Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele auf mehreren Längenskalen über reaktive Extrusion, Mikrofluidik, Selbstmontage und Elektrospinnen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, abbaubare Versionen von thermoresponsiven Hydrogelen mit kontrollierten Längenskalen und Geometrien herzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Herausforderungen im Szenario biomedizinischer Materialien zu bewältigen, wie z. B. die Erleichterung einer langfristigen, minimal-invasiven lokalen Wirkstoffverabreichung, die Schaffung reaktionsfähiger Gerüste für das Tissue Engineering oder die Entwicklung gezielter Nanotherapeutika. Der Hauptvorteil unserer Technik ist eine schnelle umgekehrte Biohydrazonchemie, die es uns ermöglicht, die Größe und Form der abbaubaren Hydrogele durch Änderung der Mischgeometrie der Polymervorläufer zu kontrollieren.

Diese Flexibilität ermöglicht es uns, Folgele, Mikrogele, Nanogele und Nanofasern mit demselben Ausgangsmaterial herzustellen. Zuerst werden jeweils etwa zwei Milliliter Hydrazid- und Aldehyd-funktionalisierte thermoresponsive Vorläufer-Polymerlösungen mit Konzentrationen zwischen fünf und 40 Gew.-% und 10 Millimolar phosphatgepufferte Kochsalzlösung hergestellt. Verwenden Sie Einzylinderspritzen, um die Vorläuferpolymerlösungen in separate Schläuche einer 2,5-Milliliter-Doppellaufspritze im Maßstab 1:1 zu füllen.

Verbinden Sie als Nächstes einen 1,5-Zoll-Statikmischer mit einer 2,5-Milliliter-Doppelrohrspritze im Verhältnis 1:1. Befestigen Sie bei Bedarf eine 18-Gauge- oder 20-Gauge-1,5-Zoll-Nadel an den statischen Mischer. Schneiden Sie dann aus einer weichen Silikonkautschukplatte der gewünschten Dicke ab.

Ein Stück in der Größe eines Standard-Objektträgers. Stanzen Sie mit einem Lochsatz mindestens ein Loch der gewünschten Form in die Silikonkautschukplatte. Legen Sie die Silikongummiform auf einen sauberen Glasschieber und stellen Sie sicher, dass alle Löcher vom Glas verdeckt sind.

Drücken Sie die Form vorsichtig gegen den Schieber, um sie zu fixieren. Silikonkautschukplatten können auch als Unterlage verwendet werden, um eine gute Haftung des Untergrunds zu gewährleisten. Co extrudieren Sie die mit Hydrazid und Aldehyd funktionalisierten Polymerlösungen durch den statischen Mischer in die Formwells, bis die Wells vollständig gefüllt sind.

Decken Sie die Form mit einem zweiten sauberen Glasobjektträger ab und warten Sie, bis die Gelierung abgeschlossen ist. Entfernen Sie dann den oberen Objektträger und verwenden Sie einen Spatel, um die Hydrogele von der Silikonkautschukform zu trennen. Hebe die Form vom Objektträger, um die Hydrogele zu gewinnen.

Stellen Sie vor dem Eingriff einen mikrofluidischen Chip für die Erzeugung von Mikropartikeln her. Synthese von hydrazid- und aldehydfunktionalisiertem Poly-NIPAM. Bereiten Sie zunächst jeweils zwei Milliliter 6 Gew.-% Lösungen von Hydrazid- und Aldehyd-funktionalisiertem Poly-NIPAM in deionisiertem Wasser vor.

Laden Sie die Polymervorläuferlösungen in separate Fünf-Milliliter-Spritzen. Bereiten Sie anschließend 150 Milliliter einer 1%-igen Lösung von Sorbitanmonooleat in schwerem Paraffinöl vor. Laden Sie diese Lösung in zwei Standardspritzen mit 60 Millilitern.

Montieren Sie die vier Spritzen in separate Infusionsspritzenpumpen. Schließen Sie als Nächstes einen 45 Zentimeter langen Silikonschlauch an den mikrofluidischen Chipauslass an. Legen Sie das Ende des Auslassschlauchs in einen Abfallbehälter.

