Name: G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie, wie FRET-Sensoren in lebenden Zellen G-Protein-selektive GPCR-Konformationen unter verschiedenen Agonistenbedingungen messen. Diese modulare Methode liefert Einblicke in GPCR-Interaktionen und Arzneimittelwirkungen.

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RUM wurde von der American Heart Association Pre-Doc-Stipendium finanziert (14PRE18560010). Forschung wurde von der American Heart Association Scientist Entwicklung Grant (13SDG14270009) &amp; NIH (1DP2 CA186752-01 &amp; 1-R01-GM-105646-01-A1) finanziert SS

1. DNA-Präparation <ol><li> Design-Sensor konstruiert ein modulares Klonens Schema verwendet. Beziehen Sie sich auf den β 2 -AR Sensordesign zuvor 1 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie DNA nach Handels Minipräparationskit Protokoll und eluieren in 2 mM Tris-HCl - Lösung, pH 8, bei einer Konzentration von ≥ 750 ng / &amp; mgr; l, A 260 / A 280 von 1,7-1,9, A 260 / A 230 von 2,0 bis 2,29. </li></ol> 2. Zellkultur Vorbereitung <ol><li> Kultur HEK-293T-Flp-n-Zellen in DMEM, das 4,5 g / L D-Glucose, supplementiert mit 10% FBS (hitzeinaktiviert) (v / v), 1% L-Glutamin zu ergänzen, 20 mM HEPES, pH 7,5 bei 37 ° C in angefeuchteter Atmosphäre mit 5% CO 2. Griff Zellen in biologischen Schutzhaube für den nachfolgenden Schritten. </li><li> Lassen Zellen zu einer konfluenten Monoschicht zu wachsen , bevor Passagierung in Sechs-Well - Gerichte. Zeit Konfluenz zu erreichen, hängt von anfänglichen Plattierungsdichte. Verwenden Platten, diekommen zu Konfluenz in 1 - 2 Tage Plattierung für Sechs-Well-Beschichtung. Eine konfluente 10 cm Gewebekultur-behandelte Schale hat Zelldichte von etwa 4 x 10 6 Zellen / ml. Siehe Abbildung 1 für Bild von Zellkulturwachstum. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS und trypsinize mit 0,25% Trypsin (siehe Diskussion, Absatz 2). Platte 8 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 2 ml Medium in Gewebekultur-behandelten sechs - Well - Schalen und ermöglichen 16 anhaften - 20 Stunden. </li></ol> 3. Transfektionsbedingungen <ol><li> Stagger Transfektionen für Konstrukte, die unterschiedliche Mengen an Zeit erfordern eine optimale Expression zu erreichen (zwischen 20 - 36 h). Synchronisieren Sie Bedingungen für eine einheitliche Versuchszeit. Auch haben eine nicht-transfizierte Kontrollvertiefung bei äquivalenten Zelldichte für die Hintergrundgeräusche und Streu Subtraktion während der Analyse verwendet werden. </li><li> Bringen Sie Transfektionsreagenzien auf Raumtemperatur: reduzierte Serum Medien, DNA, Transfektionsreagenz. </li><li> In einembiologische Schutzhaube Reagenzien in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen in der folgenden Reihenfolge kombinieren: mit 100 &amp; mgr; l reduziert Serum Medien 2 ug DNA mischen. Spike 6 ul Transfektionsreagenz in Medium / DNA-Gemisch ohne Oberfläche Mischung zu berühren oder die Seite des Röhrchens. Richten Sie eine Transfektionsreaktion pro Vertiefung. Transfektionsbedingungen können (1 - 4 &amp; mgr; g DNA, 3 - 6 ul Transfektionsreagenz) optimiert werden konsistente Expressionsniveaus zu erreichen. Siehe Tabelle 1 für weitere optimierte Verhältnisse. </li><li> Inkubieren Mischung bei RT in biologischen Schutzhaube für 15 - 30 min. Nicht Reaktion verwenden, wenn länger als 30 min inkubiert. </li><li> In Reaktion auf die Zellen in einer tropfenweise Art und Weise über gut und sanft schütteln sechs Vertiefungen Durchmischung zu gewährleisten. In einer Reaktion pro Vertiefung. </li><li> unter Verwendung von Gewebekulturfluoreszenzmikroskop Nach 20 Stunden des Ausdrucks, Monitor Fluoreszenz. Beurteilen Bevölkerung Ausdruck mit 10X-Objektiv und Proteinlokalisierung in einer Zelle bei 40X. Observe für die Proteinexpression in der Plasmamembran (PM). Wenn wesentliche Internalisierung festgestellt wird, überwachen die Transfektion, bis eine signifikante Expression bei PM erfasst wird. </li></ol> 4. Reagenz und Vorbereitung der Ausrüstung <ol><li> Bereiten 100 mM Pharma - Aktien und bei -80 ° C: Isoproterenol Bitartrat (100 mM in dH 2 O , enthaltend 300 mM Ascorbinsäure). Machen Sie auf Eis / in kalten Raum, und Flash-Freeze sofort. Aliquots können bis zu einem Jahr hergestellt und verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie Zellenpuffer (~ 2 ml / Zustand) und Speicher in einem 37 ° C Wasserbad. Machen Sie jeden Tag frisch. Referenztabelle 2 für Zellenpuffer Bestandteile. </li><li> Bereiten Drug-Puffer (10 ml) und bei Raumtemperatur lagern. Referenztabelle 2 für Drogen Buffer Bestandteile. </li><li> Waschen mit Säure Küvetten konzentrierter HCl. Neutralisieren mit