Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, Hydrogele für Anwendungen im Bereich des Gewebegeneration sehr einfach zu synthetisieren. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Gewebegeneration zu beantworten, beispielsweise die Möglichkeit, eine hohe Zellvitalität in dreidimensionalen Zellkultursystemen aufrechtzuerhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir durch eine schnelle Reaktion die Hydrogelsysteme leicht modifizieren können, um ihre Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der Zellviabilität zu verbessern.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Therapie von Rückenmarksverletzungen, da die in das Gerüst eingelagerten Zellen das beschädigte Gewebe regenerieren können. Diese Methode kann tiefgreifende Einblicke in Zelltherapien als regenerative Medizin und deren Bedeutung für zahlreiche Methoden liefern. Sie kann außerdem in mehreren anderen Systemen wie Knochen, Herz und Knorpel angewendet werden.

Zur Synthese des RGD-Azid-Derivats lösen Sie 50 Milligramm RGD in einem Milliliter einmolarer Natriumhydroxidlösung. Lösen Sie anschließend 24 Milligramm 4-Azidobutanoylchlorid in zwei Milliliter Tetrahydrofuran. Geben Sie dann unter Rühren die gesamte RGD-Lösung tropfenweise zur 4-Azidobutanoylchlorid-Lösung bei null Grad Celsius hinzu.

Zur Raumtemperatur zurückkehren und über Nacht umrühren. Einen Milliliter einmolarer HCl hinzufügen. Entfernen Sie das Lösungsmittel unter vermindertem Druck mittels Rotationsverdampfer.

Charakterisieren Sie das erhaltenen Produkt mittels Protonen-Kernspinresonanzspektroskopie, wobei die Probe in Deuteriumoxid oder D2O gelöst wird. Zum Durchführen der PAA-Alkin-Modifikation lösen Sie 200 Milligramm einer 35 Gew.-%igen PAA-Lösung in 15 Milliliter destilliertem Wasser. Geben Sie 15,4 Milligramm Propargylaminhydrochlorid hinzu.

Danach lösen Sie 42,8 Milligramm HOBt in 14 Milliliter einer Acetonitril-Destilliertwasser-Lösung im Verhältnis 1:1 durch Erhitzen auf 50 Grad Celsius auf. Geben Sie die gesamte HOBt-Lösung bei Raumtemperatur zur PAA-Lösung hinzu. Fügen Sie anschließend 53,6 Milligramm EDC dem Reaktionsgemisch hinzu.

Verwenden Sie eine einmolare HCl-Lösung, um den pH-Wert auf 5,5 einzustellen, und rühren Sie das Reaktionssystem über Nacht bei Raumtemperatur. Lösen Sie anschließend 11,2 Gramm Natriumchlorid in zwei Litern destilliertem Wasser. Fügen Sie danach 200 Mikroliter einer 37 %igen (Gewicht pro Gewicht) HCl-Lösung hinzu.

Dialysieren Sie die Lösung unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 3,5 Kilodalton. Führen Sie die Dialyse über drei Tage durch. Wechseln Sie die Dialyse-Lösung täglich mit zwei Litern frisch zubereitetem destilliertem Wasser, das 200 Mikroliter 37 % (Gewicht pro Gewicht) HCl enthält.

Lagern Sie die endgültige Lösung bei minus 80 Grad Celsius. Charakterisieren Sie das funktionalisierte Polymer durch Protonen-Kernspinresonanzspektroskopie, indem Sie die Probe in D2O lösen. Um das PAA-RGD-Polymer zu synthetisieren, lösen Sie 78 Milligramm alkyn-modifiziertes PAA in 10 Milliliter destilliertem Wasser.

Lösen Sie dann 25 Milligramm des RGD-Azid-Derivats in fünf Millilitern Tetrahydrofuran auf. Geben Sie die gesamte RGD-Lösung zu der polymeren Lösung hinzu. Fügen Sie anschließend 2,2 Milligramm Kupferiodid hinzu.

