Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli
13. August 2016
Mikrofabrizierte Bauelemente, die mit fluidischen Komponenten integriert sind, bieten eine in vitro Plattform für Zellstudien, die die in vivo Mikroumgebung nachahmen. Wir haben Mikrofluidik-Chips auf Polymethylmethacrylat-Basis entwickelt, um zelluläre Reaktionen unter einzelnen oder koexistierenden chemischen/elektrischen/scheren Stressreizen zu untersuchen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mikrofluidische Vorrichtungen zu entwerfen und herzustellen, um zu beobachten, wie Zellen auf Umweltreize reagieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Zellbiologie und der biomedizinischen Technik zu beantworten. Zum Beispiel, wie Zellen auf unterschiedliche Umweltreize reagieren, einschließlich Chemikalien, Scherkräften und elektrischen Feldern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Kanäle leicht hergestellt und zusammengebaut werden können. Außerdem können diese mikrofluidischen Vorrichtungen die Bedingungen in vivo mit hervorragenden Fähigkeiten nachbilden. Die Demonstration des Verfahrens wird Tzu-Yuan Chou, ein Student aus meinem Labor, und Hsien-San Hou, ein Postdoktorand aus dem Labor von Dr. Julian Chung, durchführen. Zunächst schalten Sie den Kohlenstoffdioxid-Laser-Gravierer ein und überprüfen die Verbindung zum Computer. Laden Sie dann ein vorab gezeichnetes Weihnachtsbaum-Muster, wie eines der hier gezeigten Muster, in den Gravierer. Danach platzieren Sie eine PMMA-Platte oder ein Stück doppelseitiges Klebeband auf der Oberseite des Gravierer-Objekttisches. Stellen Sie den Fokus des Kohlenstoffdioxid-Lasers mit Hilfe der Kalibrierleiste und des sichtbaren Helium-Neon-Lasers ein. Gravieren Sie anschließend das Muster in das Substrat. Sobald die Gravur abgeschlossen ist, nehmen Sie das strukturierte Substrat auf, entfernen Sie die unerwünschten Teile und reinigen Sie die Oberfläche mit einem Strom aus Stickstoff von verbleibenden Rückständen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Komponente des Chips. Bauen Sie den mikrofluidischen Chip für chemische Scherkräfte zusammen. Dazu verbinden Sie drei PMMA-Platten mit dem Muster für chemische Scherkräfte mithilfe von zwei Stücken graviertem doppelseitigem Klebeband. Verwenden Sie Sekundenkleber, um einen Acryl-Adapter mit Gewinde in der Mitte auf der obersten PMMA-Schicht des Chips anzubringen, indem Sie Gewinde und Löcher ausrichten. Diese Adapter dienen als Medien-Zuführungs- und -abflusshäfen sowie als Anschlüsse für Salzbrücken. Fügen Sie danach ein weiteres Stück doppelseitiges Klebeband mit einer Dicke von 0,7 mm an der Unterseite des Chips an und befestigen Sie den Chip an einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm. Nach der Montage stellen Sie den Chip über Nacht in eine Vakuumkammer. Bauen Sie nun den Chip für chemische und elektrische Felder zusammen. Befestigen Sie die gravierte PMMA-Platte für den Chip für chemische und elektrische Felder mit doppelseitigem Klebeband an einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm. Vor der Verwendung der Chips sterilisieren Sie diese durch Bestrahlung mit UV-Licht für 30 Minuten. Schließen Sie anschließend die Zuführungsöffnungen der Chips über Kunststoffschläuche und handfeste Muttern an 3-ml-Spritzen mit PBS an. Verbinden Sie auf die gleiche Weise die Auslässe mit einem Abfallschlauch. Drücken Sie den Spritzenkolben langsam herunter, um die mikrofluidischen Kanäle mit PBS zu befüllen. Bewegen Sie die Spritze hin und her, um Luftblasen zu entfernen, und stellen Sie die Chips danach über Nacht in einen Inkubator. Um die Chips für chemische und elektrische Felder einzurichten, füllen Sie die röhrenförmigen Muttern mit 3 %igem Agarose, um die Salzbrücken herzustellen. Setzen Sie dann die Silber-Silberchlorid-Elektroden in die röhrenförmigen Muttern ein. Kultivieren Sie Lungenkrebszellen CL1-5 in D-MEM, ergänzt mit 10 % FBS, bis sie eine Konfluenz von 90 % erreichen. Aspirieren Sie danach das Medium. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorerwärmtem PBS. Geben Sie 2 ml einer 0,5 %igen Trypsin-Pufferlösung auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm. Stellen Sie die Zellen erneut bei 37 °C
