Seite des Fensters den Plattentyp 384 entsprechend dem Plattenhersteller aus. Wählen Sie im linken Menü Lesen aus. Wählen Sie Absorption als Nachweismethode aus.
und Endpunkt für den Lesetyp. Geben Sie im Fenster Wellenlänge den Wert 340 Nanometer ein. Wählen Sie Volle Platte aus, und wählen Sie die zu messenden Vertiefungen aus.
Klicken Sie dann auf OK, um das Fenster Lesen zu schließen. Wählen Sie im linken Menü die Option "Kinetic starten" aus. Legen Sie die Laufzeit auf 10 Minuten fest.
Wählen Sie die Option Minimale Intervalle. Klicken Sie dann auf OK, um das kinetische Fenster zu schließen. Ziehen Sie die Leselinie in die kinetische Messung.
Wählen Sie die Schaltfläche Überprüfen und dann die Schaltfläche OK aus. Speichern Sie das Experiment. Wählen Sie die Schaltfläche Wiedergabe aus.
Ein Dialogfeld wird angezeigt, aber wählen Sie die Schaltfläche OK erst aus, wenn Sie bereit sind, die kinetische Messung zu starten. Sobald der Plattenleser eingerichtet ist, besteht der nächste Schritt darin, die Proben für die Messung der GST-Aktivität in Gegenwart des chemischen Wandlers und des PDGF vorzubereiten. Um vier PDGF-Konzentrationen in dreifacher Ausfertigung zu testen, bereiten Sie vier Proben vor, die jeweils 3,25 Mikroliter des chemischen Wandlers und 3,25 Mikroliter GST M-1 enthalten.
Zu jeder Probe werden null, 1,2, 2,4 bzw. 4,9 Mikroliter PDGF gegeben. Geben Sie dann das entsprechende Volumen des Assay-Puffers zu jeder Probe, um das Gesamtvolumen auf 130 Mikroliter zu bringen. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Nach 10 Minuten werden 40 Mikroliter jeder Probe in die Vertiefungen einer transparenten Vertiefungsplatte mit 384 Löchern überführt. Übertragen Sie jede der vier Proben entweder in die ungeraden oder die geraden Vertiefungen in derselben Reihe. Um die Verwendung einer Mehrfachpipette für die Substratzugabe zu ermöglichen.
Verwenden Sie anschließend eine 12-Kanal-Multipipette, um jeder Probe schnell 10 Mikroliter jedes Substrats hinzuzufügen, das zuvor in einer 96-Well-Platte vorbereitet wurde. Schnell, aber vorsichtig mischen, um Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte sofort in den Plattenleser ein und starten Sie die kinetische Messung, indem Sie im Dialogfeld auf die Schaltfläche OK klicken.
Um die durch den chemischen Schallkopf vermittelten Inhibitionszyklen der GST-Aktivierung zu untersuchen, bereiten Sie fünf Proben vor, die jeweils 84,5 Mikroliter Assay-Puffer enthalten. 3,25 Mikroliter chemischer Schallkopf und 3,25 Mikroliter GST M1-1. Drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Fügen Sie 3,65 Mikroliter Assay-Puffer für die erste Probe und 3,65 Mikroliter PDGF für die Proben zwei, drei, vier und fünf hinzu. Drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie 3,12 Mikroliter Assay-Puffer zu den Proben eins und zwei und 3,12 Mikroliter PDGF-Aptamer zu den Proben drei, vier und fünf.
Drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie 24,4 Mikroliter Assay-Puffer zu den Proben eins, zwei und drei. Und 24,4 Mikroliter PDGF für die Proben vier und fünf.
Drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie 7,8 Mikroliter Assay-Puffer in die Proben eins bis vier und 7,8 Mikroliter PDGF-Aptamer in die fünfte Probe. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Übertragen Sie die Proben auf eine transparente 384-Well-Platte. Um das Experiment in dreifacher Ausführung durchzuführen und das Substrat schnell zu den Proben hinzuzufügen. Setzen Sie die Platte in das Lesegerät ein und starten Sie die kinetische Messung.
