Name: Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogelen mittels CuAAC und mikrowellenunterstützter Polykondensation für Gewebeengineering. Diese Methode verbessert die Zelllebensfähigkeit in 3D-Kulturen und ermöglicht Anwendungen in der regenerativen Medizin.

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Autoren möchte Prof. Maurizio Masi für eine fruchtbare Diskussion und Fräulein Chiara Allegretti für Lektur danken. Autoren Forschung wird von Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573) unterstützt.

Anmerkung: Die verwendeten Chemikalien sind wie empfangen. Linear RGD gekauft wird , aber es kann durch Standard - Fmoc - Festphasen - Peptidsynthese 16,19 hergestellt werden. Lösungsmittel sind von analytischer Qualität. Die Dialyse erfordert die Verwendung von Membran mit einem M w cut-off gleich 3.500 Da. Die synthetisierten Verbindungen werden durch 1 H - NMR - Spektren wurden auf einem 400 MHz - Spektrometer unter Verwendung von Chloroform (CDCl 3) oder Deuteriumoxid (D 2 O) als Lösungsmittel, und die chemischen Verschiebungen sind angegeben als δ - Werte in ppm aufgezeichnet gekennzeichnet. Weiterhin sind Hydrogele unterworfen FT-IR-Analyse KBr Pellet-Technik und ihrer physikalischen Charakterisierung beinhaltet die Gelierung Studien untersucht unter Verwendung der invertierten Teströhrchen bei 37 ° C verwendet wird. 1. Synthese von 4-Azidobutanoyl Chloride 1 <ol><li> Man löst 500 mg 4-azidobutanoic Säure (3,90 mmol) in 10 ml Dichlormethan und 0,5 ml Dimethylformamid gegeben. </li><li> Die Lösung wird bei 0 ° C, Mit einem Eisbad. </li><li> Hinzufügen 505 ul Oxalylchlorid (5,85 mmol) zu 5 ml Dichlormethan gelöst und langsam tropfenweise zu dem Reaktionssystem hinzuzufügen, während gerührt wurde. </li><li> Nach 1 Stunde bei 0 ° C mit einem Eisbad, Rückkehr zur Raumtemperatur. </li><li> Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer. </li><li> Charakterisieren des erhaltenen Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, um die Probe in CDCl 3 16 aufzulösen. </li></ol> 2. Synthese von RGD-Azid-Derivat 2 <ol><li> Man löst 50 mg RGD (0,145 mmol) in 1 ml 1 M NaOH. </li><li> Man löst 24 mg 1 (0,16 mmol) in 2 ml Tetrahydrofuran gegeben. </li><li> Fügen Sie alle der RGD - Lösung zu Lösung 1 tropfenweise bei 0 ° C mit einem Eisbad. </li><li> Rückkehr auf Raumtemperatur und rühre über Nacht. </li><li> 1 ml 1 M HCl. </li><li> Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer. </li><li> Charakterisieren Sie die obtained Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16. </li></ol> 3. PAA Alkin Modifikation 3 <ol><li> Man löst 200 mg von 35% w / w PAA-Lösung (2,8 mmol) in 15 ml destilliertem Wasser. </li><li> Hinzufügen 15,4 mg Propargylamin-hydrochlorid (0,20 mmol). </li><li> Man löst 42,8 mg von 1-Hydroxybenzotriazol-hydrat (HOBt, 0,28 mmol) in 14 ml eines 1: 1 v / v Acetonitril: destilliertes Wasser-Lösung durch Erhitzen auf 50 ° C. </li><li> Fügen alle der HOBt-Lösung PAA-Lösung bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen, 53,6 mg Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid (EDC, 0,28 mmol) zu dem Reaktionsgemisch. </li><li> Verwenden Sie 1 M HCl, um den pH-Wert auf 5,5 und rührt das Reaktionssystem über Nacht bei Raumtemperatur einzustellen. </li><li> Dialysieren der Lösung. Man löst 11,2 g Natriumchlorid in 2 l destilliertem Wasser und füge dann 0,2 ml 37% w / w HCl. Dialysieren der Lösung mit einer Membran mit einem M w cut-off von 3,5 kDa verwendet wird . </li><li> Perform Dialyse für drei Tage. Ändern, um die Dialyselösung täglich mit 2 l frisch destilliertem Wasser hergestellt, das 0,2 ml 37% w / w HCl. </li><li> Bewahren Sie die endgültige Lösung bei -80 ° C. Lyophilisieren es in einem Lyophilisator nach Herstellerprotokollen. </li><li> Charakterisierung des funktionalisierten Polymers durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16. </li></ol> 4. Synthese von PAA-RGD Polymer 4 <ol><li> Man löst 78 mg des modifizierten PAA Alkin 3 (1,083 mmol) in 10 ml destilliertem Wasser. </li><li> Man löst 25 mg des RGD Azid 2 Derivat (0,0722 mmol) in 5 ml Tetrahydrofuran gegeben. </li><li> Fügen alle der RGD Lösung der Polymerlösung. </li><li> Hinzufügen 2,2 mg Kupferiodid (0,0116 mmol) und 2,2 mg Natriumascorbat (0,0111 mmol). </li><li> Rückfluß der resultierenden Mischung über Nacht bei 60 ° C unter Rühren. </li><li> Das Gemisch wird auf 25 ° C. </li><li> Dialyze die Lösung. Man löst 11,2 g Natriumchlorid in 2 l destilliertem Wasser und füge dann 0,2 ml 37% w / w HCl. Dialysieren der Lösung mit einer Membran mit einem M w cut-off von 3,5 kDa verwendet wird . </li><li> Führen Sie die Dialyse für drei Tage. Ändern, um die Dialyselösung täglich mit 2 l frisch destilliertem Wasser hergestellt, das 0,2 ml 37% w / w HCl. </li><li> Bewahren Sie die endgültige Lösung bei -80 ° C. Lyophilisieren es in einem Lyophilisator nach Herstellerprotokollen. </li><li> Charakterisieren des erhaltenen Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16. </li></ol> 5. RGD-funktionalisierten Hydrogel-Synthese <ol><li> Bereiten Sie die PBS. Man löst 645 mg PBS Salz in 50 ml destilliertem Wasser. </li><li> Mischung 40 mg Carbomer und 10 mg funktionalisiertes PAA 4 in 9 ml PBS (Schritt 5.1), bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Auflösung (30 min). </li><li> In 400 mg PEG zur Lösung und halten für 45 min gerührt wurde. </li><li> Halten Sie das Rühren und lassen Sie das System für 30 Minuten absetzen. </li><li> Verwenden 1 N NaOH pH auf 7,4 einzustellen. </li><li> Zu 5 ml der erhaltenen Mischung werden 25 mg Agarose-Pulver. </li><li> Bestrahlen, das System mit Mikrowellenstrahlung bei 500 W bis zum Kochen, für eine Zeit, in der Regel zwischen 30 sec und 1 min, und elektromagnetisch erhitzen auf 80 ° C. </li><li> Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur ausgesetzt, bis die Temperatur auf 50 ° C ab, und mit 5 ml PBS (Schritt 5.1), um eine Lösung mit einer 1: 1 zu erhalten Volumenverhältnis. </li><li> Bereiten Sie 12 Multi-Well-Platte mit Stahlzylinder mit einem Durchmesser von 1,1 cm. </li><li> Nehmen Sie 500 ul Aliquots aus der Lösung und legen Sie sie auf jede Stahlzylinder. </li><li> Lassen Sie für 45 Minuten bis zur vollständigen Gelieren des Systems in Ruhe. </li><li> Entfernen Sie die Zylinder ein Edelstahl-Pinzette, um die Hydrogele erhalten. </li></ol> 6. Laden von Therapeutic Tool (Drug oder Zellen) <ol><li> Wiederholen Sie steps 5,1-5,7. </li><li> Wenn die Mischung (die bereits im Sol-Zustand) 37 ° C erreicht, werden 5 ml der Lösung die gewünschte Arzneimittellösung oder Zellkultur enthält, um ein Endsystem zu einem 1: 1 zu erhalten Volumenverhältnis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,9-5,12 polymere Netzwerke mit Bioverbindungen physikalisch innerhalb des Gels eingeschlossen zu erhalten. </li></ol> 7. Hydrogels Charakterisierung <ol><li> FT-IR-Analyse <ol><li> Nach der Gelbildung, während 24 Stunden in 2,5 ml destilliertem Wasser eine der synthetisierte Hydrogele einweichen. </li><li> Entfernen Sie die wässrigen Medien , wo Hydrogel untergetaucht ist und gefrier trocken mit flüssigem N 2. </li><li> Laminat mit der Hydrogel-Probe gemäß KBr Pellet-Technik. <ol><li> Fügen Sie einen Spachtel voller KBr in einem Achatmörser. Nehmen Sie eine kleine Menge an Hydrogel-Probe (etwa 0,1 bis 2% des KBr Menge oder gerade genug, um die Spitze der Spachtel zu bedecken) und vermischen sich mit dem KBr-Pulver. </li><li> Schleifen Sie die Mischung, bis das Pulver fein und homogen. &lt;/ Li&gt; <li> Verwenden Sie das KBr-Pellet-Kit das IR-Pellet zu bilden. Drücken Sie die Pulver eine manuelle Laborpresse: 3 min bei Druckkapazität in Höhe von 5 Tonnen und dann 3 min bei Druckkapazität von 10 Tonnen. </li><li> Lassen Sie den Druck der endgültige Pellet als homogen und transparent im Aussehen zu erhalten. Legen Sie die Pellets in den IR - Probenhalter und führen Sie das Spektrum 16. </li></ol></li></ol></li><li> Gelieren Studies <ol><li> Füllen 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 &amp; mgr; l PBS und auf 37 ° C äquilibrieren. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l der hergestellten Polymerlösung, um das Hydrogel bilden, und Inkubieren bei 37 ° C. </li><li> Drehen Sie das Röhrchen und beobachten, ob das Gel bei 1 fließt, 2, 5, 10 und 20 min. Aufzeichnen der Zeit, zu der das Gel fließt nicht als die Gelierzeit. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an und haben keine Vergütung für die Vorbereitung dieses Manuskripts erhalten.