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt mikrofabrizierte Geräte vor, die mit fluidischen Komponenten integriert sind und eine in-vitro-Plattform für Zelluntersuchungen schaffen, die das in-vivo-Mikroumfeld eng nachahmt. Die Forschung konzentriert sich auf mikrofluidische Chips auf Basis von Polymethylmethacrylat, die entwickelt wurden, um zelluläre Reaktionen auf verschiedene Reize zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrofluidik
- Zellbiologie
- In-vitro-Studien
Hintergrund
- Mikrofabrizierte Vorrichtungen verbessern die Untersuchung zellulärer Umgebungen.
- Fluidische Komponenten ermöglichen eine präzise Steuerung der experimentellen Bedingungen.
- Das Verständnis zellulärer Reaktionen ist entscheidend für verschiedene biologische Anwendungen.
- Polymethylmethacrylat ist ein vielseitiges Material für mikrofluidische Anwendungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Plattform zur Untersuchung zellulärer Reaktionen in einer kontrollierten Umgebung.
- Nachahmung von in-vivo-Bedingungen mithilfe der Mikrofluidik-Technologie.
- Untersuchung der Wirkungen chemischer, elektrischer und Scherstress-relevanter Reize auf Zellen.
Verwendete Methoden
- Entwurf und Herstellung mikrofluidischer Chips unter Verwendung von Polymethylmethacrylat.
- Integration fluidischer Komponenten zur Verbesserung der experimentellen Kontrolle.
- Anwendung verschiedener Reize zur Bewertung zellulärer Reaktionen.
- In-vitro-Experimente zur Simulation von In-vivo-Bedingungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Entwicklung mikrofluidischer Chips für zelluläre Untersuchungen.
- Nachweis der Fähigkeit, Umweltbedingungen effektiv zu steuern.
- Beobachtung unterschiedlicher zellulärer Reaktionen auf verschiedene Reize.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung.
Schlussfolgerungen
- Die mikrofluidische Plattform ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des zellulären Verhaltens.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis zellulärer Reaktionen unter kontrollierten Bedingungen bei.
- Zukünftige Anwendungen könnten Arzneimitteltests und die Modellierung von Krankheiten umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mikrofluidische Plattformen, die eine präzise Steuerung chemischer, elektrischer und Scherstress-Reize ermöglichen, bieten der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung einen skalierbaren Ansatz, um die Zielvalidierung zu entrisiken, indem komplexe in-vivo-Mikroumgebungen nachgebildet werden. Diese auf PMMA basierenden Geräte erhöhen den experimentellen Durchsatz bei der Untersuchung zellulärer Reaktionen unter gleichzeitig auftretenden Reizen und unterstützen so ein mechanistisches Verständnis in der frühen Entdeckungsphase. Die Technologie hilft dabei, Ziele mit höherer Vorhersagegenauigkeit zu priorisieren, bevor Ressourcen in die Identifizierung von Leitstrukturen investiert werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung zellulärer Reaktionen auf chemische Gradienten, elektrische Felder und Scherkräfte, um die Beteiligung von Signalwegen an Krankheitsmechanismen aufzuklären.
- Operativer Wert: PMMA-Substrate ermöglichen eine kostengünstige und schnelle Herstellung mittels Laserablation und unterstützen so einen iterativen Designansatz bei der Überprüfung von Hypothesen.
