Name: Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Erfahren Sie, wie Mikrofluidikchips aus Polymethylmethacrylat zelluläre Reaktionen auf chemische, elektrische und Schubspannungsreize untersuchen. Diese Plattform ermöglicht präzise in-vitro-Studien unter kontrollierten Bedingungen.

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Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie von Taiwan unter der Vertragsnummer unterstützt. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo), Nr. MOST 104-2112-M-030-002 (Y. S. Sun) und National Taiwan University Career Development Project (103R7888) (K. Y. Lo). Die Autoren danken auch dem Center for Emerging Material and Advanced Devices der National Taiwan University für die Nutzung des Zellkulturraums.

1. Chip-Design und Fertigung <ol><li> Zeichnen Muster abzutragenden auf PMMA - Substraten und doppelseitige Klebebänder mit kommerziellen Software - 24. <ol><li> Um die Auswirkungen von chemischen Konzentrationen und Scherspannungen studieren, ziehen einen &quot;Weihnachtsbaum&quot; Muster mit unterschiedlicher Breite an seinem Ende in jeder der fünf Kulturflächen (1A und 1B). </li><li> Um die Auswirkungen von chemischen Konzentrationen und elektrischen Feldern zu studieren, ziehen einen &quot;Weihnachtsbaum&quot; Muster mit zwei weiteren Fluidik - Kanäle für Salzbrücken (2A und 2B). </li></ol></li><li> Scribe ein individuelles Muster auf einer PMMA - Platte oder einem doppelseitigen Klebeband , indem die entsprechende Datei in den CO 2 -Laser scriber laden. <ol><li> Schalten Sie den Laser scriber, und überprüfen Sie die Verbindung mit dem Computer. Öffnen Sie das Muster zu abzutragenden die kommerzielle Software. </li><li> Legen Sie eine PMMA-Platte oder ein doppelseitiges Klebeband on oben auf der Bühne des scriber. Stellen Sie den Fokus des Lasers CO 2 , falls erforderlich , die Kalibrierung bar und die sichtbare He-Ne - Laser. </li><li> Legen Sie das Muster in die Anreißer für die Ablation auf der PMMA-Platte oder dem Band. </li><li> Pick-up die gemusterte Folie oder ein Band, entfernen Sie unerwünschte Stücke, und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffblasen. HINWEIS: Die Dicke der PMMA-Platte beträgt 1 mm, und die des doppelseitigen Klebebands beträgt 0,07 mm oder 0,22 mm. </li></ol></li></ol> 2. Chipmontage <ol><li> Mit Superkleber, befestigen Acryl-Adapter (Länge x Breite x Höhe = 10 mm x 10 mm x 5 mm, mit Schraubengewinde in der Mitte) an die oberste Schicht des Chips durch das Gewinde ausrichten und die Löcher auf der Oberseite -Die meisten Schicht. Diese Adapter dienen als Medium / Auslässe und Salzbrücke Anschlüsse. </li><li> Montieren Sie den Mikrofluidik-Chip in einer Laminar-Flow-Haube. </li><li> Montieren Sie den chemisch-Schubspannung Mikrofluidik-Chip (CSS-Chip). <ol><li> EINttach 3 Blätter beschrieben PMMA-Platten unter Verwendung von 2 Stück doppelseitiges Klebeband beschrieben. (1A und 1B). </li><li> Fügen Sie ein weiteres Stück der 0,07 mm dicken doppelseitigem Klebeband auf der Unterseite des Chips und befestigen Sie den Chip auf einen Durchmesser von 10 cm Petrischale. </li><li> Setzen Sie die Montage-Chip in der Vakuumkammer über Nacht. </li></ol></li><li> Um die chemisch-elektrischen Feldchip (CEF - Chip), bringen Sie die PMMA - Platte mit einem doppelseitigen Klebeband mit einer Dicke = 0,22 mm (2A und 2B) montieren. <ol><li> Bringen Sie die beschriebenen PMMA-Platte und doppelseitiges Klebeband auf einen Durchmesser von 10 cm Petrischale das gleiche Stück Klebeband. </li></ol></li><li> Lassen Sie den montierten Chip im Inneren der Kapuze und setzen Sie es für 30 Minuten zur Sterilisation mit UV. </li><li> Verbinden Sie die Eingänge zu zwei 3-ml-Spritzen über Kunststoffrohre und handfest