Die PAA-Postpolymerisationsmodifikation mit Alkinanteilen und die RGD-Funktionalisierung mit der Azidgruppe garantieren die Bildung einer stabilen Bindung zwischen dem Polymer und dem Peptid. In der Tat dient Triazol als starre Verbindungseinheit zwischen den Kohlenstoffatomen, die an die 1,4 Positionen des 1,2,3-Triazol-Rings gebunden ist, und es kann weder hydrolytisch noch auf andere Weise gespalten werden. Darüber hinaus ist Triazol im Gegensatz zu anderen zyklischen Strukturen wie Benzolenoiden und verwandten aromat...

Hydrogele sind dreidimensionale Netzwerke durch hydrophile vernetzte Polymere gebildet werden, die natürlich oder synthetisch sind, und die durch eine ausgeprägte dreidimensionale Struktur aus. Diese Geräte sind zunehmend attraktiv in den biomedizinischen Bereichen Medikamentenabgabe, Tissue Engineering, Genträger und intelligente Sensoren 1,2. Tatsächlich ihres hohen Wassergehaltes sowie ihre rheologischen und mechanischen Eigenschaften machen sie geeignete Kandidaten Weichgewebe Mikroumgebungen zu imitieren und sie wirksame Werkzeuge für wasserlösliche Zytokin oder Wachstumsfaktor-Lieferung. Einer der vielversprechendsten ist die Verwendung als injizierbare Biomaterial Zellen und bioaktiven Verbindungen trägt. Hydrogele können das Überleben von Zellen und Kontrollstammzell Schicksal durch Halten und präzise Abgabe Stammzellregulationssignale in einer physiologisch relevanten Art und Weise verbessern, wie 3,4 in in vitro und in in vivo Experimenten beobachtet. Der führende Vorteil hierbei ist die Möglichkeit,injizierten Zellen innerhalb der Zone der Impfung (in situ), Minimierung der Menge an Zellen zu erhalten, die das Gebiet und Extravasate in den Kreis Strom verlässt, über den ganzen Körper der Migration und dem angestrebten Ziel 5 zu verlieren. Die Stabilität der dreidimensionalen Netzwerke Hydrogels ist aufgrund seiner Vernetzungsstellen, gebildet durch kovalente Bindungen oder Kohäsionskräfte zwischen den Polymerketten 6. In diesem Rahmen angewendet orthogonal selektive Chemie an Polymerketten ist ein vielseitiges Werkzeug in der Lage 7 Hydrogel Leistungen zu verbessern. Tatsächlich könnte die Modifikation von Polymeren mit geeigneten chemischen Gruppen helfen, geeignete chemische, physikalische und mechanische Eigenschaften bereitzustellen Lebensfähigkeit der Zellen und deren Verwendung in der Gewebebildung zu verbessern. In gleicher Weise zu den Techniken Zellen oder Wachstumsfaktoren innerhalb der Gelmatrix, die Verwendung des RGD-Peptid ermöglicht Verbesserungen in der Zelladhäsion und das Überleben zu laden. RGD ist ein Tripeptid zusammengesetztvon Arginin, Glycin und Asparaginsäure, die bei weitem das wirksamste und oft eingesetzt Tripeptid aufgrund seiner Fähigkeit , mehr als eine Zelladhäsion - Rezeptor und seine biologische Wirkung auf die Zellverankerung, Verhalten und Überleben 8,9 zu adressieren ist. In dieser Arbeit wird die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele mit dem Ziel der Netzwerke durch ausreichende biochemische Eigenschaften für eine gastliche Zelle Mikro gekennzeichnet Gestaltung studiert. Die Verwendung von Mikrowellenstrahlung in Hydrogel - Synthese bietet ein einfaches Verfahren , um Nebenreaktionen zu minimieren und höhere Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten in kürzerer Zeit im Vergleich zu den herkömmlichen thermischen Verfahren 10 erhalten. Dieses Verfahren erfordert keine Reinigungsstufen und Ausbeuten sterile Hydrogele aufgrund der Wechselwirkungen der Polymere und der Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels in dem Reaktionssystem 11. Daher gewährleistet es einen hohen Prozentsatz von RGD gebunden an das polymere Netzwerk, da kein modkationen werden den Polymer chemischen Gruppen erforderlich Gelbildung beteiligt. Carboxygruppen, von PAA und Carbomer, und Hydroxylgruppen von PEG und Agarose, führen zu dem Hydrogel dreidimensionale Struktur durch eine Polykondensationsreaktion. Die genannten Polymere werden für die Synthese von Hydrogelen in die Rückenmarksverletzung Reparaturbehandlungen 12 verwendet. Diese Geräte, wie