- Predictiver Wert: Quantifiziert die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies und die Zellmigration unter definierten Reizen und liefert funktionelle Messgrößen zur Absicherung von Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt fünf Konzentrationsgradienten mit gleichzeitigen Scherkräften oder elektrischen Feldgradienten und ermöglicht so eine multiparametrische Untersuchung in einem einzigen Gerät.
- Operativer Wert: Verringert die Anzahl erforderlicher Experimentwiederholungen, indem mehrere Stimulationsbedingungen integriert werden, und verbessert die Effizienz von Assays bei der Untersuchung von Substanz- oder siRNA-Bibliotheken.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit standardmäßigen Mikroskopie- und Inkubationsabläufen, was die Einführung in Screening-Kaskaden erleichtert.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verwendet Lungenkrebszellen des Typs CL1-5 als krankheitsrelevantes Modell, um mikroumgebungsbedingte Phänotypen zu untersuchen.
- Mechanistische Ent风险minimierung: Isoliert die Beiträge chemischer, elektrischer und mechanischer Stimuli auf zelluläre Reaktionen und unterstützt so die Entwicklung von Kombinationstherapien.
- Präklinische Übereinstimmung: Ergebnisse wie Zellmigration und oxidativer Stress korrelieren mit Merkmalen, die für Metastasierung und Invasivität relevant sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die mikrofluidischen Chips fungieren als Plattform für Assays in der Entdeckungsphase, die die Zielvalidierung und das frühe Screening von Leitverbindungen verbindet, indem sie quantitative, stimuli-responsive zelluläre Phänotypen bereitstellen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung dazu, wie mikroumgebungsbedingte Signale das zelluläre Verhalten in Krebs- und anderen Krankheitsmodellen beeinflussen.
- Screening: Ermöglicht die parallele Untersuchung zellulärer Reaktionen entlang von chemischen Konzentrations- und physikalischen Stimulationsgradienten und erhöht so die Datendichte pro Experiment.
- Analytik: Erzeugt quantifizierbare Ergebnisse, einschließlich fluoreszenzbasierter ROS-Detektion und migrationsbezogener Zeitraffer-Metriken für einen objektiven Vergleich.
- Translationale Forschung: Verwendet eine metastatische Lungenkrebslinie, um mikroumgebungsbedingte Reaktionen mit krankheitsrelevanten Invasivitätsphänotypen zu verknüpfen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die auf PMMA basierende Konstruktion ermöglicht die Übertragung auf verschiedene Labore und Projekte, um eine konsistente Stimulation in Studien zur Mechanobiologie oder Pharmakologie sicherzustellen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem gezielte Anwendung einzelner oder gleichzeitig wirkender Stimuli ermöglicht wird, um die Beiträge einzelner Variablen zu isolieren.
- Operativer Wert: Standardisiert die Applikation von Stimuli durch reproduzierbare Gradientenerzeugung und minimiert so die Variabilität zwischen Wiederholungen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch multiparametrische Wirk- und Toxizitätsaussagen unter physiologisch relevanten Bedingungen.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen, indem Verbindungen identifiziert werden, die stimuliusspezifische zelluläre Reaktionen modulieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Mikrofluidik-Konstruktion, Laserablation von PMMA und dem Zusammenbau fluidischer Schnittstellen.
- Hängt vom Zugang zu einem CO2-Laserschreiber, UV-Sterilisation sowie Ausrüstung zur Befüllung von Fluidiksystemen wie Spritzen und Schläuchen ab.
- Erfordert die Standardisierung der Zellseeding-Dichte, der zeitlichen Abfolge der Stimulusanwendung und der Normalisierung der Messwerte über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg.
- Die Anpassung an andere Zelltypen kann eine Optimierung der Kanalabmessungen und Durchflussraten erfordern, um Scherspannung und Gradientenintegrität aufrechtzuerhalten.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Bildung von Blasen während der Befüllung und die Ablösung von Elektroden in elektrischen Feldaufbauten, wie im Protokoll beschrieben.
