Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kleine Moleküle zu identifizieren, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen TRIP8b- und HCN-Kanälen zu stören. Diese Methode identifiziert Kandidatenmoleküle, die zu neuen Behandlungen für Depressionen entwickelt werden könnten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit hohem Durchsatz abgeschlossen werden kann.

Diese Technik hat Auswirkungen auf die Entwicklung einer neuartigen Therapie für schwere depressive Störungen, da unser Labor gezeigt hat, dass die Unterbrechung der TRIP8b-Bindung an HCN von therapeutischem Nutzen sein kann. Obwohl diese Methode mit Blick auf Depressionen entwickelt wurde, kann eine Störung der Interaktion zwischen TRIP8b und HCN bei anderen Erkrankungen, wie z. B. chronischen Schmerzen, von therapeutischem Nutzen sein. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist wichtig, da es die Vorteile des Einsatzes automatisierter Hochdurchsatz-Instrumente veranschaulicht, um die Grundlagen- und translationale Forschung an offenen Einrichtungen wie dem Hochdurchsatz-Analyselabor der Northwestern University voranzutreiben.

Nach der Aufreinigung des TRIP8b 241-602-Proteinfragments und der Untersuchung der Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer Positivkontrolle gemäß dem Textprotokoll werden die Aliquoten von TRIP8b und HCN1-FITC aufgetaut und auf Eis gelegt. Verwenden Sie FP Buffer, um 20 Milliliter 2 mikromolare TRIP8b und 50 nanomolare HCN1-FITC herzustellen. Geben Sie dann 25 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung einer schwarzen Mikrotiterplatte mit geringer Bindung von 384 Vertiefungen.

Verwenden Sie für das Bibliotheksscreening einen akustischen Liquid Handler, um 100 Nanoliter Verbindungen in jede Vertiefung der Säulen 3 bis 22 zu dosieren, um eine Endkonzentration von 40 Mikromol zu erreichen. Geben Sie 100 Nanoliter DMSO als Negativkontrollen in jede Vertiefung der Spalten 1 und 23. Dispensieren Sie 100 Nanoliter unmarkiertes HCN1-Peptid in jede Vertiefung der Spalten 2 und 24 als Positivkontrollen mit einer Endkonzentration von 10 Mikromol.

Inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Messen Sie mit einem Plattenleser die Fluoreszenzpolarisation. Alternativ können die Platten vor dem Ablesen 16 Stunden bei 4 Grad Celsius gelagert werden.

Berechnen Sie unter Verwendung der folgenden Gleichung die prozentuale Hemmung, wobei XN die normalisierte prozentuale Hemmung ist, die dem Signal X.X positiv ist das durchschnittliche Signal aus den positiven Kontrollwells und X negativ ist das durchschnittliche Signal aus den negativen Kontrollwells. Um Treffer mit einer Hemmung von über 50 % zu validieren, bereiten Sie einen Mastermix aus 20 Millilitern 2 mikromolaren TRIP8b und 50 nanomolaren HCN1 TAMRA in FP-Puffer vor. Geben Sie 25 Mikroliter des Mastermixes in jede Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Mikrotiterplatte.

Geben Sie dann 100 Nanoliter Verbindungen aus einer Platte, die zweifache serielle Verdünnungen jedes Wirkstoffs enthält, in die jeweiligen Vertiefungen. Für die negativen Kontrollvertiefungen fügen Sie 100 Nanoliter DMSO hinzu. Für eine Positivkontrolle fügen Sie 100 Nanoliter seriell verdünntes, unmarkiertes HCN1-Peptid mit Endkonzentrationen zwischen 200 Mikromol und 0,1 Mikromol hinzu.

Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder 16 Stunden lang bei 4 Grad Celsius. Messen Sie mit einem Plattenleser die Fluoreszenzpolarisation. Berechnen Sie die IC50-Werte, indem Sie die konzentrationsabhängigen FP-Daten jeder Verbindung unter Verwendung eines nichtlinearen Regressionsmodells mit 4 Parametern anpassen.

je ein Aliquot von HIS-markierten TRIP8b- und GST-markierten HCN1-Fusionsproteinen auf und halten Sie sie auf Eis. Für jede zu testende Verbindung ist 1 Milliliter 200 nanomolare HIS TRIP8b und 20 Nanomol GST-HCN1C40 in Assay-Puffer vorzubereiten. Verwenden Sie eine 16-Kanal-Pipette, um 7 Mikroliter des HIS-TRIP8b GST-HCN1C40-Gemisches in drei Vertiefungen pro Reihe von Reihen A bis N zu geben, um jede Verbindung in dreifacher Ausführung zu testen.