in den vorangegangenen berichtet arbeitet 13,14, zeigen eine hohe Biokompatibilität sowie mechanischen und physikalisch - chemische Eigenschaften, die denen von vielen lebenden Geweben und in thixotropen Natur ähneln. Außerdem bleiben sie in situ lokalisiert in der Zone der Injektion. In dieser Arbeit PAA Carboxylgruppen mit einem Alkin - Einheit (1) modifiziert und eine RGD-Azid - Verbindung synthetisiert wird , die Reaktivität des Tripeptids Endgruppe NH 2 mit einer vorbereiteten chemische Verbindung mit der Struktur zu nutzen (CH 2) n - N 3 (&lt;strong&gt; Abbildung 2). Anschließend reagiert das modifizierte PAA mit dem RGD-Azid - Derivat durch CuAAC Klick - Reaktion 15-17 (Abbildung 3). Die Verwendung eines Kupfer (I) -Katalysator führt zu wesentlichen Verbesserungen in sowohl die Reaktionsgeschwindigkeit und die Regioselektivität. Die CuAAC Reaktion wird in der organischen Synthese und in der Polymerwissenschaft weit verbreitet. Es verbindet einen hohen Wirkungsgrad und eine hohe Toleranz gegenüber den funktionellen Gruppen, und es ist unabhängig von der Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Eine hohe Selektivität, eine schnelle Reaktionszeit und eine einfache Reinigungsverfahren ermöglichen die Gewinnung von Sternpolymeren, Blockcopolymere oder Ketten gewünschten Einheiten 18 Pfropfen. Dieser Klick-Strategie ermöglicht es, Polymere nach der Polymerisation zu modifizieren, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften nach der endgültigen biochemischen Anwendung anpassen. Die CuAAC experimentellen Bedingungen sind leicht reproduzierbar (die Reaktion ist unempfindlich gegen Wasser, während Kupfer Oxidation minimal auftreten kann), und die Art dergebildet Triazol sorgt für Stabilität des Produkts. Die Verwendung von Kupfermetall kann ein kritischer Punkt, aufgrund seiner potentiellen toxischen Wirkung gegenüber Zellen und in der biologischen Mikroumgebung in Betracht gezogen werden, aber der Dialyse wird als Reinigungsverfahren verwendet, um die vollständige Entfernung von katalytischen Rückständen ermöglichen. Schließlich PAA modifizierte RGD in Hydrogel - Synthese (4) und die physikalisch - chemischen Eigenschaften der resultierenden Netzwerken verwendet wird untersucht, um die potentielle Funktionalität dieser Systeme als Zellen oder Drogen Träger zu überprüfen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> Abbildung 1: PAA modifizierte Alkin Synthese ein Schema PAA Funktionalisierung mit Alkin - Gruppe;. &quot;n&quot; gibt die Monomere mit Carboxylgruppe mit Propargylamin reagieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um zu sehen</a>eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> Abbildung 2:.. RGD-Azid - Synthese Die Synthese von RGD-Azid - Derivat <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> Abbildung 3: Klicken Sie auf Reaktionsschema der Klick - Reaktion zwischen RGD-Azid - Derivat und Alkin-PAA.. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> Abbildung 4: Hydrogele synthesis. RGD funktionalisierten Hydrogel - Syntheseverfahren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Mittelwert der Poly(acrylsäure)-Lösung Mw ~100.000, 35 Gew.-% in H2</td><td>O Sigma Aldrich</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol) 2.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Carbomeer 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Invitrogen Corp.</td><td>16500-500</td><td>UltraPure Agarose</td></tr><tr><td>RGD Peptid</td><td>abcam</td><td>ab142698</td><td></td></tr><tr><td>4-Azidobutansäure</td><td>Aurum Pharmatech</td><td>Z-2421</td><td>&nbsp; CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>Oxalylchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>Propargylaminhydrochlorid 95%Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>Kupfer(I)-iodid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>Natriumascorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Dialysemembran</td><td>Spectrum Laboratories, Inc.</td><td>132725</td><td>Spectra/Por 3 Dialysemembran&nbsp; Standard RC Tubing MWCO: 3,5 kD</td></tr></tbody></table>