Nüsse. Verbinden Sie den Ausgang zu einem Abfallrohr über einen Kunststoffschlauch und einem fingerfest Mutter. HINWEIS: Die AutoklavenAlle Rohre und Muttern bei 121 ° C für 15 min vor der Verwendung. </li><li> Langsam drücken Sie den Kolben der Spritze zu grundieren die fluidischen Kanäle mit PBS. Push Spritzen hin und her, um Blasen zu entfernen. </li><li> Setzen Sie die Chips in einem Inkubator über Nacht bei 37 ° C unter 5% CO 2. HINWEIS: Diese beiden Schritte zielen darauf ab, den Chip und entfernen Sie alle verbleibenden Blasen innerhalb des Chips zu waschen. </li><li> Nehmen Sie den Chip aus dem Inkubator. </li><li> Bereiten Agar Salzbrücken zur Erzeugung elektrischer Felder im CEF-Chip. <ol><li> Löse 3% niedrigschmelzender Agarose in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Puffer unter Verwendung einer Mikrowelle. </li><li> Injizieren Lösung-Phasen-Agarose in die Salzbrücke Kanal und legen Sie die Elektroden vor Lösung erstarrt. </li><li> Legen Sie Silber / Silberchlorid-Elektroden in die Rohrmuttern. </li></ol></li><li> Schließen Sie die Spritzen an die Spritzenpumpen und fließen kontinuierlich das Kulturmedium (Dulbecco modifiziertem eagler17; s medium, DMEM) in den Fluidkanal für 10 min bei einer Flussrate von 20 ul / min PBS zu ersetzen. </li></ol> 3. Zellpräparation und Versuchsaufbau HINWEIS: vorwärmen 1x PBS, Kulturmedium (DMEM plus FBS) und Trypsin in einem 37 ° C Wasserbad vor dem Gebrauch. <ol><li> Platte 2 x 10 5 Zellen Lungenkrebs CL1-5 25,26 in einer 10 cm Petrischale geliefert mit DMEM plus 10% fötalem Rinderserum (FBS). Inkubieren der Zellen in einem Inkubator unter 5% CO 2 bei 37 ° C , bis 90% Konfluenz. </li><li> Saugen Sie das Medium und waschen Sie einmal, um die Zellen mit vorgewärmten 1x PBS. 2 ml 0,05% Trypsin-Puffer zu den Zellen und warten, für 2 bis 3 min bei 37 ° C um die Zellen zu lösen. </li><li> Transfer der Zellen in ein 15 ml steriles Zentrifugenröhrchen und 6 ml Kulturmedium in das Röhrchen. vorsichtig umdrehen das Röhrchen zum Mischen und nehmen 5 ul der zellhaltigen Medium für die Zellzahl in einem hemocytomete Zählenr. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 5 min. Suspendieren 10 6 Zellen in 1 ml Kulturmedium und legen die Zelle enthaltenden Medium in einer 1 ml - Spritze. </li><li> die zellhaltigen Medium in den Mikrofluidik-Chip aus der Steckdose ziehen lassen und stellen Sie sicher, dass die Lösung alle durch die fünf Kulturkreisen verteilt. Inkubieren Sie den Chip im Inneren eines Inkubators unter 5% CO 2 bei 37 ° C für 2 Stunden. </li></ol> 4. Versuchsaufbau <ol><li> Nehmen Sie den Chip aus dem Inkubator und legen Sie es auf einer transparenten Indium-Zinn-Oxid (ITO) Glasheizung. HINWEIS: Die ITO-Glas mit einer Proportional-Integral-Differential- (PID) -Steuerung zur Aufrechterhaltung der Temperatur bei 37 ± 0,5 ° C über Rückkopplung von einem Thermokopplers eingespannt fest zwischen der ITO-Erhitzer und dem Chip verbunden ist. </li><li> Setzen Sie den Chip-Heizanordnung auf einem motorisierten XY Bühne eines umgekehrten Mikroskops zur Nachführung der Zellmigration oder einen festen XY Stufe derein invertiertes Fluoreszenzmikroskop für die Produktion von ROS gemessen wird. </li><li> Zur Erzeugung unterschiedlicher chemischer Konzentrationen füllen zwei Spritzen mit 5 ml von chemischen Lösungen von relativen Konzentrationen 0 und 1 (in Kulturmedium) gelöst, und die Pumpe sie in den Chip an gewünschten Strömungsraten: in der CSS-Chip, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml / min für 1 Stunde; in dem CEF-Chip, mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / min für die ersten 20 min und einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / h für eine weitere 120 min (Gesamtzeit = 2 h). </li><li> In