Zentrifugieren Sie die Platte kurz, um sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeiten am Boden jeder Vertiefung befinden, und um Blasen zu entfernen. Als nächstes geben Sie die zu testenden Hit-Verbindungen in die Platte, um eine Endkonzentration von 200 Mikromol in Reihe A zu erreichen, und enden Sie mit 0,1 Mikromol in Reihe L.Geben Sie das gleiche Volumen DMSO in Reihe M.Geben Sie dann unmarkiertes HCN1-Peptid bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikromol in Reihe N.Schütteln Sie die Platte zwei Minuten lang und inkubieren Sie sie 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die Anti-GST-Akzeptorkügelchen mit Assay-Puffer von 1 bis 50.

Geben Sie mit einer 16-Kanal-Pipette 3,5 Mikroliter der verdünnten Akzeptorkügelchen in jede Vertiefung der Platte und mischen Sie durch vorsichtiges Pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die Nickelchelat-Donorkügelchen 1 bis 50 mit Assay-Puffer, ohne die Mischung dem Licht auszusetzen.

Geben Sie 3,5 Mikroliter der verdünnten Spenderperlen in jede Vertiefung der Platte und mischen Sie vorsichtig, wobei Luftblasen vermieden werden. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden. Verwenden Sie dann einen Plattenleser, um die Platte mit den hier aufgeführten Messparametern auszulesen.

Berechnen Sie abschließend die IC50-Werte, indem Sie die Daten für jede Verbindung mit einem nichtlinearen Regressionsmodell mit 4 Parametern anpassen. Um die Interaktion mit HCN1 TAMRA zu beurteilen, wurde TRIP8b in eine feste Konzentration von HCN1 TAMRA titriert. Diese Grafik zeigt, dass mit zunehmender Konzentration von TRIP8b mehr HCN1-TAMRA-Moleküle gebunden werden und die Polarisation zunimmt.

In diesem Experiment, als unmarkiertes HCN1 in eine feste Konzentration von TRIP8b und HCN1 TAMRA titriert wurde, wurde das markierte Peptid verschoben und das Signal verringert. Ein Hochdurchsatz-Screening zeigt die prozentuale Hemmung jeder Verbindung, die durch einzelne Punkte in der Grafik dargestellt wird. Die Ergebnisse dieses Screenings werden mit Positiv- und Negativkontrollen und jeweils der durchschnittlichen prozentualen Hemmung jeder Verbindung über zwei Durchläufe des Assays dargestellt.

Verbindungen, die eine Hemmung von mehr als 50 % zeigten, wurden dann in diesem Experiment validiert. Die X- und Y-Koordinaten wurden durch die prozentuale Hemmung in zwei Durchläufen des Assays bestimmt. In diesem Experiment enthält HCN1C40 ein GST-Tag am Endterminal, das Akzeptorperlen bindet.

Die Interaktion der TPR-Domänen von TRIP8b und des C-terminalen Tripeptids von HCN1 regt die Donorkugel mit Licht mit einer Wellenlänge von 680 Nanometern an, um Singulett-Sauerstoff zu produzieren. Wie in dieser Grafik gezeigt, führte die Titration von steigenden Konzentrationen der Hit-Verbindung NUCC-5953 in eine feste Konzentration von TRIP8b und HCN1C40 die Hemmung der TRIP8b HCN1-Wechselwirkung. Validieren Sie vor dem Start des Hochdurchsatz-Screenings die Proteinpräparation und die Fluoreszenzpolarisation in Bead-basierten Proximity-Assays.

Stellen Sie sicher, dass das Protein von hoher Reinheit ist. Aliquotieren Sie das Protein, um mehrere Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden. Es ist wichtig, hochwertige Reagenzien zu verwenden, einschließlich frischem DMSO und Triton.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem DMSO gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Elektrophysiologie und Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um festzustellen, ob die getroffenen Verbindungen Aktivität in Zellen aufweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Hochdurchsatz-Screening mit einem auf Fluoreszenzpolarisation basierenden Assay durchführen.