die synthese von rgd-funktionalisierten hydrogele als werkzeug für therapeutische anwendungen

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

Die Verwendung von Polymeren als Biomaterialien hat bei therapeutischen Anwendungen erhebliche Vorteile gebracht. Insbesondere die Möglichkeit, Polymerketten mit Verbindungen zu modifizieren und zu funktionalisieren, die in der Lage sind, die Biokompatibilität, die mechanischen Eigenschaften oder die Zellviabilität zu verbessern, ermöglicht das Design neuartiger Materialien, um neuen Herausforderungen im biomedizinischen Bereich gerecht zu werden. Mit den Polymerfunktionalisierungsstrategien ist die Klickchemie ein leistungsstarkes Werkzeug, um die Zellkompatibilität und die Wirkstoffabgabeeigenschaften von polymeren Bauelementen zu verbessern. In ähnlicher Weise führt die grundlegende Notwendigkeit der Biomedizin, sterile Werkzeuge zu verwenden, um mögliche nachteilige Nebenwirkungen wie Toxizität oder Kontamination der biologischen Umgebung zu vermeiden, zu einem zunehmenden Interesse an der mikrowellengestützten Strategie.
Die Kombination aus Click-Chemie und der mikrowellenunterstützten Methode eignet sich zur Herstellung biokompatibler Hydrogele mit gewünschten Funktionalitäten und verbesserter Leistung in biomedizinischen Anwendungen. Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogelen. RGD (Arginylglycylasparaginsäure) ist ein Tripeptid, das Zelladhäsionsproteine nachahmen und an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden kann, wodurch eine gastfreundliche Mikroumgebung für Zellen innerhalb des 3D-Polymernetzwerks der Hydrogele geschaffen wird. Die RGD-Funktionalisierung erfolgt durch Huisgen 1,3-dipolare Cycloaddition. Einige PAA-Carboxylgruppen sind mit einem Alkinanteil modifiziert, während RGD mit Azidosäure als terminalem Rest der Peptidsequenz funktionalisiert ist. Schließlich werden beide Produkte in einer kupferkatalysierten Klickreaktion eingesetzt, um das Peptid dauerhaft an PAA zu binden. Dieses modifizierte Polymer wird zusammen mit Carbomer, Agarose und Polyethylenglykol (PEG) verwendet, um eine Hydrogelmatrix zu synthetisieren. Die 3D-Struktur entsteht durch eine Veresterungsreaktion mit Carboxylgruppen aus PAA und Carbomer- und Hydroxylgruppen aus Agarose und PEG durch mikrowellenunterstützte Polykondensation. Die Effizienz des Gelierungsmechanismus sorgt für einen hohen Grad an RGD-Funktionalisierung. Darüber hinaus ist das Verfahren, therapeutische Wirkstoffe oder biologische Werkzeuge innerhalb dieses funktionalisierten Netzwerks zu laden, sehr einfach und reproduzierbar.