einer schwachen Base (1 M KOH) und gründlich waschen Küvetten mit dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie Arbeitsstation um Fluorometer mit mehrerenKisten von 10, 200 und 1000 ul Pipettenspitzen, einem Timer mit 10 Minuten Countdown, eine zugängliche Vakuumleitung mit Tipps für Küvetten - Reinigung, heikle Aufgabe Tüchern und Spritzflasche mit Reinstwasser H 2 O eingestellt </li><li> Wärmebad externe Wasser für Fluorometer und Wärmeblock auf 37 ° C. </li><li> Schalten Sie Fluorometers; Fluoreszenzerfassungsprogramm für GFP Sammlung Set 430 nm bis Anregung, Bandpass 8 nm; Emissionsbereich von 450 nm - 600 nm, Bandpass 4 nm. Für YFP Sammlung nur als Sensorsteuerung (siehe Diskussion) Satz Anregung auf 490 nm, Bandpass 8 nm, Emissionsbereich von 500 bis 600 nm, Bandpass 4 nm. GFP Sammlung Einstellungen werden verwendet, um ein FRET-Spektrum in diesem Experiment zu erwerben. </li><li> Legen Sie zwölf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in Wärmeblock , wie in Abbildung 2 gezeigt. Diese Rohre sind Halterungen für die Zell aliquoten Rohre (500 &amp; mgr; l-Mikrozentrifugenröhrchen.) Legen Sie ein kleines Stück Gewebe in Haltern 1 und 7, um die Küvetten hier platziert abzufedern. Hinweis: Verwenden Sie getrennte Küvetten für unbehandelten Zustand und Drogen Zustand eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Abbildung 2. Microcentrifuge Gefäß Einrichten und Position Referenz in Wärmeblock Cuvette für unbehandelten Proben ist in Position . 1; Zelle aliquoten Rohre sind in den Positionen 2 - 6. Cuvette für Proben Medikament behandelt in der Position 7; Zelle aliquoten Rohre sind in den Positionen 8 - 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="9"><li> Füllen Halter 2 bis 6 und 8 bis 12 mit ~ 750 &amp; mgr; l Wasser mit einer mini 37 ° C Wasserbad zu schaffen. </li><li> Legen Sie zehn 500 ul-Mikrozentrifugenröhrchen für Zellaliquote in Mini-Wasserbäder (Halter 2 - 6, 8 bis 12). Jedes Rohr wird eine einzelne Wiederholung der Bedingung (5 untreated, 5 Arzneimittel behandelt). </li><li> Überwachen Sie Zellen für die Expression (siehe Schritt 3.6). </li></ol> 5. Experiment &amp; Data Collection <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> Abbildung 3. Experimentelle Schematic. Eine ausführliche schrittweise Anleitung für experimentelle Aufbau und Ausführung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Referenz 3 für experimentelle Schema. Wenn Zellen bereit sind, geerntet werden, bezogen auf die Proteinexpression mit Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden (siehe Diskussion, Absatz 4): in der Haube biologische Sicherheit, sanft entfernen ~ 1 ml Medium, resuspendieren Zellen in ihrer Kultur mit einem P1,000 und übertragen Aufwirbelung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Vermeiden unter Verwendung von Trypsin, wie es die N-Terminus verdauen und /oder Bindungstasche des GPCR-Sensor. </li><li> Zählen von Zellen geeignete Zelldichte in Resuspension zu gewährleisten. Optimieren Resuspensionsvolumen für 4 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Spin-Zellen in Schwingbecherzentrifuge bei Raumtemperatur 290 g für 3 min. Überstand entfernen nach der Zentrifugation. </li><li> GENTLY Zellen in 1 ml Zellpuffer (gelagert bei 37 ° C) und wiederholen Sie Schritt 5.3 resuspendieren. Während zweite Spin, sammeln 100 mM Medikament Lager aliquoten von -80 ° C. Machen Sie 1: 100 Verdünnung in Drug-Puffer für 1 mM Arbeits Lager und halten bei RT. </li><li> Nach der zweiten Zentrifugation entfernen Überstand und vorsichtig in 1 ml der Zellenpuffer resuspendieren Zellen (4 x 10 6 Zellen / ml). Maßnahme OD 600 der Probe in dem Spektrophotometer unter Verwendung von 1 ml der Zellen und 1 ml der Zellenpuffer als Rohling. Dispense-Zellen in einer Einweg-Kunststoff-Küvetten und Transfer zurück zu einem Mikrozentrifugenröhrchen unmittelbar nach Spektrophotometrie. </li><li> Für eine Kontrolle untransfizierten cell Zustand Spektrum, sanft untransfizierten Zellen in 1 ml Zellenpuffer mit P1,000 Pipette resuspendieren, fügen Sie 90 ul der Zellen FRET-Spektrum bei Anregung 430 nm, Bandpass 8 nm, Emission 450 bis Küvette und erwerben - 600 nm, Bandpass 4 nm. Sammeln Sie 3 bis 5 wiederholen Spektren mit frischen 90 &amp; mgr; l der Zellen. Halten Sie Lager von Zellen bei 37 ° C zwischen specs, resuspendieren sanft mit P1,000 zwischen jedem Probenaliquothandhabungsvorrichtung und spülen Küvette mit Reinstwasser H 2 O zwischen den Proben. </li><li> Für Versuchsbedingungen aliquote 90 ul von transfizierten Zellen zu jeder der 500 &amp; mgr; l Röhrchen in Halter 2 bis 6, 8 bis 12 in dem Heizblock. resuspendieren