Um diesen Assay zu starten, richten Sie im Plattenleser ein experimentelles Verfahren für die kinetische Messung ein, wie im Protokolltext beschrieben. Bereiten Sie zwei Proben in zwei Vertiefungen einer transparenten 384-Well-Platte vor. Mischen Sie für jede Vertiefung einen Mikroliter GST M1-1 und einen Mikroliter des chemischen Wandlers in 38 Mikroliter Assay-Puffer.
Lassen Sie eine leere Vertiefung zwischen den beiden Vertiefungen. Mit einer 12-Kanal-Multipipette können Sie schnell 10 Mikroliter Substrat in jede Vertiefung geben. Und vorsichtig und schnell mischen, um Blasen zu vermeiden.
Setzen Sie die Platte sofort in das Lesegerät ein und starten Sie die kinetische Messung. Wenn sich das Plattenlesegerät nach 3,5 Minuten öffnet, geben Sie schnell 1,125 Mikroliter PDGF in eine der Vertiefungen, mischen Sie vorsichtig und lassen Sie die Platte für die verbleibenden kinetischen Messungen wieder in das Lesegerät gelangen. Bevor Sie die Proben für dieses Experiment vorbereiten, richten Sie im Plattenleser ein experimentelles Verfahren für die kinetische Messung ein, wie im Protokolltext beschrieben.
Ein kolorimetrisches Nitrit/Nitrat-Kit wird zur Messung der Stickoxidproduktion verwendet. Geben Sie in einer 96-Well-Platte 50 Mikroliter Assay-Puffer pro Vertiefung in die erste Reihe. 70 Mikroliter Griess One Reagenz pro Vertiefung in die zweite Reihe.
Und 70 Mikroliter Griess Two Reagenz pro Vertiefung in die dritte Reihe. Bereiten Sie vier Proben vor, die jeweils 4,8 Mikroliter des chemischen Wandlers enthalten. Um eine Probe zu nehmen, fügen Sie 155,2 Mikroliter Assay-Puffer hinzu.
Um zwei Proben zu nehmen, fügen Sie 3,2 Mikroliter GST M1-1 und 152 Mikroliter Assay-Puffer hinzu. Um drei Proben zu nehmen, fügen Sie 9,6 Mikroliter PDGF und 145,6 Mikroliter Assay-Puffer hinzu. Und um vier Proben zu nehmen, fügen Sie 3,2 Mikroliter GST M1-1, 9,6 Mikroliter PDGF und 142,4 Mikroliter Assay-Puffer hinzu.
Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie 50 Mikroliter Probe pro Vertiefung in eine transparente 384-Well-Platte, um das Experiment in dreifacher Ausfertigung durchzuführen. Dispensieren Sie Proben nur in die ungeraden oder geraden Vertiefungen in derselben Linie, um die Verwendung eines Multipipetters für die Substratzugabe zu ermöglichen.
Fügen Sie jeder Probe 0,54 Mikroliter JS-K Prodrug hinzu. Geben Sie schnell 10 Mikroliter Glutathionlösung zu jeder Probe und mischen Sie vorsichtig und schnell, um Blasen zu vermeiden. Setzen Sie die Platte in das Lesegerät ein und starten Sie die kinetische Messung.
Unmittelbar nach der kinetischen Messung werden 50 Mikroliter jeder Probe in jede Vertiefung der ersten Reihe der 96-Well-Platte mit Assay-Puffer übertragen. Übertragen Sie dann 50 Mikroliter aus jeder Vertiefung der zweiten Reihe der Platte in die Vertiefungen der ersten Reihe der Platte. Und 50 Mikroliter pro Vertiefung aus der dritten Reihe der Platte in die Vertiefungen der ersten Reihe der Platte.
10 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht schützend inkubieren. Vor der Messung der Extinktion bei 550 Nanometern. Die Messung der GST-Aktivität ohne den chemischen Wandler und mit dem chemischen Wandler zeigte, dass der chemische Wandler die GST-Aktivität hemmt.