der CEF-Chip, für die Verfolgung von Zellmigration, Programm der XY-Tisch des Mikroskops Fotos zu wiederholen, wobei über eine digitale einäugige Spiegelreflexkamera (DSLR) Kamera, bestimmte Sichtfelder (FOVs) innerhalb Kulturkreisen alle 15 min für 2 h. </li><li> Für die Produktion von ROS zu messen, verwenden Sie die fluoreszenzbasierte Indikator 2&#39;-7&#39;-dichlorodihydrofluoresce diacetat (2&#39;-7&#39;-DCFDA). <ol><li> Bereiten Sie die Lager von 2&#39;-7&#39;-DCFDA bei 10 mM in die Molekularbiologie diMethylsulfoxid (DMSO). Verdünnte DCFDA in DMEM nur ohne Serum (5 &amp; mgr; M in DMEM). Das Potential Deacetylase könnten die Hintergrundsignale zu erhöhen und die Signale in den Zellen zu verringern. </li><li> Nach 1 Stunde der Scherspannung Stimulus in dem CSS-Chip oder nach 2 h EF Stimulus in dem CEF-Chip, der Pumpe 2&#39;-7&#39;-DCFDA (5 &amp; mgr; M in DMEM) in den Chip mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / min für die ersten 20 min und einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / h für weitere 20 min. Zum Waschen, für 20 min DMEM in den Chip mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 &amp; mgr; l / h pumpen. </li><li> Nehmen Sie Fotos über eine Charge-Coupled Device (CCD) Kamera, bestimmter FOVs in Kulturkreisen für die Fluoreszenzintensitäten zu analysieren. </li></ol></li></ol> 5. Die Berechnungen der chemischen Konzentrationen, Scherspannungen und elektrische Felder <ol><li> Sowohl in der CSS-Chip und dem CEF-Chip, berechnen die chemischen Konzentrationen in den fünf Kulturkreisen. Beispielsweise durch H 2 O 2 von Konzentr Injizierenations 0 und 200 &amp; mgr; M von den zwei Einlässen, Konzentrationen von 0, 25, 100, 175, und 200 &amp; mgr; M erzeugt werden. HINWEIS: Unter der Annahme, dass alle Flüssigkeiten geteilter Strömung glatt und gleichmäßig um die Gabel sind die relativen Konzentrationen in den fünf Kulturbereichen 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 sind. </li><li> In der CSS - Chip berechnet man die Schubspannung (τ) in jedem der Bereiche Kultur mit <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq1.jpg" /> 27, wobei Q der Volumenstrom ist, η die Viskosität fluidischen ist, h die Höhe des Kanals und w die Breite des Kanals. HINWEIS: Q Einstellung = 0,3 ml / min in jedem Einlass (Q = 0,12 ml / min in jeder Kulturbereich), η = 0,0008 Pa · s für das Kulturmedium, h = 1 mm und w = 1 bis 4 mm, die Schubspannung errechnet sich aus 0,0048 Pa (4 mm breiten Bereich) bis 0,0192 Pa (1 mm breiten Bereich) zu reichen. </li><li> Imdie CEF - Chip, berechnen in jeder der Kulturbereiche der EF Stärke unter Verwendung von E = I / (&amp; Sgr; A eff) (Ohmsche Gesetz), wobei I der elektrische Strom über den Fluidkanal fließt, σ ist die elektrische Leitfähigkeit des Kulturmediums, und A eff ist die effektive Querschnittsfläche des Kanals. HINWEIS: Die Verwendung von σ = 1,38 Ω -1 m -1 für Kulturmedium und A eff = 0,22 mm 2 (Breite = 1 mm und Höhe = 0,22 mm) wird das EF Stärke E (mV / mm) = I berechnet werden ( A) × 3,3 × 10 6. <ol><li> Wie in 2D gezeigt, mit vier (8 + 35 + 8) Segmente und eine (5 + 35 + 5) -Segment das Ersatzschaltbild als fünf C-Abschnitt Schaltungen behandeln. Hinweis: Durch diese Parallelschaltung der Analyse zu Kirchhoffschen Spannungsgesetz und das Ohmsche Gesetz nach, Ströme über fünf Kultur fließen, sindwie, I 1 bis I 5 von unten nach oben, berechnet um 0,49 I (Bereich 1), 0,25 I (Bereich 2), 0,13 I (Bereich 3), 0,08 I (Bereich 4) und 0,05 I (Bereich sein 5) sind, wobei I die Gesamtgleichstrom (dC). Mit einer angelegten Gleich von 0,157 mA, EFs 254, 130, 67, 41 und 26 mV / mm sind in den fünf Kulturbereichen erzeugt. HINWEIS: Für eine vereinfachte elektrische Analyse des mikrofluidischen Netzwerk, alle