vorsichtig Lager von Zellen mit P1,000 pipettieren zwischen jedem aliquoten Teil. </li><li> Nachdem die Zellen aliquotiert werden, fügen Sie 10 ul Drug Buffer 2 Röhren - 6 für unbehandelten Zustand Proben. </li><li> Beginnen Experiment durch Zugabe von 10 ul 1 mM Wirkstofflösung in das Rohr 8, starten Sie den Timer von 10 Minuten mit dem Countdown, und vorsichtig mischen Rohr mit P200 pipettieren. Schließen Rohr und Rückkehr zu 37° C Wärmeblock. </li><li> Pick sofort bis Rohr 2, vorsichtig mischen mit P200 (eine neue Spitze verwenden), fügen Sie 90 ul der Zellsuspension in unbehandeltem Zustand Küvetten und in Fluorometer. </li><li> Erwerben FRET-Spektrum bei Anregung 430 nm, Bandpass 8 nm, Emission 450 bis 600 nm, Bandpass 4 nm. </li><li> Bei 9 min - 10 sec, Spike Rohr 9 mit 10 ul 1 mM Wirkstofflösung, vorsichtig mit einem P200 (verwenden Sie neue Spitze) mischen, und das Rückrohrblock zu erhitzen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,10-5,11 mit Rohr 3 und 5.12 mit Rohr 10. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,10-5,13 in 1 - Minuten - Intervallen (8.10, 7.10, etc.) bis Spektren für alle unbehandelten Zustand Proben gesammelt werden, und Droge wurde auf alle Arzneimittel Zustand Proben hinzugefügt. Verwenden Sie eine frische Spitze für jeden Pipetten Schritt eine Kreuzkontamination zu verhindern. </li><li> Bei 5 min - 10 sec, beginnen Mischrohr 8 (drug Zustand) sanft mit P200 pipettieren, fügen Sie 90 ul der Zellsuspension in getrennten Küvetten für Arzneimittel behandelten Probe und in Fluorometer. </li><li> erwerben FRET-Spektrum (siehe Schritt 5.11 für Einstellungen). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,15-5,16 in 1 - Minuten - Intervallen (04.10, 03.10, etc.) für die verbleibenden Arzneimittel Zustand Proben (Rohre 9 bis 12). </li><li> Nach dem Ende des Tests Projektdateien zu speichern, gründlich Küvetten mit Reinstwasser H 2 O waschen und für den nächsten Zustand Röhren-Lager wieder. Achten Sie darauf, eine Kreuzkontamination in dem Waschschritt zu verhindern. Ändern Sie die Spitze auf dem H 2 O - Flasche sowie auf der Vakuumleitung zwischen Wäschen. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Speichern und Exportieren von Daten-Dateien in SPC formatiert werden für die Analyse verwendet werden. Analyseprogramme sind zum Download auf der Sivaramakrishnan Lab Veröffentlichung Website zur Verfügung. </li><li> Erstellen Sie Pfad-Dateien für Analyse-Software, die die Analyseprogramme (v9, v15) umfassen, untransfizierten Proben Dateien (siehe Schritt 5.6 für untransfizierten Zelle Spektrum-Sammlung), OUTPUT Datendatei, und durch Komma getrennte Werte (CSV) Dateien für die Dateneingabe. </li><li> Geben Sie folgende Informationenin CSV - Datei und benennen jeweiligen Bedingungen für jede Probe (Probe in Tabelle 3 zu sehen), einschließlich: Dateiname - individuelle SPC Graph-Dateien Rezeptor - designierter Konstrukt , das GPCR wurde getestet (zB Β2) Binder - bezeichnen , die Peptidvariante des Konstrukts wurde untersucht (beispielsweise S) Agonist - bezeichnen unbehandelten (N) oder Arzneimittel behandelt (D) Bedingungen Directory - der Pfad Ordner, in dem SPC-Dateien gespeichert werden, in der Regel nach Datum sortiert OD - aufgezeichnet optische Dichte der Probe aus Spektrophotometer </li><li> Geben Sie Dateinamen für untransfizierten Proben (Schritt 5.6) Puffer zu subtrahieren und Streuungsrauschen von Proben. </li><li> Geben Sie Bedingungen in Analyseprogramm. </li><li> Ausführen von Programmen zu analysieren Proben innerhalb der einzelnen Bedingungen (v9) und über Bedingungen (v15). </li><li> Ausschließen Beispieldateien, die offensichtlich Ausreißer im Datensatz sind, oder für die Subtraktion einstellen durch Erhöhen oder Verringern OD-Wert von indiviDual-Dateien. </li><li> Exportieren von Daten in der Ausgabedatei für den Zugriff auf berechneten FRET-Verhältnisse (525 nm / 475 nm). </li><li> Berechnen ΔFRET, indem die durchschnittliche FRET-Verhältnis für unbehandelten Zustand aus den einzelnen FRET-Verhältnisse für behandelt (Arzneimittel) Bedingungen abzieht. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Die enge Dynamikbereich von FRET-Messungen in diesem System verstärkt die Notwendigkeit, sensible Qualitätskontrolle bei jedem Schritt dieses Protokolls. Die wichtigsten Schritte ein erfolgreiches FRET Experiment sind 1) die Zellkultur, 2) Transfektion 3) Proteinexpression und 4) zeitnah, präzise Koordination während des Testausführung zu gewährleisten. Zell Gesundheit und Pflege / Beschichtung Qualität kann einen erheblichen Einfluss auf das Signal-zu-Rausch des experimentellen Systems und ...