GST wird durch Zugabe steigender Konzentrationen von PDGF zum GST-chemischen Wandlerkomplex reaktiviert. Sequentielle Zugaben von PDGF und einem unmodifizierten PDGF-Aptamer zum GST-chemischen Wandlerkomplex zeigten, dass die Kommunikation zwischen PDGF und GST reversibel war. Die Zugabe von PDGF zum GST-Wandlerkomplex führte zu einem raschen Anstieg der GST-Aktivität, 3,5 Minuten nach Zugabe von Substraten.
Während die Zugabe eines PDGF-Aptamers zu einer Mischung aus GST, PDGF und dem chemischen Wandler zu einer Abnahme der GST-Aktivität führte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das System in Echtzeit auf Veränderungen in seiner Umgebung reagiert. Anschließend wurde die Fähigkeit dieses Systems untersucht, die Prodrug-Aktivierung mit JS-K zu kontrollieren, einem Anti-Krebs-Prodrug, das durch GST aktiviert wird, um giftiges Stickstoffmonoxid freizusetzen.
Messungen der Stickoxidmengen, die bei der Zugabe von JS-K zum chemischen Wandler freigesetzt werden, und verschiedene Kombinationen von GST und PDGF bestätigten, dass nur das Vorhandensein von GST und PDGF JS-K aktiviert. All dies zeigt, wie ein synthetischer Wirkstoff es einem Wachstumsfaktor ermöglichen kann, die katalytische Aktivität der Glutathion-S-Transferase auszulösen, die nicht sein natürlicher Enzympartner ist. Zukünftige Biomimetika dieser Klasse könnten daher eingesetzt werden, um die Reaktion von Zellen auf Umweltsignale zu verändern oder ihnen neue Eigenschaften zu verleihen.
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Übersicht
Diese Studie stellt Richtlinien für die Entwicklung synthetischer „chemischer Transduktoren“ vor, die die Kommunikation zwischen nicht verwandten Proteinen ermöglichen. Sie beschreibt Protokolle zur Synthese und Untersuchung eines spezifischen Transduktors, der ein entgiftendes Enzym über einen Wachstumsfaktor aktiviert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biokemie
- Protein-Engineering
- Signaltransduktion
Hintergrund
- Unnatürliche Kommunikation zwischen Proteinen kann durch synthetische Transduktoren induziert werden.
- Die Entwicklung synthetischer Analoga von Signalproteinen ist entscheidend für neuartige therapeutische Strategien.
- Signaltransduktionswege, die in der Natur nicht vorkommen, können mithilfe dieses Ansatzes untersucht werden.
- Gängige Spektrophotometer können verwendet werden, um diese Wechselwirkungen zu verfolgen.
Zweck der Studie
- Die Machbarkeit synthetischer chemischer Transduktoren in der Protein-Kommunikation demonstrieren.
- Die Funktion künstlicher chemischer Transduktoren verbessern.
- Die künstliche Signaltransduktions-Therapie voranbringen.
Verwendete Methoden
- Synthese eines chemischen Transduktors, bestehend aus einem PDGF-Aptamer.
- Verwendung eines bivalenten Ethacrynsäureamid-GST-Inhibitors.
- Einbindung eines Fluorophors und eines Quenchers zur spektroskopischen Analyse.
- Experimenteller Aufbau zur spektroskopischen Verfolgung von Proteinwechselwirkungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Demonstration unnatürlicher Proteininteraktionen.
- Potenzial zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien mithilfe synthetischer Transduktoren.
- Erkenntnisse über die Mechanismen von Signaltransduktionswegen.
- Entwicklung von Protokollen für zukünftige Forschungsarbeiten auf diesem Gebiet.
Schlussfolgerungen
- Synthetische chemische Transduktoren können Proteinwechselwirkungen effektiv vermitteln.
- Diese Forschung ebnet den Weg für innovative Ansätze in der Signaltransduktions-Therapie.
- Weitere Studien sind erforderlich, um diese synthetischen Systeme zu optimieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Arbeit legt die Grundlage für eine künstliche Signaltransduktionstherapie, indem sie zeigt, wie synthetische chemische Transduktoren eine unnatürliche Protein-Protein-Kommunikation vermitteln können. Der Ansatz ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Zielvalidierung, indem orthogonale Signalwege geschaffen werden, die die körpereigenen Regulationsmechanismen umgehen. Solche Systeme bieten einen prädiktiven Wert in präklinischen Modellen, da sie eine präzise zeitliche Kontrolle der Enzymaktivität ermöglichen, die für Prodrug-Aktivierungsstrategien in der Onkologie und anderen Krankheitsgebieten genutzt werden kann.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch induzierbare, reversible Proteininteraktionen zwischen nicht-native Partnern.