Die PAA Alkin - Derivat effizient aus Polyacrylsäure und Propargylamin synthetisiert, wie in Abbildung 1 gezeigt , wobei n die Monomere , deren Carboxyl - Gruppen reagieren mit dem Amin - Etiketten. Die Identität des Produkts wird durch 1 H-NMR - Spektroskopie bestätigt. Abbildung 5 Die 1 H-NMR - Spektrum von PAA zeigt mit Dreifachbindung modifiziert. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload...

Wir präsentieren ein Protokoll für die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogelen als Bauelemente für die Zell- und Wirkstoffabgabe. Das Verfahren beinhaltet eine kupferkatalysierte Alkinazid-Cycloaddition (CuAAC) zwischen alkinmodifizierter Polyacrylsäure (PAA) und einem RGD-Azid-Derivat. Die Hydrogele werden mittels mikrowellenunterstützter Polykondensation gebildet und ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften untersucht.

Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, Hydrogele für Anwendungen im Bereich des Gewebegeneration sehr einfach zu synthetisieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Gewebegeneration zu beantworten, beispielsweise die Möglichkeit, eine hohe Zellvitalität in dreidimensionalen Zellkultursystemen aufrechtzuerhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir durch eine schnelle Reaktion die Hydrogelsysteme leicht modifizieren können, um ihre Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der Zellviabilität zu verbessern.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Rückenmarksverletzungen, da die in das Gerüst eingelagerten Zellen das beschädigte Gewebe regenerieren können. Diese Methode kann tiefgreifende Einblicke in Zelltherapien als regenerative Medizin und deren Bedeutung für zahlreiche Methoden liefern. Sie kann außerdem in mehreren anderen Systemen wie Knochen, Herz und Knorpel angewendet werden.Zur Synthese des RGD-Azid-Derivats lösen Sie 50 Milligramm RGD in einem Milliliter einmolarer Natriumhydroxidlösung. Lösen Sie anschließend 24 Milligramm 4-Azidobutanoylchlorid in zwei Milliliter Tetrahydrofuran. Geben Sie dann unter Rühren die gesamte RGD-Lösung tropfenweise zur 4-Azidobutanoylchlorid-Lösung bei null Grad Celsius hinzu.Zur Raumtemperatur zurückkehren und über Nacht umrühren. Einen Milliliter einmolarer HCl hinzufügen. Entfernen Sie das Lösungsmittel unter vermindertem Druck mittels Rotationsverdampfer.Charakterisieren Sie das erhaltenen Produkt mittels Protonen-Kernspinresonanzspektroskopie, wobei die Probe in Deuteriumoxid oder D2O gel&ouml;st wird. Zum Durchf&uuml;hren der PAA-Alkin-Modifikation l&ouml;sen Sie 200 Milligramm einer 35 Gew.-%igen PAA-L&ouml;sung in 15 Milliliter destilliertem Wasser. Geben Sie 15,4 Milligramm Propargylaminhydrochlorid hinzu.Danach lösen Sie 42,8 Milligramm HOBt in 14 Milliliter einer Acetonitril-Destilliertwasser-Lösung im Verhältnis 1:1 durch Erhitzen auf 50 Grad Celsius auf. Geben Sie die gesamte HOBt-Lösung bei Raumtemperatur zur PAA-Lösung hinzu. Fügen Sie anschließend 53,6 Milligramm EDC dem Reaktionsgemisch hinzu.Verwenden Sie eine einmolare HCl-Lösung, um den pH-Wert auf 5,5 einzustellen, und rühren Sie das Reaktionssystem über Nacht bei Raumtemperatur. Lösen Sie anschließend 11,2 Gramm Natriumchlorid in zwei Litern destilliertem Wasser. Fügen Sie danach 200 Mikroliter einer 37 %igen (Gewicht pro Gewicht) HCl-Lösung hinzu.Dialysieren Sie die Lösung unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 3,5 Kilodalton. Führen Sie die Dialyse über drei Tage durch. Wechseln Sie die Dialyse-Lösung täglich mit zwei Litern frisch zubereitetem destilliertem Wasser, das 200 Mikroliter 37 % (Gewicht pro Gewicht) HCl enthält.Lagern Sie die endgültige Lösung bei minus 80 Grad Celsius. Charakterisieren Sie das funktionalisierte Polymer durch Protonen-Kernspinresonanzspektroskopie, indem Sie die Probe in D2O lösen. Um das PAA-RGD-Polymer zu synthetisieren, lösen Sie 78 Milligramm alkyn-modifiziertes PAA in 10 Milliliter destilliertem Wasser.Lösen Sie dann 25 Milligramm des RGD-Azid-Derivats in fünf Millilitern Tetrahydrofuran auf. Geben Sie die gesamte RGD-Lösung zu der polymeren Lösung hinzu. Fügen Sie anschließend 2,2 Milligramm