Und 2,2 Milligramm Natriumascorbat. Den resultierenden Ansatz über Nacht bei 60 Grad Celsius unter Rühren refluktieren. Die Mischung auf 25 Grad Celsius abkühlen lassen.

Um die Lösung zu dialysieren, lösen Sie 11,2 Gramm Natriumchlorid in zwei Litern destilliertem Wasser und geben 200 Mikroliter 37 Gewichtsprozent HCl hinzu. Führen Sie die Dialyse drei Tage lang durch. Wechseln Sie die Dialyselösung täglich mit zwei Litern frisch hergestelltem destilliertem Wasser, das 200 Mikroliter 37 Gewichtsprozent HCl enthält.

Anschließend die endgültige Lösung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Das resultierende PAA-RGD-Polymer charakterisieren und lagern, wie bereits für seine Bestandteile durchgeführt. Vierzig Milligramm Carbomer und zehn Milligramm des funktionalisierten PAA in neun Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur vermischen, bis eine vollständige Auflösung erfolgt ist.

Fügen Sie 400 Milligramm PEG zur Lösung hinzu und rühren Sie 45 Minuten lang weiter. Stellen Sie das Rühren ein und lassen Sie das System 30 Minuten lang absetzen. Anschließend verwenden Sie einmolariges Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.

Zu fünf Milliliter der erhaltenen Mischung 25 Milligramm Agarosepulver hinzufügen. Das System mit Mikrowellenstrahlung bei 500 Watt für 30 Sekunden bis eine Minute bestrahlen, bis die Mischung kocht. Anschließend die Lösung elektromagnetisch auf 80 Grad Celsius erhitzen.

Lassen Sie das Gemisch bei Raumtemperatur, bis seine Temperatur auf 50 Grad Celsius abgesunken ist. Geben Sie anschließend fünf Milliliter PBS hinzu, um eine Lösung im volumetrischen Verhältnis eins zu eins zu erhalten. Bereiten Sie eine 12-Multiwell-Platte vor, die Stahlzylinder mit einem Durchmesser von 1,1 Zentimetern enthält.

Entnehmen Sie 500 Mikroliter-Aliquots aus der Lösung und geben Sie diese in jeden Stahlzylinder. Lassen Sie die Platte 45 Minuten ruhen, bis die vollständige Gelbildung des Systems erfolgt ist. Entfernen Sie die Zylinder mit einer Edelstahl-Pinzette, um die Hydrogels zu erhalten.

Siehe Textprotokoll zur Charakterisierung der physikochemischen Eigenschaften der RGD-funktionalisierten Hydrogelen. Carbomer 974P, PAA-RGD und PEG gehen zusammen mit Agarose nach Mikrowellenbestrahlung eine statistische zufällige Polykondensation ein. In PEG und Agarose enthaltene Hydroxylgruppen reagieren mit in Carbomer 947P und PAA-RGD vorhandenen Carboxylgruppen, um ACPEG-RGD-Hydrogelen zu bilden.

Unter Berücksichtigung der rheologischen Eigenschaften erwies sich das Speichermodul als etwa eine Größenordnung höher als das Verlustmodul, was auf ein elastisches und nicht viskoses Material hinweist. Darüber hinaus ist deutlich erkennbar, dass das Verhalten des Hydrogels bei niedrigen Dehnungswerten vom Elastizitätsmodul dominiert wird. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt die Morphologie einer RGD-funktionalisierten Hydrogelprobe sowie eines Hydrogels ohne Funktionalisierung.

Beide Hydrogele zeigten, dass sie eine stark verwobene Struktur aus miteinander verbundenen Poren aufweisen, wobei einige größere Poren kleinere Poren sowie faserförmige Netzwerke an den Porenwänden enthalten. Die ähnlichen Eigenschaften deuten darauf hin, dass das Vorhandensein von RGD das Polymer-Netzwerk nicht verändert. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik der Forschung im Bereich des Gewebeingenieurwesens den Weg, um die Stabilität dieser Zellkultursysteme bei mehreren weiteren Erkrankungen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hydrogels funktionalisiert, um ihre Fähigkeit zu verbessern, lebensfähige Stammzellen zu erhalten.