fluidischen Segmente werden als Widerstände mit dem Widerstand als proportional zu ihrer Länge. </li></ol></li></ol> 6. Datenanalyse Hinweis: Die Datenanalyse ist die ImageJ-Software durchgeführt werden. <ol><li> Analysieren Sie die Produktion von ROS. <ol><li> Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf &quot;Datei&quot; → Öffnen ein Fluoreszenzbild zu laden analysiert werden. </li><li> Gehen Sie auf &quot;Bild&quot; → &quot;Typ&quot; → &quot;16-Bit&quot;, um die im ändernAlter zu einer Grauskala. </li><li> Zeichnen Sie ein Polygon um eine Zelle zu umschließen. Gehen Sie auf &quot;Analysieren&quot; → &quot;Messen&quot; die mittlere Fluoreszenzintensität der Zelle zu messen. </li><li> Wiederholen 6.1.3 Intensitäten von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten sammeln, und berechnen Sie die mittlere Intensität mit Standardabweichung vom Mittelwert (SEM). </li><li> Wiederholen Sie 6.1.1-6.1.4 für jeden experimentellen Zustand. </li></ol></li><li> Analysieren Zellmigration. <ol><li> Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf &quot;Datei&quot; → Öffnen eines Bildes zum Zeitpunkt = 0 genommen zu laden analysiert werden. </li><li> Zeichnen Sie ein Polygon um eine Zelle zu umschließen. Gehen Sie auf &quot;Analysieren&quot; → &quot;Messen&quot; , um das Zentrum der Masse der Zelle messen , wie (x 1, y 1). </li><li> Wiederholen 6.2.1- 6.2.2 den Massenschwerpunkt der gleichen Zelle zu messen , wie (x 2, y 2) von einem anderen Bild zur Zeit t = nehmen. </li><li> Berechnen Sie die Migrationsrate (in &amp; mgr; m / h)Diese Zelle als <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq2.jpg" /> . </li><li> Wiederholen Sie 6.2.1-6.2.4 zu Migrationsraten von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten, und berechnen Sie die mittlere Wanderungsgeschwindigkeit mit Standardfehler des Mittelwertes (SEM) sammeln. </li><li> Von 6.2.2 und 6.2.3, die Berechnung der Migration Gerichtetheit dieser Zelle als Kosinus θ oder <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/54397/54397eq3.jpg" /> , Wobei θ der Winkel zwischen dem Vektor der angelegten EF (von positiv zu negativ) und der Vektor vom Start bis zur Endposition der Zelle (Figur 2G). </li><li> Wiederholen 6.2.6 Migration Gerichtetheit von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten zu sammeln, und berechnen Sie die mittlere Migration Gerichtet mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM). </li><li> Berechnen Sie den mittleren Migrationsrate mit SEM und die mittlere Migration Gerichtet mit SEM für jede Versuchsbedingung. HINWEIS: Ein Gerichtetvon 1 zeigt an, dass alle Zellen in Richtung der Kathode wandern, und ein Wert von -1 zeigt an, dass alle Zellen in Richtung der Anode wandern. Die Gerichtetheit einer Gruppe von zufällig bewegenden Zellen nahe 0. </li></ol></li><li> Analysieren Zellenausrichtung. <ol><li> Führen Sie die ImageJ Software. Gehen Sie auf &quot;Datei&quot; → &quot;Öffnen&quot; ein Bild zu laden, werden analysiert. </li><li> Behandeln Sie die Zelle als eine Ellipse und ziehen Sie eine Linie, die lange Achse einer Zelle anzuzeigen. Gehen Sie auf &quot;Analysieren&quot; → &quot;Messen&quot; den Winkel messen β zwischen der Linie und der horizontalen EF - Richtung. </li><li> Wiederholen 6.3.2 bis β von mindestens 50 Zellen von drei unabhängigen Experimenten zu sammeln, und berechnen mittlere Kosinus β mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM). </li><li> Wiederholen Sie 6.3.1-6.3.3 für jeden experimentellen Zustand. HINWEIS: A cos β von +1 anzeigt , dass alle Zellen parallel zum angelegten EF auszurichten und einen 0 - Wert zeigt an, dass alle Zellen perpendicularl ausrichteny zum angelegten EF. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