Kupferiodid hinzu.Und 2,2 Milligramm Natriumascorbat. Den resultierenden Ansatz über Nacht bei 60 Grad Celsius unter Rühren refluktieren. Die Mischung auf 25 Grad Celsius abkühlen lassen.Um die Lösung zu dialysieren, lösen Sie 11,2 Gramm Natriumchlorid in zwei Litern destilliertem Wasser und geben 200 Mikroliter 37 Gewichtsprozent HCl hinzu. Führen Sie die Dialyse drei Tage lang durch. Wechseln Sie die Dialyselösung täglich mit zwei Litern frisch hergestelltem destilliertem Wasser, das 200 Mikroliter 37 Gewichtsprozent HCl enthält.Anschließend die endgültige Lösung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Das resultierende PAA-RGD-Polymer charakterisieren und lagern, wie bereits für seine Bestandteile durchgeführt. Vierzig Milligramm Carbomer und zehn Milligramm des funktionalisierten PAA in neun Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur vermischen, bis eine vollständige Auflösung erfolgt ist.Fügen Sie 400 Milligramm PEG zur Lösung hinzu und rühren Sie 45 Minuten lang weiter. Stellen Sie das Rühren ein und lassen Sie das System 30 Minuten lang absetzen. Anschließend verwenden Sie einmolariges Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.Zu fünf Milliliter der erhaltenen Mischung 25 Milligramm Agarosepulver hinzufügen. Das System mit Mikrowellenstrahlung bei 500 Watt für 30 Sekunden bis eine Minute bestrahlen, bis die Mischung kocht. Anschließend die Lösung elektromagnetisch auf 80 Grad Celsius erhitzen.Lassen Sie das Gemisch bei Raumtemperatur, bis seine Temperatur auf 50 Grad Celsius abgesunken ist. Geben Sie anschließend fünf Milliliter PBS hinzu, um eine Lösung im volumetrischen Verhältnis eins zu eins zu erhalten. Bereiten Sie eine 12-Multiwell-Platte vor, die Stahlzylinder mit einem Durchmesser von 1,1 Zentimetern enthält.Entnehmen Sie 500 Mikroliter-Aliquots aus der Lösung und geben Sie diese in jeden Stahlzylinder. Lassen Sie die Platte 45 Minuten ruhen, bis die vollständige Gelbildung des Systems erfolgt ist. Entfernen Sie die Zylinder mit einer Edelstahl-Pinzette, um die Hydrogels zu erhalten.Siehe Textprotokoll zur Charakterisierung der physikochemischen Eigenschaften der RGD-funktionalisierten Hydrogelen. Carbomer 974P, PAA-RGD und PEG gehen zusammen mit Agarose nach Mikrowellenbestrahlung eine statistische zufällige Polykondensation ein. In PEG und Agarose enthaltene Hydroxylgruppen reagieren mit in Carbomer 947P und PAA-RGD vorhandenen Carboxylgruppen, um ACPEG-RGD-Hydrogelen zu bilden.Unter Berücksichtigung der rheologischen Eigenschaften erwies sich das Speichermodul als etwa eine Größenordnung höher als das Verlustmodul, was auf ein elastisches und nicht viskoses Material hinweist. Darüber hinaus ist deutlich erkennbar, dass das Verhalten des Hydrogels bei niedrigen Dehnungswerten vom Elastizitätsmodul dominiert wird. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt die Morphologie einer RGD-funktionalisierten Hydrogelprobe sowie eines Hydrogels ohne Funktionalisierung.Beide Hydrogele zeigten, dass sie eine stark verwobene Struktur aus miteinander verbundenen Poren aufweisen, wobei einige größere Poren kleinere Poren sowie faserförmige Netzwerke an den Porenwänden enthalten. Die ähnlichen Eigenschaften deuten darauf hin, dass das Vorhandensein von RGD das Polymer-Netzwerk nicht verändert. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik der Forschung im Bereich des Gewebeingenieurwesens den Weg, um die Stabilität dieser Zellkultursysteme bei mehreren weiteren Erkrankungen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hydrogels funktionalisiert, um ihre Fähigkeit zu verbessern, lebensfähige Stammzellen zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Dieses Video wird eine schnelle, effiziente Methode, um Poly (Ethylenglycol) Methacrylat veranschaulichen, so dass Kettenpolymerisationen und Hydrogel-Synthese. Es wird gezeigt, wie Methacrylamids Funktionalitäten ähnlich vorstellen in Peptide, Detail gemeinsamen analytischen Methoden zur Funktionalisierung Effizienz zu bewerten, bieten Anregungen zur Problembehebung und erweiterte Modifikationen und zeigen typische Hydrogel Charakterisierungstechniken.