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind sieben-Transmembran-Rezeptoren. Das menschliche Genom enthält etwa 800 allein Gene kodierend für GPCRs, die durch eine Vielzahl von Liganden, einschließlich Licht, Geruchsstoffe, Hormone, Peptide, Arzneimittel und andere kleine Moleküle aktiviert werden. Fast 30% aller Arzneimittel auf dem Markt Ziel GPCRs , weil sie eine große Rolle spielen bei vielen Krankheitszuständen 2. Trotz jahrzehntelanger intensiver Arbeit an dieser Rezeptorfamilie getan, gibt es weiterhin erhebliche offene Fragen auf dem Gebiet, vor allem im Hinblick auf die molekularen Mechanismen, die GPCR-Effektor-Wechselwirkung fahren. Bis heute hat nur eine hochauflösende Kristallstruktur veröffentlicht worden sind , einen Einblick in die Wechselwirkung zwischen dem β 2 -adrenergen Rezeptor Bereitstellung (β 2 -AR) und das Gs - Protein 3. Zusammen mit den umfangreichen Forschung in den letzten drei Jahrzehnten, wiederholt sie eine spezifische strukturelle Komponente, die in dieser kritischen istInteraktion: der C-Terminus G &amp; agr; -Untereinheit. Diese Struktur ist wichtig für die G - Protein - Aktivierung durch den GPCR 4 und G - Protein - Auswahl 5-6. Daher stellt die G &amp; agr; C-Terminus eine entscheidende Verbindung zwischen Ligand Stimulation des GPCR und selektive Protein-Aktivierung G. Forschung im letzten Jahrzehnt legt nahe, dass GPCRs eine breite Konformationsänderungen Landschaft bevölkern, mit Ligand-bindenden Untergruppen von GPCR Konformationen zu stabilisieren. Während verschiedene Techniken, einschließlich Kristallographie, NMR und Fluoreszenzspektroskopie und Massenspektrometrie sind verfügbar , um die GPCR Konformationsänderung Landschaft zu untersuchen, gibt es einen Mangel von Ansätzen ihre funktionelle Bedeutung in Effektor Auswahl 7 zu erläutern. Hier beschreiben wir eine Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte Ansatz G-Protein-selektive GPCR Konformationen zu erkennen. FRET stützt sich auf die Nähe und die parallele Ausrichtung von zwei Fluorophore mit überlappenden Emissions (Donor) einnd Anregung (Akzeptor) Spektren 8. Als Donor und Akzeptor - Fluorophore kommen einander näher als Ergebnis entweder Konformationsänderung im Protein oder ein Protein-Protein - Wechselwirkung erhöht die FRET zwischen ihnen, und 8 mit einer Reihe von Verfahren gemessen werden. FRET-basierten Biosensoren wurden 9 ausführlich in der GPCR - Bereich eingesetzt. Sie wurden durch Einfügen Donor und Akzeptor in der dritten intrazellulären Schleife und GPCR C-Terminus in der GPCR Sonde Konformationsänderungen verwendet; Sensoren wurden durch getrennte Markierung des GPCR und Effektorzellen (G - Protein - Untereinheiten / Arrestine) mit einem FRET - Paar 10 zur Sonde GPCR und Effektor - Wechselwirkung entwickelt; Einige Sensoren auch Konformationsänderungen in dem G - Protein 11 erfassen. Diese Biosensoren haben das Feld aktiviert eine Vielzahl von offenen Fragen zu stellen , einschließlich Konformationsänderungen in der GPCR und Effektorzellen, GPCR-Effektor - Wechselwirkung Kinetik und allosterische Liganden 12. Unsere Gruppewar besonders daran interessiert, einen Biosensor zu schaffen, die G-Protein-spezifischen GPCR Konformationen unter Agonisten getriebenen Bedingungen erkennen konnte. Dieser Biosensor beruht auf einer neu entwickelten Technologie SPASM (systematische Protein - Affinitätsstärke Modulation) 13 genannt. SPASM beinhaltet Tethering die Interaktion Proteindomänen ein ER / K-Linker mit, die ihre wirksamen Konzentrationen kontrolliert. Flankierend den Linker mit einem FRET - Paar von Fluorophoren schafft ein Werkzeug , das den Zustand der Wechselwirkung zwischen Proteinen 12 mitteilen. Zuvor 1 wurde das SPASM Modul verwendet , um die G &amp; agr; C-Terminus mit einem GPCR anbinden und überwachen ihre Wechselwirkungen mit FRET Fluorophore, mCitrine (bezeichnet in diesem Protokoll , das von seiner allgemein bekannten Variante Yellow Fluorescent Protein (YFP), Anregungs- / Emissions - Peak bei 490/525 nm) und mCerulean (bezeichnet in diesem Protokoll, das von seiner allgemein bekannten Variante Cyan Fluorescent Protein (GFP), Anregungs- / Emissions-Peak 430/475 nm). Vom N- zum C-Terminus, tseine genetisch kodierte einzelnes Polypeptid enthält: ein in voller Länge GPCR, FRET-Akzeptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K-Linker, FRET-Donor (mCerulean / CFP) und der G &amp; agr; C-Terminus-Peptid. In dieser Studie Sensoren sind als GPCR-Linker-Länge-G &amp; agr; Peptid abgekürzt. Alle Komponenten werden von einer unstrukturierten (Gly-Ser-Gly) 4 Linker getrennt , die eine freie Drehung jeder Domäne ermöglicht. Die detaillierte Charakterisierung solcher Sensoren wurde durchgeführt , die zuvor zwei prototypische GPCRs mit: β 2 -AR und Opsin 1. Dieser Sensor ist transfiziert transient in HEK-293T-Zellen und Fluorometer basierten lebenden Zellen Experimente messen Fluoreszenzspektren des FRET-Paares in willkürlichen Einheiten der Zählungen pro Sekunde (CPS) in Gegenwart oder Abwesenheit eines Liganden. Diese Messungen werden verwendet , um ein FRET - Verhältnis zwischen den Fluorophoren (YFP max / CFP max) zu berechnen. Eine Änderung in der FRET (ΔFRET) wird dann durch Subtraktion des durchschnittlichen FRET-Verhältnis berechnetder unbehandelten Proben aus dem FRET Verhältnis von Ligand behandelten Proben. ΔFRET kann über Konstrukte (β 2 -AR-10 nm-Gαs Peptid im Vergleich zu ß 2 -AR-10 nm-kein Peptid) verglichen werden. Hier stellen wir ausführlich das Protokoll, um diese Sensoren in Live-HEK-293T-Zellen exprimieren, überwachen deren Ausdruck und die Einrichtung, Durchführung und Analyse des Fluorometers-basierten Live-Cell-FRET-Messung für unbehandelte gegen Arzneimittel-behandelten Bedingungen. Während dieses Protokoll für den β 2 -AR-10 nm-Gαs Peptidsensor mit 100 &amp; mgr; M Isoproterenol Bitartrat spezifisch ist, kann es für verschiedene GPCR-G &amp; agr; Paare und Liganden optimiert werden.