PMMA-Basis-Chips werden unter Verwendung von Laserablation und Schreiben hergestellt, die sind billiger und einfacher Methoden im Vergleich zu PDMS-basierten Chips, die komplizierter Weich-Lithographie erfordern. Nach einem mikrofluidischen Chip entwerfen, können die Fertigung und Montage innerhalb von nur 5 Minuten durchgeführt werden. Es gibt einige wichtige Schritte, dass darauf zu achten, sollte das Experiment durchführen. Die erste ist die &quot;Montage&quot; -Ausgabe. Die Adapter sollten richtig an die oberste Sch...

In vivo - Zellen werden durch eine Vielzahl von Biomolekülen , einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM), Kohlehydraten, Lipiden und anderen Zellen umgeben. Sie funktionalisieren durch Mikro-Umweltreize wie Wechselwirkungen mit ECM und Antworten auf chemische Gradienten verschiedener Wachstumsfaktoren reagieren. Herkömmlicherweise werden in vitro - Zellstudien in Zellkulturschalen durchgeführt , wobei der Verbrauch von Zellen und Reagenzien groß ist und die Zellen wachsen in einem statischen (nicht zirkulierende) -Umgebung. Vor kurzem Mikro hergestellten integrierten Geräte mit fluidische Komponenten haben eine alternative Plattform für Zellstudien in kontrollierbarer Weise zur Verfügung gestellt. Solche Vorrichtungen sind in der Lage eine genaue Mikroumgebung von chemischen und physikalischen Stimuli zu schaffen, während der Verbrauch von Zellen und Reagenzien zu minimieren. Diese mikrofluidischen Chips von Glassubstraten, Siliciumwafern, Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymere, Polymethylmethacrylat (PMMA) Substraten hergestellt werden oder polyethyleneterephthalat (PET) Substrate 1-3. PDMS-basierte Geräte sind transparent, biokompatibel und für Gase durchlässig, so dass sie geeignet für die Langzeitzellkultur und Studien zu machen. PMMA und PET-Substrate sind billig und einfach zu verarbeiten sind Laserablation und Schreiben verwenden. Mikrofluidik-Vorrichtungen sollten die Zellen mit einer stabilen und steuerbaren Mikroumgebung bereitzustellen, wo Zellen ausgesetzt sind unterschiedliche chemische und physikalische Reize. Beispielsweise werden Mikrofluidik-Chips verwendet, die Chemotaxis von Zellen zu untersuchen. Statt der traditionellen Methoden , die Boyden - Kammer und Kapillare 4,5 Diese miniaturisierten Fluidikvorrichtungen präzise chemische Gradienten verwenden für 1,6,7 Zellen &#39;Verhalten zu studieren erzeugen kann. Ein anderes Beispiel ist, Zellen &#39;gerichtete Migration unter elektrischen Feldern (EFS), ein Phänomen namens electro zu studieren. Electrotactic Verhalten von Zellen berichtet 8, 9 Embryonalentwicklung zur Nervenregeneration verbunden zu sein,und Wund 10,11 heilen. Und viele Studien durchgeführt wurden 12,13 die electro verschiedener Zelltypen , einschließlich Krebszellen zu untersuchen, Lymphozyten 14,15, Leukämiezellen 11, und Stammzellen 16. Herkömmlicherweise werden Petrischalen und Deckgläser verwendet für electrotactic Kammern zu bauen EFs zu erzeugen 17. Solche einfachen Setups stellen Probleme mittlerer Verdunstung und ungenau EFs, aber sie können von mikrofluidischen Vorrichtungen eingeschlossen, gut definierte fluidische Kanäle 12,18,19 überwunden werden. Um systematisch zelluläre Reaktionen unter präzise steuerbare chemische und elektrische Reize hat, wäre es von großem Nutzen sein, um mikrofluidische Geräte entwickeln, die Zellen mit mehreren Stimuli zugleich bietet. Beispielsweise Li et al. berichteten 20 ein PDMS-basierte Mikrofluidik - Vorrichtung ein- oder koexistieren chemische Gradienten und EFs für die Erstellung. Kao et al. developed eine ähnliche Mikrofluidik - Chip 6 die Chemotaxis von Lungenkrebszellen durch EFs zu modulieren. Darüber hinaus ist der Durchsatz, Hou et al zu erhöhen. entwickelt und gefertigte Chip eine PMMA-basierten Multichannel-Dual-elektrischen Feld Zellen mit 8 verschiedenen kombinierten Reize zu bieten, wobei (2 EF Stärken