Mikrowellen-unterstützte Funktionalisierung von Poly (Ethylenglycol) und On-Harz Peptide zur Verwendung in Kettenpolymerisationen und Hydrogelierung

Wir beschreiben einen sequentiellen Prozess zur lichtvermittelten Bildung und anschließenden biochemischen Strukturierung von synthetischen Hydrogelmatrizen für dreidimensionale Zellkulturanwendungen. Die Konstruktion und Modifikation von Hydrogelen mit zytokompatibler Photoclick-Chemie wird demonstriert. Darüber hinaus werden einfache Techniken zur Quantifizierung und Beobachtung von Mustern und zur Bestimmung der Zellviabilität innerhalb dieser Hydrogele vorgestellt.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Protokolle werden für die Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele basierend auf Hydrazone Vernetzung von Polymeren Oligomere auf der Schüttgut-Skala, Microscale, und nanoskaligen, letztere für die Zubereitung von Gel-Nanopartikeln und Nanofasern beschrieben.

Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele auf mehreren Längenskalen über reaktive Extrusion, Mikrofluidik, Selbstmontage und Elektrospinnen

Verschiedene Methoden zu manipulieren, dreidimensionalen Architektur in Protein-basierte Hydrogele werden hier in Bezug auf die Materialeigenschaften ausgewertet. Die makroporöse Netze sind mit einer Zelle-Klebstoff-Peptid funktionalisiert und deren Umsetzbarkeit in der Zellkultur wird ausgewertet, mit zwei verschiedenen Modell-Zelllinien.

Einfache Handhabung von Architekturen in Protein-basierte Hydrogele für Zelle Kultur Anwendungen

Bei dieser Methode verwenden wir Photopolymerisation und klicken Sie auf Chemie Techniken zum Erstellen von Protein oder Peptid Mustern auf der Oberfläche von Polyethylenglykol (PEG) Hydrogele, Bereitstellung immobilisiert bioaktiven Signale für die Erforschung der zellulären Reaktionen in-vitro- .

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

Aktuelle Bilayer Kultur Modelle erlauben nicht funktioneller in-vitro- Studien, die in Vivo Mikroumgebungen zu imitieren. Mit Polyethylenglykol und Zinkoxid Template Methode, beschreibt dieses Protokoll die Entwicklung der eine ultradünne biomimetische Basalmembran mit einstellbaren Steifigkeit, Porosität und biochemische Zusammensetzung, die eng in Vivo imitiert extrazellulären Matrizen.

Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Formulierung von injizierbaren, supramolekularen Polymer-Nanopartikel (PNP)-Hydrogel-Biomaterialien. Anwendungen dieser Materialien für die Wirkstoffabgabe, die biopharmazeutische Stabilisierung sowie die Zellverkapselung und -abgabe werden demonstriert.

Injizierbare supramolekulare Polymer-Nanopartikel-Hydrogele für Zell- und Arzneimittelverabreichungsanwendungen

Das hier vorgestellte Protokoll zeigt die Synthese eines stark adhäsiven Hydrogels Gelatine o-Nitrosobenzaldehyd (Gelatine-NB). Gelatine-NB hat eine schnelle und effiziente Gewebeadhäsionsfähigkeit, die eine starke physikalische Barriere zum Schutz von Wundoberflächen bilden kann, so dass erwartet wird, dass es auf dem Gebiet der Biotechnologie zur Reparatur von Verletzungen angewendet wird.

Synthese von stark adhäsivem Hydrogel, Gelatine O-Nitrosobenzaldehyd

In dieser Arbeit stellen wir zwei Protokolle zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogelmatrices vor, ohne dass eine externe Flüssigphase erforderlich ist.

Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogele

Erfahren Sie die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogelen mittels CuAAC und mikrowellenunterstützter Polykondensation für Gewebeengineering. Diese Methode verbessert die Zelllebensfähigkeit in 3D-Kulturen und ermöglicht Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen

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