Verbinden Sie die Spritzen der Polymerlösung mit den Polymereinlasskanälen auf dem Mikrofluidik-Chip mit einem 30 Zentimeter langen Silikonschlauch. Verbinden Sie eine Spritze mit Paraffinöllösung mit einem Silikonschlauch mit dem vorgeschalteten Öleinlasskanal. Verbinden Sie die andere Ölspritze mit Hilfe eines Silikonschlauchs und einer U-förmigen Spritzenverbindung mit den beiden nachgeschalteten Öleinlasskanälen.

Stellen Sie die Fördermengen der mit Ölspritzen ausgestatteten Pumpen auf 1,1 bis 5,5 Milliliter pro Stunde ein. Lassen Sie mindestens 30 Minuten lang Öl durch den mikrofluidischen Chip fließen, um den Chip zu grundieren und zu bestätigen, dass der Chip fehlerfrei ist. Anschließend werden beide Polymerlösungen gleichzeitig mit 03 mL pro Stunde an den grundierten Chip abgegeben.

Lassen Sie den Fluss von Polymer und Öl 30 Minuten bis eine Stunde lang ausgleichen. Um eine vorzeitige Gelierung der Vorläuferpolymere an der mikrofluidischen Düse zu verhindern, ist es wichtig, die Schläuche sorgfältig zu grundieren und den Polymerfluss genau zur gleichen Zeit zu starten, um einen Rückfluss in eines der Polymerreservoire zu verhindern. Sobald sich an der Düse des mikrofluidischen Chips gleichmäßige Gel-Mikropartikel bilden, sammeln Sie die Partikel in einem Kunststoffzentrifugenröhrchen mit einem aktiven magnetischen Rührstab.

Stoppen Sie die Spritzenpumpen und den Rührmotor, wenn das Öl verbraucht ist. Sobald sich die Gel-Mikropartikel in der Tube abgesetzt haben, entkanten Sie das Paraffinöl mit einer Pipette. In den Kolben werden je 5 ml Mikropartikel 10 Milliliter Pentan gegeben.

Mischen Sie die Emolution etwa eine Minute lang kräftig. Lassen Sie die Partikel ein bis zwei Stunden ruhen, bevor Sie das Pentan mit einer Pipette dekantieren. Wiederholen Sie diese Pentanwäsche mindestens fünfmal.

Übertragen Sie die gewaschenen Gel-Mikropartikel in ein kleines Szintillationsfläschchen aus Glas. Resuspendieren Sie die Partikel in ein bis zwei Millilitern entionisiertem Wasser. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie jeweils fünf Milliliter 1%ige Lösungen von Hydrazid und aldehydfunktionalisiertem Poly-NIPAM in entionisiertem Wasser vor.

Erhitzen Sie fünf Milliliter der hydrazidfunktionalisierten Poly-NITAM-Lösung unter Rühren auf 70 Grad Celsius. Überwachen Sie die Lösung, während sie undurchsichtig wird, und vergewissern Sie sich, dass sich keine sichtbaren Ausfällungen bilden. Geben Sie dann 0,25 Milliliter der aldehydfunktionalisierten Poly-NITAM-Lösung tropfenweise über einen Zeitraum von fünf bis 10 Sekunden zu der erhitzten Hydrazid-funktionalisierten Poly-NITAM-Lösung.

Rühre die Mischung 15 Minuten lang bei 70 Grad Celsius um. Nehmen Sie dann die Mischung aus dem Ölbad und lassen Sie sie über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen, um die Nanogele für die Reinigung zu erhalten. Geben Sie die Nanogelmischung in eine Dialysemembran mit einem Molekulargewicht von 3500 Kilodalton.

Dialysieren Sie die Nanogele gegen dionisiertes Wasser sechsmal in Sechs-Stunden-Zyklen, um unvernetzte Polymere zu entfernen. Falls gewünscht, lyophilisieren Sie die gereinigten Nanogele für die Lagerung. Um mit dem Herstellungsverfahren für Gel-Nanofasern zu beginnen, bereiten Sie jeweils einen Milliliter 15-Gew.-% Lösungen von Hydrazid und aldehydfunktionalisiertem POEGMA in deionisiertem Wasser vor.

Bereiten Sie dann zwei Milliliter einer 5%igen Lösung aus hochmolekularem Polyethylenoxid in deionisiertem Wasser vor. Kombinieren Sie jede POEGMA-Vorläuferlösung mit einem Milliliter der Polyethylenoxidlösung. Laden Sie die Vorläuferlösungen in separate Schläuche der Doppellaufspritze.