x 4 chemischen Konzentrationen) 21. Um die gesamten erhöhen und die Schubspannung Reiz hinzufügen, entwickelten wir zwei PMMA-Basis mikrofluidischen Vorrichtungen zur Untersuchung von zellulären Reaktionen unter Einzel- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize. Berichtet von Lo et al. 22,23, diese Geräte enthalten fünf unabhängige Zellkultur Kanäle unterliegt einer ständigen fluidischen fließende, die in vivo - Kreislauf - System nachahmt. In dem ersten Chip (chemisch-Scherspannung Chip oder dem CSS-Chip), fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 sind in den Kulturbereichen erzeugt wird, und einer Scherspannungsgefälle ist produced innerhalb jedes der fünf Kulturbereichen. In dem zweiten Chip (der chemisch-elektrischen Feldes Chip oder dem CEF-Chip), durch einen einzigen Satz von Elektroden und zwei Spritzenpumpen verwendet wird, werden fünf EF Stärken neben fünf verschiedenen chemischen Konzentrationen innerhalb dieser Kulturbereichen erzeugt. Numerische Berechnungen und Simulationen sind besseres Design durchgeführt, und arbeiten diese Chips und Lungenkrebszellen innerhalb dieser Vorrichtungen kultiviert unterliegen Einfach- oder koexistierenden Stimuli für ihre Antworten in Bezug auf die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu beobachten, die Migrationsrate, und die Wanderungsrichtung. Diese Chips werden demonstriert werden zeitsparend mit hohem Durchsatz und zuverlässige Geräte für die Untersuchung, wie Zellen auf verschiedene Mikro-Umweltreize reagieren.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Zelle von der Schale lösen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>10 cm Zellkultur Petrischale</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Bright-Line&nbsp; Hämazytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td>Zellzählgeräte</td></tr><tr><td>PMMA</td><td>Kundenspezifische</td><td>kundenspezifische</td><td>Mikrofluidik-Chip-Adapter</td></tr><tr><td></td><td>Kundenspezifische</td><td>kundenspezifische</td><td>Mikrofluidik-Chips</td></tr><tr><td>0,07 / 0,22 mm doppelseitiges Klebeband&nbsp;</td><td>3M</td><td>8018/9088</td><td>Mikrofluidischer Chip</td></tr><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>Salzbrücke</td></tr><tr><td>2'-7'-Dichlordihydrofluoreszenzdiacetat</td><td>Sigma</td><td>D6883</td><td>Intrazelluläre ROS-Messung</td></tr><tr><td>Indiumzinnoxid (ITO)-Glas</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Heizung</td></tr><tr><td>Proportional-Integral-Derivate-Regler&nbsp;</td><td>JETEC Electronics Co.</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Temperaturregler</td></tr><tr><td>Thermokoppler</td><td>TECPEL</td><td>TPK-02A</td><td>Temperaturregler</td></tr><tr><td>CO2 Laserritzer</td><td>Laser Tools & Technics Corp.</td><td>ILS2</td><td>Mikrofluidische Chipherstellung</td></tr><tr><td>Spritzenpumpen</td><td>New Era</td><td>NE-300</td><td>Pumpen von Medien und Chemikalien in den Chip</td></tr><tr><td>Stromversorgung</td><td>Wichtige Wissenschaft</td><td>MP-300V</td><td>Versorgung mit Gleichstrom</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Überwachung der Zellmigration</td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>TS-100</td><td>Überwachung der Zellmigration und fluoreszierender Signale</td></tr><tr><td>DSLR-Kamera</td><td>Canon</td><td>60D</td><td>Aufnahme von Hellfeldbildern</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi1</td><td>Aufnehmen von fluoreszierenden Bildern&nbsp;</td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>3M Scotch</td><td>7004</td><td>Anbringen von Adaptern an PMMA-Substraten</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Entwicklung mikrofluidischer Chips</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Auflösen von DCFDA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Quantifizierung von Fluoreszenzintensitäten und Zellmigration</td></tr></tbody></table>

