High-fat Feeding Paradigm für Larval Zebrabärbling: Füttern, Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme

Das übergeordnete Ziel dieses Versuchsprotokolls ist es, Zebrafischlarven mit einer lipidreichen Mahlzeit zu füttern, die mit einem fluoreszierenden Lipidanalogon versetzt werden kann, um die Larven an die visuelle Lipidaufnahmedynamik anzupassen und die Lipidaufnahme über die Nahrung zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Stoffwechsel und Magen-Darm-Biologie zu beantworten, z. B. wie Nahrungslipide verstoffwechselt werden und wie die Nahrungsaufnahme reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass fluoreszierende Lipidanaloga effizient in diätetische Liposomen abgegeben werden können.

Die optische Klarheit der Zebrafischlarve ermöglicht es der Mikroskopie, die subzelluläre Lipidverarbeitung aufzudecken. Zu Beginn suspendieren Sie ein Milligramm pulverförmiges fluoreszierendes Lipidanalogon in zwei Millilitern 100 % Chloroform für eine Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter. Aliquotieren Sie das Analogon in Braunglasröhrchen mit Schraubverschlüssen, die mit dem Lösungsmittel kompatibel sind und eine Teflondichtung enthalten.

Bewahren Sie diese Vorräte im Gefrierschrank auf. Geben Sie 10,4 Mikroliter des 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter fluoreszierenden Lipidanalogons in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und trocknen Sie es unter einem Stickstoffstrahl, wobei Sie darauf achten, dass das Lipid nicht aus dem Röhrchen geblasen wird. Resuspendieren Sie das getrocknete Lipid sofort in fünf Mikrolitern 100%igem Ethanol, indem Sie einen Strahl an den Seiten des Röhrchens entlang pipettieren.

Fügen Sie dann 95 Mikroliter Embryomedium hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren, bis die Mischung homogen erscheint. Schützen Sie die Röhre vor Licht und lagern Sie sie bis zur Verwendung auf Eis. Um eine fluoreszierende Cholesterin-Liposomenlösung herzustellen, geben Sie genügend fluoreszierendes Cholesterin-Analogon in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, um eine Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, wenn es der Eigelbemulsion zugesetzt wird.

Trocknen Sie die Cholesterinbrühe wie zuvor unter einem Stickstoffstrahl. Resuspendieren Sie das fluoreszierende Cholesterin-Analogon sofort in 15 Mikrolitern 100%igem Ethanol bei Raumtemperatur, indem Sie einen Strahl an der Seite des Röhrchens entlang pipettieren. Und mit 85 Mikrolitern 1% fettsäurefreiem BSA und Wasser mischen.

Es ist wichtig, das fluoreszierende Lipidanalogon in Ethanol und Embryomedien vollständig zu lösen, bevor es der Eigelbemulsion zugesetzt wird, um eine homogene Verteilung des Lipids im Futter und eine gleichmäßige Verfügbarkeit für alle Larven zu gewährleisten. Schützen Sie die Tube mit Folie vor Licht und lagern Sie sie auf Eis. Um die Fütterungslösung herzustellen, geben Sie 19 Milliliter Embryomedium in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie dann ein Aliquot mit einem Milliliter Eigelb hinzu.

Wirbeln Sie die Mischung ein bis zwei Minuten lang, um eine homogene Emulsion zu erhalten. Gießen Sie die Mischung durch ein feines Sieb, um Proteinkonglomerate zu entfernen, und sammeln Sie sie in einem frischen konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes beschallen Sie die Eimischung fünfmal, eine Sekunde an, eine Sekunde aus, mit einem 1/4 Zoll konischen Mikrotip bei sechs Watt.

Wiederholen Sie das Beschallungsprogramm vier weitere Male. Dadurch entstehen die Liposomen, die nun bis zur Verwendung kontinuierlich geschaukelt werden sollten, um die Homogenität zu erhalten. Geben Sie die entsprechende Menge fluoreszierender Lipidanaloga unmittelbar nach der Beschallung zu fünf Millilitern der Liposomenmischung.