<table><tbody><tr><td>B2-AR-10 nm-Gaspeptid-Sensor</td><td>Addgene</td><td>47438</td><td>https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td></tr> <tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Fermentas/Fisher Sci</td><td>FERK0503</td><td>Eluieren in 2 mM Tris-Elutionspuffer</td></tr><tr><td>HEK-293T-Flp-n-Zellen</td><td>Life Technologies</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM- hoher Glukosegehalt</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Warmer In&nbsp; 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>FBS, zertifiziert, hitzeinaktiviert, US-amerikanischer Ursprung</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>MT25060CL</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Reduziertes Serummedium; Vor Gebrauch auf RT bringen</td></tr><tr><td>XtremeGene HP Transfektionsreagenet</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Sehr empfohlen für seine Konsistenz. Vor Gebrauch auf RT bringen</td></tr><tr><td>FluoroMax 4</td><td>Horiba</td><td></td><td>Verwendung mit der FluorEssence V3.8 Software</td></tr><tr><td>3 mm Weglänge Quarzküvette</td><td>Starna</td><td>NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td><td>Möglicherweise Küvettenhalter/Adapter für die Verwendung in Fluorometern erforderlich, erhältlich ab Starna</td></tr><tr><td>Sc100-S3 Beheizte Umwälzwasserbadpumpe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-826</td><td>Warm auf 37 &Grad; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Thermomixer Heizblock</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>Warm auf 37 > C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Ultrareine DNA/RNAsefreies Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>10977015</td><td>Anwendung bei RT</td></tr><tr><td>D(+)-Glukose, wasserfreies</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin aus der Rinderlunge</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin, Hemisulfat</td><td>EMD</td><td>10-897</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure, Reagenzqualität</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>(-)- Isoproterenol (+)-Bitartrat</td><td>Sigma</td><td>I2760</td><td>Bei jedem Experiment frisches Aliquot verwenden</td></tr></tbody></table>