entwerfen mikrofluidiksysteme für ein studium zellulären reaktionen unter einzel- oder coexisting chemie / elektro / schubspannung stimuli

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Mikrofluidik-Vorrichtungen sind in der Lage eine präzise und steuerbare zelluläre Mikroumgebung von pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration und andere physikalische oder chemische Stimuli zu schaffen. Sie wurden durch die Bereitstellung in vivo wie Umgebung für in - vitro - Zellstudien verwendet. Vor allem, wie Zellen als Reaktion auf chemische Gradienten, elektrische Felder und Scherspannungen hat viele Interessen gezogen, da diese Phänomene sind wichtig bei der zellulären Eigenschaften und Funktionen zu verstehen. Diese mikrofluidischen Chips von Glassubstraten, Siliciumwafern, Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymere, Polymethylmethacrylat (PMMA) -Substraten oder Polyethylenterephthalat (PET) -Substraten hergestellt werden. Aus diesen Materialien sind PMMA-Substrate billig und leicht verarbeitet werden können Laserablation und Schreiben verwenden. Obwohl einige mikrofluidischen Vorrichtungen konstruiert und hergestellt mehrere zur Erzeugung koexistierenden chemische und elektrische Reize, keiner von ihnen wurde alseffizient genug experimentellen Wiederholungen bei der Reduzierung, insbesondere für Screening-Zwecke. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Konstruktion und Herstellung von zwei PMMA-Basis mikrofluidischen Chips für zelluläre Reaktionen zu untersuchen, bei der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Wanderung, die unter Ein- oder koexistieren chemisch / Elektro / Schubspannung Reize. Der erste Chip erzeugt fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8, und 1 in den Kulturbereichen zusammen mit einer Scherspannungsgefälle innerhalb jeder dieser Bereiche erzeugt. Der zweite Chip erzeugt die gleichen relativen Konzentrationen, aber mit fünf verschiedenen elektrischen Feldstärken innerhalb jeder Kulturbereich geschaffen. Diese Geräte bieten nicht nur Zellen mit einer präzisen, steuerbaren Mikroumgebung, sondern auch stark die experimentellen Durchsatz zu erhöhen.