Verbinden Sie als Nächstes einen 1,5-Zoll-Statikmischer und eine 18-Gauge-Nadel mit stumpfer Spitze mit einer 2,5-Milliliter-Doppelrohrspritze im Verhältnis 1:1. Montieren Sie die Doppellaufspritze auf eine Infusionsspritzenpumpe. Montieren Sie dann einen Elektrospinnkollektor mit Aluminiumscheibe 10 Zentimeter vom Ende der Nadel entfernt.

Erden Sie ein Hochspannungsnetzteil am Kollektor und verbinden Sie das Netzteil mit der Nadel. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf 0,48 Milliliter pro Stunde und die Stromversorgung auf 10 Kilovolt ein. Starten Sie gleichzeitig die Spritzenpumpe und die Stromversorgung, um das Elektrospinnen zu starten.

Fahren Sie fort, bis die gewünschte Dicke erreicht ist oder die Vorläufer erschöpft sind. Schalten Sie nach Abschluss der Nanofaserproduktion die Elektrospinneinheit aus und trennen Sie sie. Weichen Sie die gesammelten Gel-Nanofasern 24 Stunden lang in entionisiertem Wasser ein, um das Polyethylenoxid zu entfernen.

Die Verabreichung von Doppelrohrspritzen produzierte hydrazonvernetzte POEGMA-Bulk-Hydragele mit einer Reihe von Mechaniken, Gelierungszeiten und Transparenzen, abhängig von der Polymerkonzentration des Vorläufers, der Dichte der reaktiven funktionellen Gruppe und der Anzahl der Ethylenoxid-Wiederholungseinheiten auf den Monomeren. Die Durchflussraten sowohl des Paraffinöls als auch der Polymervorläuferlösungen beeinflussten die Größen der hydrozonenvernetzten Poly-NITAM-Gel-Mikropartikel, die mit dem mikrofluidischen Gerät hergestellt wurden. Eine reversible temperaturabhängige Quellung wurde mit der optischen Mikroskopie des Heißtisches beobachtet.

Die Gel-Mikropartikel zerfielen im Laufe der Zeit zu ihren oligomeren Vorläufern. Die Größen der selbstorganisierten hydrazonvernetzten Poly-NITAM-Nanogele variierten mit dem Aldehyd-Hydrazid-funktionalisierten Polymer-Vorläufer-Massen-Verhältnis, blieben aber hochgradig monodispergiert. Mit zunehmendem Massenverhältnis wurde eine geringere thermische Entquellung beobachtet.

Wie die Gel-Mikropartikel wurden auch die Nanogele im Laufe der Zeit zu den oligomeren Vorläufern abgebaut. Hydrazon-vernetzte POEGMA-Hydrogel-Nanofasern mit Durchmessern in der Größenordnung von 300 Nanometern wurden durch reaktives Elektrospinnen hergestellt. Die Hydratation von Nanofasern war etwa zwei Größenordnungen schneller als die Hydratation eines Bulk-Gels mit der gleichen Polymerzusammensetzung.

Die Nanofasern behielten ihre nanofaserige Morphologie über acht Wochen bei, bevor sie unter physiologischen Bedingungen abgebaut wurden. In sauren Umgebungen kam es zu einem schnelleren Abbau. Die Nanofasern waren sowohl im trockenen als auch im gequollenen Zustand mechanisch robust.

Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie man abbaubare, thermisch ansprechende Hydrogele herstellt, indem man die Geometrie steuert, in der die Gelvorläuferpolymere hergestellt werden. Denken Sie daran, sicherzustellen, dass die Gelierzeit des Polymervorläufers den Anforderungen jedes Partikels entspricht. Eine zu schnelle Gelierung hemmt die Herstellung des Mikrogels und der Nanofaser.

Eine zu langsame Gelierung führt zu den vollständig kongerierten Morphologien. Diese Techniken ebnen den Weg für Forscher in den Bereichen Drug Delivery und Tissue Engineering. und entwerfen Sie gut definierte Hydrogel-Gerüste zur Steuerung der Geschwindigkeit oder des Ortes der Wirkstofffreisetzung oder zur Stimulierung der Geweberegeneration.