- Operationaler Wert: Bietet ein justierbares System zur Beurteilung der Zielmolekülbindung und Pfadmodulation ohne genetische Manipulation.
- Predictive Value: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch Quantifizierung der dosisabhängigen Wiederherstellung der Enzymaktivität als Reaktion auf therapeutische Liganden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, echtzeitfähige Messwerte der Proteinteraktionsdynamik unter Verwendung einer standardmäßigen spektrophotometrischen Detektion.
- Operativer Wert: Etabliert ein reproduzierbares Testformat, das mit Plattlesern hoher Dichte für die kinetische Analyse kompatibel ist.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die multiplexe Prüfung von Bedingungen durch definierte Reagenz-Titration und schrittweise Zugabeprotokolle.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Zeigt die direkte Anwendbarkeit für die Prodrug-Aktivierung, bei der die Transducer-vermittelte GST-Aktivität die Freisetzung der zytotoxischen Wirkstofffracht steuert.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Bestätigt, dass die Signalantwort sowohl vom Transducer als auch vom zugehörigen Liganden abhängt, wodurch das Risiko falsch-positiver Aktivierungen verringert wird.
- Relevanz für präklinische Modelle: Ermöglicht die Bewertung künstlicher Signaltransduktionskreise in krankheitsrelevanten Systemen vor der in-vivo-Validierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie einen chemisch induzierbaren Schalter bereitstellt, der die Zielbindung mit funktionellen Messungen verknüpft und so den Übergang von der Hit-Validierung zur Lead-Optimierung ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie eine externe Kontrolle der Enzymaktivität über eine ligandinduzierte Konformationsänderung des Transduktors ermöglicht.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte kinetische Messungen, die Echtzeit-Proteininteraktionsereignisse widerspiegeln.
- Analytik: Erzeugt zeitlich aufgelöste Aktivitätsdaten, die den Vergleich von Signalübertragungsdynamiken unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verknüpft Targetbindung mit funktionellen Ergebnissen über die Prodrug-Aktivierung und unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf der Signalzuverlässigkeit.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen plattformunabhängigen Rahmen für Transduktor-Designs, der auf verschiedene Proteinepaare über PDGF-GST hinaus anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem die Signalübertragung von endogenem Pfadrauschen entkoppelt wird.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Reagenzverhältnisse, Inkubationszeiten und Detektionsparameter.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die mechanistische Durchführbarkeit bereits frühzeitig bewertet werden kann, bevor in komplexe therapeutische Formate investiert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem Spezifität und Umkehrbarkeit induzierter Signalereignisse quantifiziert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Proteinengineering, Aptamerdesign und Enzymkinetik zur Optimierung der Transduktorkomponenten.
- Hängt von dem Zugang zu Mikrotiterplattenlesegeräten ab, die kinetische Absorptionsmessungen bei 340 nm und 550 nm ermöglichen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Reagenzherstellung und Inkubationsprotokollen, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Transducer-Design auf neue Proteinepaare mit unterschiedlichen Bindungskinetiken oder sterischen Einschränkungen angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Stabilität des Transducers, mögliche Wechselwirkungen mit Nebenzielen und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Titration, um eine Signalüberlastung zu vermeiden.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Synthesis and Operating Principles of the 'Chemical Transducer'
1:51
Setting Up the Plate Reader for Kinetic Measurement
3:26
Measuring GST Activity in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
4:59
Evaluating GST Activation/Inhibition Cycles Mediated by the 'Chemical Transducer'
6:37
Evaluating the Real-time Effect of PDGF Addition
7:42
Measuring JS-K Prodrug Activation by GST in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
10:16
Results: 'Chemical Transducer' Induces Artificial Communication Between PDFG and GST
11:53
Conclusion