30 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit vortexen, um die fluoreszierenden Lipidanaloga in die Liposomen einzubauen. Schützen Sie die Mischung vor Licht, indem Sie das Rohr in Folie einwickeln und wieder in die Wippe legen. Geben Sie fünfzig Larven in eine Futterschale, entfernen Sie das Embryomedium und fügen Sie 5 Milliliter Futter hinzu.

Um die Nahrungsaufnahme zu fördern, wiegen Sie die Larven vorsichtig in einer inkubierten Wippe und schützen Sie sie vor Licht, wenn fluoreszierende Lipidanaloga verwendet werden. Am Ende der Fütterungsperiode waschen Sie die Larven dreimal in fünf Millilitern Embryomedium. Um die Larven zu immobilisieren, legen Sie einen Metallblock auf Eis, legen Sie ein Taschentuch darüber, um ein übermäßiges Abkühlen zu verhindern, und legen Sie die Larven dann zum Abkühlen in die Schale mit Embryomedium darauf.

Beobachten Sie die Larven bei 10x unter einem Präpariermikroskop und bestimmen Sie, welche von ihnen das Liposomenfutter gefressen haben. Larven, die Liposomen gefressen haben, haben einen verdunkelten Darm. Es ist wichtig festzustellen, ob eine Larve gefressen hat, indem nach einem verdunkelten Darm gesucht wird.

In der Regel fressen ein bis fünf Prozent der Larven nicht und könnten die Versuchsergebnisse verwirren, wenn sie nicht identifiziert und entfernt werden. Für eine langfristige Bildgebung mit hoher Vergrößerung mit einem invertierten Objektiv kühlen Sie die Larven zunächst auf einem Metallblock auf Eis. Setzen Sie eine Larve in eine Glasbodenschale und entfernen Sie das Embryomedium, indem Sie es mit einem Taschentuch reinigen.

Geben Sie einen Tropfen 42 Grad Celsius Low Melt 1,2% Agarose auf die Larve und positionieren Sie sie sofort mit einem Schürhaken. Nehmen Sie die Form aus dem kalten Block und lassen Sie die Agarose zwei bis drei Minuten ziehen. Fügen Sie schließlich eine ausreichende Menge frisches Embryomedium hinzu, um die Agarose zu bedecken und ein Austrocknen zu verhindern.

Die Proben sind nun bereit für die Bildgebung. Am Ende einer Liposomenfütterung werden mindestens 10 gewaschene Larven in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gepoolt. Entfernen Sie das Embryomedium und frieren Sie die Larven dann ein.

Wiederholen Sie den Vorgang in einem separaten Röhrchen mit 10 nicht gefütterten Larven als Kontrolle. Halten Sie die Probe auf Eis, geben Sie 100 Mikroliter Homogenisierungspuffer in jedes Röhrchen und homogenisieren Sie dann mit einem Mikrospitzen-Ultraschallgerät. Übertragen Sie das Gewebe in ein 13-Milliliter-Kulturröhrchen.

Geben Sie 375 Mikroliter ein bis zwei Chloroform zu Methanol zu jeder Homogenisierungspufferaufschlämmung. 30 bis 60 Sekunden vortexen und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie weitere 125 Mikroliter Chloroform hinzu und wirbeln Sie es 30 Sekunden lang.

Als nächstes fügen Sie 125 Mikroliter 200 Millimolar TRIS pH 7,5 hinzu, wirbeln Sie es 30 Sekunden lang vor und zentrifugieren Sie es dann fünf Minuten lang bei 2000 mal g lichtgeschützt. Entnehmen Sie die Proben vorsichtig aus der Zentrifuge, um eine Störung der einzelnen Phasen zu vermeiden. Sammeln Sie mit einer sauberen Glaspipette die untere organische Phase und geben Sie sie in ein sauberes 13-Milliliter-Glasröhrchen.