g-protein-selektive gpcr konformationen gemessen mit fret-sensoren in einer live cell suspension fluorometer assay

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte Studien immer häufiger bei der Untersuchung von GPCR-Signal geworden sind. Unsere Arbeitsgruppe entwickelte ein intramolekularen FRET-Sensor die Wechselwirkung zwischen Ga-Untereinheiten und GPCRs in lebenden Zellen nach Agonist Stimulation zu erkennen. Hier stellen wir ausführlich das Protokoll für die Veränderungen in der FRET zwischen dem β 2 -adrenergen Rezeptor und dem Gαs C-Terminus - Peptid bei der Behandlung mit 100 &amp; mgr; M Isoproterenolhydrochlorid Erfassen gekennzeichnet zuvor 1. Unsere FRET-Sensor ist ein einzelnes Polypeptid, das aus seriell von einer Volllängen-GPCR, einem FRET-Akzeptor-Fluorophor (mCitrine), eine ER / K SPASM (systematische Protein-Affinitätsstärke modulation) Linker, einem FRET-Donor-Fluorophor (mCerulean) und eine G &amp; agr; C -terminalen Peptid. Dieses Protokoll wird ausführlich Zellpräparation, Transfektionsbedingungen, Geräte-Setup, Testausführung und Datenanalyse. Dieses experimentelle Design erkennt kleine changes in FRET indikativ für Protein-Protein-Wechselwirkungen und kann auch verwendet werden, die Stärke der Interaktion zwischen den Liganden und GPCR-G-Protein-Paarungen zu vergleichen. Um das Signal-Rausch-in unseren Messungen zu verbessern, Dieses Protokoll erfordert erhöhte Präzision in allen Schritten, und wird hier präsentiert, um reproduzierbare Durchführung ermöglichen.

Eine verallgemeinerte schematische Darstellung des Versuchsaufbau und die Ausführung ist in Abbildung 3 beschrieben. Um eine FRET Änderung in dem schmalen Dynamikbereich des Sensors zu erfassen, ist es entscheidend für die Nuancen des Systems anhaften einzuhalten. Zellqualität ist zwingend notwendig , um die Proteinexpression sowie die Konsistenz bei der Probenahme. Abbildung 1 zeigt Bilder von kultivierten Zellen in einer konsistenten einschichtigen (10X) w...