Der Chemie-Scherspannung (CSS) Chip Der CSS - Chip besteht aus drei PMMA - Platten, die jeweils mit einer Dicke von 1 mm angebracht , miteinander über zwei doppelseitige Klebebänder, die jeweils mit einer Dicke von 0,07 mm (1A und 1B). Der &quot;Weihnachtsbaum&quot; Struktur erzeugt fünf relativen Konzentrationen von 0, 1/8, 1/2, 7/8 und 1 in den fünf Kulturkreisen. Durch die Ausbildung des Ku...

Mikrofabrizierte Bauelemente, die mit fluidischen Komponenten integriert sind, bieten eine in vitro Plattform für Zellstudien, die die in vivo Mikroumgebung nachahmen. Wir haben Mikrofluidik-Chips auf Polymethylmethacrylat-Basis entwickelt, um zelluläre Reaktionen unter einzelnen oder koexistierenden chemischen/elektrischen/scheren Stressreizen zu untersuchen.

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mikrofluidische Vorrichtungen zu entwerfen und herzustellen, um zu beobachten, wie Zellen auf Umweltreize reagieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Zellbiologie und der biomedizinischen Technik zu beantworten. Zum Beispiel, wie Zellen auf unterschiedliche Umweltreize reagieren, einschließlich Chemikalien, Scherkräften und elektrischen Feldern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Kanäle leicht hergestellt und zusammengebaut werden können. Außerdem können diese mikrofluidischen Vorrichtungen die Bedingungen in vivo mit hervorragenden Fähigkeiten nachbilden. Die Demonstration des Verfahrens wird Tzu-Yuan Chou, ein Student aus meinem Labor, und Hsien-San Hou, ein Postdoktorand aus dem Labor von Dr. Julian Chung, durchführen. Zunächst schalten Sie den Kohlenstoffdioxid-Laser-Gravierer ein und überprüfen die Verbindung zum Computer. Laden Sie dann ein vorab gezeichnetes Weihnachtsbaum-Muster, wie eines der hier gezeigten Muster, in den Gravierer. Danach platzieren Sie eine PMMA-Platte oder ein Stück doppelseitiges Klebeband auf der Oberseite des Gravierer-Objekttisches. Stellen Sie den Fokus des Kohlenstoffdioxid-Lasers mit Hilfe der Kalibrierleiste und des sichtbaren Helium-Neon-Lasers ein. Gravieren Sie anschließend das Muster in das Substrat. Sobald die Gravur abgeschlossen ist, nehmen Sie das strukturierte Substrat auf, entfernen Sie die unerwünschten Teile und reinigen Sie die Oberfläche mit einem Strom aus Stickstoff von verbleibenden Rückständen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Komponente des Chips. Bauen Sie den mikrofluidischen Chip für chemische Scherkräfte zusammen. Dazu verbinden Sie drei PMMA-Platten mit dem Muster für chemische Scherkräfte mithilfe von zwei Stücken graviertem doppelseitigem Klebeband. Verwenden Sie Sekundenkleber, um einen Acryl-Adapter mit Gewinde in der Mitte auf der obersten PMMA-Schicht des Chips anzubringen, indem Sie Gewinde und Löcher ausrichten. Diese Adapter dienen als Medien-Zuführungs- und -abflusshäfen sowie als Anschlüsse für Salzbrücken. Fügen Sie danach ein weiteres Stück doppelseitiges Klebeband mit einer Dicke von 0,7 mm an der Unterseite des Chips an und befestigen Sie den Chip an einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm. Nach der Montage stellen Sie den Chip über Nacht in eine Vakuumkammer. Bauen Sie nun den Chip für chemische und elektrische Felder zusammen. Befestigen Sie die gravierte PMMA-Platte für den Chip für chemische und elektrische Felder mit doppelseitigem Klebeband an einer Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm. Vor der Verwendung der Chips sterilisieren Sie diese durch Bestrahlung mit UV-Licht für 30 Minuten. Schließen Sie anschließend die Zuführungsöffnungen der Chips über Kunststoffschläuche und handfeste Muttern an 3-ml-Spritzen mit PBS an. Verbinden Sie auf die gleiche Weise die Auslässe mit einem Abfallschlauch. Drücken Sie den Spritzenkolben langsam herunter, um die mikrofluidischen Kanäle mit PBS zu befüllen. Bewegen Sie die Spritze hin und her, um Luftblasen zu entfernen, und stellen Sie die Chips danach über Nacht in einen Inkubator. Um die Chips für chemische und elektrische Felder einzurichten, füllen Sie die röhrenförmigen Muttern mit 3 %igem Agarose, um die Salzbrücken herzustellen. Setzen Sie dann die Silber-Silberchlorid-Elektroden in die röhrenförmigen Muttern ein. Kultivieren Sie Lungenkrebszellen CL1-5 in D-MEM, ergänzt mit 10 % FBS, bis sie eine Konfluenz von 90 % erreichen. Aspirieren Sie danach das Medium. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorerwärmtem PBS. Geben Sie 2 ml einer 0,5 %igen Trypsin-Pufferlösung auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm. Stellen Sie die Zellen erneut bei 37 °C

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Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung von mikrofluidischen Bauteilen, die Zelle zu erfassen und Kultur ermöglichen können. In diesem Ansatz gemusterten Mikrostrukturen wie Rillen in mikrofluidischen Kanälen werden verwendet, um Scherarmut Regionen, in denen Zellen andocken können erstellen.

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Wir beschreiben eine Methode, um unter adhärenten Zellen eine laminare Strömung Schubspannung in einem sterilen kontinuierlichen Kreislauf. Die Zellen "Haftung kann Morphologie durch die transparente Kammer untersucht werden, Proben aus der Schaltung für Metabolit-Analyse und-Zellen nach Scher-Belastung für zukünftige Experimente oder Kultur geerntet wurden.

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

Wir stellen eine einfache Methode zur mikrofluidischen Vorrichtungen, die nach vergleichbaren dynamischen Bedingungen, um mehrere verschiedene Stämme zu produzieren, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum oder weiche Lithographie.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

Wir zeigen eine Mikrofluidik-basierten Assay, um die Zeitskala für Zellen für den Transit durch eine Sequenz von Mikrometermaßstab Verengungen zu messen.

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Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

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Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein mikrofluidisches System herzustellen und zu betreiben, das Endothelzellen synchronisierter oszillatorischer Hyperglykämie und pulsatiler Scherspannung aussetzt. Dieser Ansatz bietet ein physiologisch relevantes In-vitro-Modell zur Untersuchung diabetischer Endotheldysfunktion. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative Messung von oxidativem Stress und den Antworten von Endothelzellen.

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