Vermeiden Sie sorgfältig die Übertragung der oberen wässrigen oder mittleren Larventrümmerphasen und entsorgen Sie sie. Trocknen Sie die organische Phase unter Vakuum bei 0,12 atmosphärischem Druck und schützen Sie sie vor Licht, wobei Sie darauf achten müssen, dass sie aufhört, sobald die Flüssigkeit verdampft ist. Resuspendieren Sie eine einzelne Probe in 10 Mikrolitern zwei zu eins Chloroform zu Methanol und spotten Sie das gesamte Probenvolumen auf eine kanalisierte Dünnschicht-Chromatographieplatte.

Wiederholen Sie den Vorgang mit den restlichen Proben und stechen Sie in gleichmäßig verteilten Abständen. Scannen Sie abschließend die Platte mit einem fluoreszierenden Plattenlesegerät. Die Untersuchung von Larven, die unter experimentellen Bedingungen mit einer Wippe gefüttert wurden, zeigt einen verdunkelten Darm, der typisch für Fische ist, die die Eigelbemulsion gefressen haben.

Nicht gefütterte Larven haben in der Regel einen klaren Darm, so dass diejenigen, die die Futternahrung während der Fütterungszeit nicht konsumiert haben, leicht zu unterscheiden sind. Eine Larve, die mit einem fluoreszierenden Lipidanalogon gefüttert wird, visualisiert den Transport und die Akkumulation dieses Nahrungslipids. Hier ist das Fluoreszenzsignal nach achtstündiger Fütterung in den Verdauungsorganen zu sehen.

Verschiedene Lipidanaloga werden in einzigartige Zellstrukturen eingebaut und visualisieren diese so, da sie unterschiedlich zu komplexen Lipiden metabolisiert werden. Hier markieren Fluoreszenz-C16- und C12-Analoga Lipidtröpfchen. Fluoreszenz-C5 markiert Leber- und Bauchspeicheldrüsengänge, Lipidtröpfchen, Zellmembranen und arterielle Netzwerke.

Und Fluoreszenz-C2-Analoga markiert Leber- und Bauchspeicheldrüsengänge sowie Zellmembranen. Assays zur Nahrungsaufnahme von Larven wurden verwendet, um die Fütterung von Wildtyp-Larven im Vergleich zu transgenen Larven zu untersuchen, die das Apolipoprotein A4B1 überexprimierten, und zeigten, dass die transgenen Larven über eine vierstündige Fütterung weniger fraßen als die Wildtyp-Larven. Die Zuchten wurden mit gepaarten, nicht gefütterten Kontrolllarven normalisiert.

Die Quantifizierung der Fluoreszenz von Wildtyp- und transgenen Larven, die Apo A4 nach der Fütterung überexprimieren, zeigt eine signifikant reduzierte Aufnahme durch die transgenen Larven im Vergleich zum Wildtyp. Sobald es gemeistert ist, kann das fluoreszierende Lipid-Analogfutter aus Eigelb in etwa 15 Minuten zubereitet werden. Die Nahrungsaufnahme kann von 10 bis 12 gepoolten Proben in etwa vier Stunden quantifiziert werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Larven auf Entwicklungsstörungen zu untersuchen, die die Nahrungsaufnahme beeinträchtigen können, wie z. B. ein missgebildeter Kiefer, ein unterentwickelter Darm oder eine verminderte Mobilität. Methoden wie pharmazeutische Behandlungen oder Genome Engineering können in dieses experimentelle Protokoll integriert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie bestimmte Proteine und zelluläre Signalwege die Nahrungsaufnahme und den Fettstoffwechsel regulieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher aus den Bereichen Magen-Darm-Physiologie und Zellbiologie, um den Transport und die Akkumulation von Lipiden in der Nahrung in Zebrafischlarven sichtbar zu machen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein lipidreiches Zebrafischfutter für Larven zubereitet, Larven auf Nahrungsaufnahme untersucht, Larven für Kurz- und Langzeitbildgebung montiert und die Nahrungsaufnahme quantifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Ultraschallgerät gefährlich sein kann. Während dieses Verfahrens sollte ein Gehörschutz getragen werden.