Einfache Methoden zum Nachweis der selektiven Aktivierung von G-Proteinen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren stellen nach wie vor eine herausragende Herausforderung bei der zellulären Signalübertragung dar. Hier wurden Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) Biosensoren entwickelt, indem ein GPCR an G-Proteinpeptide paarweise gebunden wurde, um Konformationsänderungen bei kontrollierten Konzentrationen in lebenden Zellen zu untersuchen.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Das übergeordnete Ziel dieses Live-Cell-Förster-Resonanz-Energietransfer- oder FRET-basierten Assays besteht darin, G-Protein-selektive Konformationen von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) unter verschiedenen Agonistenbedingungen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im GPCR-Bereich zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Wechselwirkungen von GPCRs mit unterschiedlichen Effektoren sowie der Wirkung verschiedener Arzneistoffe auf die Rezeptorkonformation. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Sensoren modular sind und problemlos für verschiedene Kombinationen aus GPCRs und G-alpha-Peptiden neu konstruiert werden können, einschließlich des vollständigen G-alpha-Untereinheit. Obwohl diese Methode Einblicke in die G-Protein-Auswahl und die Reaktion auf verschiedene Liganden ermöglichen kann, kann sie auch verwendet werden, um die physiologischen Folgen einer differenziellen G-Protein-Aktivierung zu untersuchen. Vor Beginn des Verfahrens kultivieren Sie die Zellen des Interesses in vollständigem Medium bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit fünf Prozent Kohlendioxid, bis die Kulturen Konfluenz erreichen.Als Nächstes lösen Sie die Zellen mit Trypsin ab und passagieren Sie die Kulturen mit acht mal 10 hoch fünf Zellen pro Zelle in zwei Milliliter Medium in sechswelligen, zellkulturgeeigneten Platten für 16 bis 20 Stunden. Nach 16 bis 20 Stunden bereiten Sie im biologischen Sicherheitswerkbank einen Transfektionsansatz pro Vertiefung vor, sobald die Zellen an den Platten angeheftet sind, und lassen Sie die Reagenzgemische 15 bis 30 Minuten lang äquilibrieren. Am Ende der Inkubation geben Sie je einen Ansatz tropfenweise über die gesamte Vertiefung jeder Zellkultur hinzu.Die Platte vorsichtig schütteln, um eine gleichmäßige Verteilung des Reagenz in den Kulturen sicherzustellen. Anschließend die Platte in den Zellkultur-Inkubator zurückstellen. Nach 20 Stunden die Kulturen auf die Proteinausprägung der Plasmamembran und den Zellzustand untersuchen.Wenn eine erhebliche Internalisierung des Proteins beobachtet wird, überwachen Sie die Transfektion, bis eine signifikante Expression an der Plasmamembran nachgewiesen wird. Die Beurteilung des Proteinausmaßes ist entscheidend für einen optimalen experimentellen Aufbau. Wenn die Zellen schlecht transfiziert wurden oder die Proteinausprägung zu gering ist, warten Sie mit der Gewinnung der Zellen.Andernfalls kann das fluoreszierende Signal für die Analyse unzureichend sein. Wenn die Zellen bereit zum Ernten sind, überführen Sie sie in den Sicherheitswerkbank und entfernen vorsichtig ein Milliliter Medium. Lösen Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette in einem Milliliter des verbleibenden Mediums pro Vertiefung auf und überführen Sie die Zellsuspensionen in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Zählen Sie die Zellen und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation. Entfernen Sie das Medium vom Zellpellet. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter Zellpuffer bei 37 Grad Celsius und wiederholen Sie die Zentrifugation.Suspendieren Sie das Pellet nach der zweiten Zentrifugation in frischem Zellpuffer mit einer Konzentration von vier mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie anschließend 90 Mikroliter Kontrollzellen in eine Küvette und nehmen Sie das Kontroll-FRET-Spektrum auf. Nach der Aufnahme von drei bis fünf wiederholten Kontrollspektren mit jeweils frischen 90 Mikrolitern Zellen pro Messung, wiederholen Sie die Suspendierung, Zentrifugation und Waschschritte für transfizierte Zellen.Geben Sie jeweils 90 Mikroliter der transfizierten Zellen in jedes 500-Mikroliter-Röhrchen in den Haltern zwei bis sechs sowie acht bis 12 im Wärmeprobeblock, wobei die Zellen zwischen jeder Portion vorsichtig resuspendiert werden. Sobald alle Zellen übertragen wurden, fügen Sie 10 Mikroliter Puffer ohne Wirkstoff zu den Röhrchen zwei bis sechs für die unbehandelten Proben hinzu. Anschließend geben Sie 10 Mikroliter der einmillimolaren Wirkstofflösung in Röhrchen acht. Starten Sie einen Timer, der von 10 Minuten herunterzählt, und verwenden Sie eine P200-Pipette, um den Inhalt des Reaktionsgefäßes vorsichtig zu mischen. Schließen Sie das Reaktionsgefäß nach dem Mischen und stellen Sie es zurück auf den Heizblock. Danach nehmen Sie sofort das zweite Reaktionsgefäß auf.Mischen Sie den Inhalt vorsichtig mit einer neuen Pipettenspitze. Geben Sie 90 Mikroliter der transfizierten Zellsuspension in die Küvette der unbehandelten Bedingung und platzieren Sie die Küvette in das Fluorometer. Nehmen Sie das FRET-Spektrum der Probe mit denselben Parametern auf wie für die Kontrollspektren.Bei neun Minuten und 10 Sekunden geben Sie 10 Mikroliter der einmillimolaren Wirkstofflösung in Reagenzglas neun. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig und stellen Sie das Reagenzglas anschließend zurück in den Heizblock. Danach nehmen Sie unverzüglich Reagenzglas drei auf und mischen und messen Sie den Inhalt der Küvette, wie zuvor für Reagenzglas zwei gezeigt.Bei fünf Minuten und 10 Sekunden vorsichtig das Reagenzglas acht mit einer P200-Pipette mischen. 90 Mikroliter der Zellsuspension in eine separate Küvette für die Messung der mit Wirkstoff behandelten Probe geben und das FRET-Spektrum für die Probe unter Wirkstoffbedingungen aufnehmen. Nachdem alle Spektren aufgenommen wurden, die Projektdateien speichern.Spülen Sie die Küvetten gründlich mit ultrareinem Wasser aus und füllen Sie die Röhrchen für die nächste Bedingung wieder auf. In diesem Bild ist eine homogene Zellkultur-Monoschicht dargestellt, die optimal für die Aussaat in sechs-Well-Platten und die Transfektion geeignet ist. Solche Zellen, die in klumpigen Mustern wachsen und zu dendritischen Formen führen, werden jedoch nicht für eine gleichmäßige Aussaat und eine zuverlässige Analyse der Proteinausprägung oder FRET-Messungen empfohlen.Die Transfektionsbedingungen können ebenfalls optimiert werden, um eine reproduzierbare Expression zu erzielen. Sobald alle Daten gesammelt und zur Analyse in eine CSV-Datei eingetragen wurden, ähneln die erzeugten Ergebnisse diesen repräsentativen Roh- und normalisierten mittleren FRET-Spektren. Alle Roh-FRET-Spektren aus diesem repräsentativen Experiment zeigen einen glatten, ausreichenden Signal-Rausch-Abstand, der eine konsistente Datenanalyse mit minimalem Wasserpeak der Probe ermöglicht.Wenn die Daten bei 475 Nanometern normalisiert werden, wird die Anzahl der Zählungen pro Sekunde dieses Werts auf 1,0 gesetzt, und die signifikante Änderung bei der Messung von 525 Nanometern zwischen behandelten und unbehandelten Proben wird deutlich. Wenn die Proteinausprägung gering ist oder eine schlechte Transfektionseffizienz oder geringe Zelldichte in der Küvette für die Fluoreszenzmessung vorliegt, können die Rohdaten verrauscht sein, was Probleme bei der Hintergrundsubtraktion und Normalisierung verursacht und zu Spektren führt, die nicht übereinstimmen und nicht analysiert werden können. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 25 Minuten abgeschlossen werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, bei der Handhabung der Zellen in allen Schritten des Experiments vorsichtig vorzugehen. Nach diesem Verfahren kann die Technik erweitert werden, um verschiedene Rezeptor-FRET-Sensoren, verschiedene Wirkstoffe und Effektoren sowie verschiedene Zelltypen zu testen. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik zum GPCR-Feld beigetragen, wobei neuere Studien mit diesen Sensoren Einblicke in den molekularen Mechanismus der G-Protein-Auswahl ermöglicht haben.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man spezifische GPCR-Konformationen mithilfe eines Live-Cell-Tether-FRET-Konstrukt-Messassays bewerten kann. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Säugerzellkulturen und bestimmten experimentellen Wirkstoffen äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild-Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines FRET-basierten Proximity Assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Hier beschreiben wir detailliert Live Cell Imaging Verfahren zur Untersuchung Chemotaxis. Wir präsentieren fluoreszenzmikroskopische Methoden zur raum-zeitlichen Dynamik der Signalwege bei der Migration von Zellen zu überwachen. Die Messung der Signal-Ereignisse ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie ein GPCR-Signalisierung Netzwerk Gradienten Erfassung Lockstoffe und steuert direktionale Migration von eukaryotischen Zellen erreicht.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

GPCR----Arrestin-Wechselwirkungen sind ein aufstrebendes Feld in GPCR-Medikamentenentdeckung. Genaue, präzise und einfach einzurichtende Methoden sind notwendig, um solche Wechselwirkungen in lebenden Systemen zu überwachen. Wir zeigen einen strukturellen Komplementierungstest zur Überwachung der GPCR----Arrestin-Interaktionen in Echtzeit lebenden Zellen und können auf jede GPCR erweitert werden.

Überwachung von GPCR---Arrestin1/2-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung

Da GPCRs attraktive arzneimittelfähige Ziele sind, ist das GPCR-Ligandenscreening daher für die Identifizierung von Bleiverbindungen und für Deorphanisierungsstudien unerlässlich. Im Rahmen dieser Bemühungen beschreiben wir PRESTO-Tango, eine Open-Source-Ressourcenplattform, die für die gleichzeitige Profilierung der vorübergehenden Rekrutierung von "Arrestin2" bei ca. 300 GPCRs mit einem TEV-basierten Reportertest verwendet wird.

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

Diese Studie stellt ein detailliertes Verfahren zur Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten (smFRET) an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) unter Verwendung ortsspezifischer Markierung durch unnatürliche Aminosäureinkorporation (UAA) vor. Das Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung von smFRET-Proben, Experimente und Datenanalysen.

Visualisierung der Konformationsdynamik von Membranrezeptoren mit Einzelmolekül-FRET

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Das in dieser Studie vorgestellte Protokoll veranschaulicht die Wirksamkeit des cAMP Difference Detector In Situ  bei der Messung von cAMP durch zwei Methoden. Bei einer Methode wird ein 96-Well-Plattenablese-Spektralphotometer mit HEK-293-Zellen verwendet. Die andere Methode zeigt einzelne HASM-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Echtzeit-cAMP-Dynamik in lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden cAMP-Differenzdetektor in situ

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von BRET-basierten Biosensoren zur Echtzeitmessung der G-Protein-Aktivierung in lebenden HEK293-Zellen nach Stimulation durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorliganden. Hier dienen der β2-adrenerge Rezeptor und der Cannabinoid-Typ-1-Rezeptor als Beispiele, um die Effizienz von Sensoren für mehrere G-Protein-Subtypen und über verschiedene GPCRs hinweg zu demonstrieren.

BRET-basierte G-Protein-Biosensoren zur Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivität in lebenden Zellen

Erfahren Sie, wie FRET-Sensoren in lebenden Zellen G-Protein-selektive GPCR-Konformationen unter verschiedenen Agonistenbedingungen messen. Diese modulare Methode liefert Einblicke in GPCR-Interaktionen und Arzneimittelwirkungen.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

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