Name: High-fat Feeding Paradigm für Larval Zebrabärbling: Füttern, Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Erfahren Sie ein Hochfett-Fütterungsprotokoll für larvenale Zebrabärblinge zur Untersuchung des Lipidstoffwechsels. Diese Methode ermöglicht Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme mit fluoreszierenden Lipidanaloga.

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Die Autoren danken Meng-Chieh Shen für die Bilder, Jennifer Anderson für hilfreiche Kommentare zum Manuskript und Mitgliedern des Farber-Labors für ihre Beiträge zur Entwicklung dieser Techniken. Diese Studie wurde von NIDDK-NIH Award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker und Co-PI S.A.F.) und F32DK096786 (J.P.O.) finanziert. Dieser Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIH wieder. Zusätzliche Unterstützung wurde von der G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation für das Labor von S.A.F. und die Carnegie Institution for Science Endowment bereitgestellt.

Diese Protokolle wurden von der Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care und Use Committee (Protokoll Nr. 139) zugelassen. 1. Vorbereitung der Tiere <ol><li> Pflegen Erwachsene und Larven bei 28 ° C auf einer 14 Stunden: 10 Stunden Licht: Dunkel-Zyklus. Ziehen Erwachsene zweimal täglich mit der Schale , ohne Artemia (decapsulated, nicht-Schraffur, ab 14 dpf) und kommerzielle Mikro. </li><li> Diese Protokolle sind für den Einsatz von 6-7 dpf Larven von natürlichen Laich des AB Hintergrund gesammelt optimiert. Protokolle können für Larven anderer Altersgruppen und modifiziert werden. Nicht bieten exogene Lebensmittel vor 6 dpf. </li><li> Anästhesieren Larven mit Tricaine in Embryomedium (EM) (4,2 ml einer 4 mg / ml Tricaine pro 100 ml EM) bei Raumtemperatur (RT). </li></ol> 2. Herstellung von lipidreichen Eidotter-Feed <ol><li> Bereiten Sie und speichern Sie das Huhn Eigelb. Trennen Sie das Eigelb und Eiweiß von 12 Hühnereiern. Pool die Eigelbe, aliquoten 1 ml in 1,5ml-Röhrchen, und bei -80 ° C bis zu 1 Jahr (12 Eigelb wird ~ 80 Aliquots machen). Pool die Weißen, zu speichern und zu verwenden als Lipid armen, eiweißreiches Futter. </li><li> Bereiten fluoreszierendes Lipid analog (s) bis zu dem Eigelb Futter hinzugefügt werden, falls gewünscht. <ol><li> Hängen Sie das gekauft, pulverisierte fluoreszierende Lipid analog in 100% Ethanol oder 100% Chloroform bei 0,1 ug / ul (siehe folgenden Hinweis Lösungsmittel diskutieren), aliquoten in opaken Glasröhren, Dichtung mit Parafilm und Speicher nach den Anweisungen des Herstellers. Aufgrund der schnellen Verdampfung von organischen Lösungsmitteln nicht aliquoten Mengen von weniger als ~ 400 &amp; mgr; l für die Langzeitlagerung verwendet werden. Hinweis: Wenn das Lipid analog in Ethanol suspendiert wird, um große Mengen des Lipid analog verwendet werden , weil es schneller unter N 2 als Chloroform trocknet. Wenn das Lipid analog in Ethanol suspendiert muss es nicht, bevor es an das Liposom Futter in Schritt 2.2.4 getrocknet und resuspendiert werden, das Hinzufügen, aber die Gesamtethanolkonzentration nicht 0 überschreiten sollte.1% in der Liposom-Zufuhr potentiell verwirrende physiologischen Wirkungen von Ethanol zu vermeiden. </li><li> Für fluoreszierende Fettsäure-Analoga: Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 20 ml 5% Eigelb-Emulsion in EM. Von der Vorbereitung 5 - ml - Aliquots mit einer Endkonzentration von 6,4 &amp; mgr; M 4,4-Difluor-4-bora-3a, 4a-Diaza-s-Indacen- (BODIPY C 16) für die Live - konfokale Bildgebung und die Nahrungsaufnahme Assays oder 1 &amp; mgr; g / ml BODIPY C 12 für Stereoabbildung. Übertragen, um die gewünschte Menge des fluoreszierenden Lipids analogen in ein 1,5 ml-Kunststoffröhrchen. Trocknen Sie das Lipid unter einem Strom von N 2, kümmert sich nicht um das Lipid aus dem Rohr zu blasen. </li><li> Sofort Resuspension in 5 ul 100% Ethanol durch einen Strom Pipettieren an den Seiten des Rohres, fügen Sie 95 ul EM, und gut mischen. Hinweis: Die Mischung homogen erscheinen soll; wenn farbige Lipid an den Seiten des Röhrchens bleibt oder die Flüssigkeit erscheint clumpy hat das Lipid nicht vollständig solubilisiert und Ethanol erfordert. Schützen Sie den Schlauch herm Licht und auf Eis lagern. </li><li> Für fluoreszierende Cholesterin analog: eine endgültige Konzentration von 2,4 ug / ml Cholesterin in 5 ml 0,5-5% Eigelb-Emulsion für Live-Imaging-Studien vorzubereiten. Übertragen, um die gewünschte Menge an Cholesterin in einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen. Trocknen Sie das Lipid unter einem Strom von N 2, kümmert sich nicht um das Lipid aus dem Rohr zu blasen. </li><li> Unmittelbar, resuspendieren in 15 ul RT 100% Ethanol , indem ein Strom an den Seiten des Röhrchens pipettiert und mit 85 ul RT 1% fettsäurefreies BSA in gereinigtem H 2 O mischen Schützen Sie das Rohr vor Licht und lagern auf dem Eis. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Eidotter Liposom-Feed. <ol><li> Fügen Sie eine aufgetaute Aliquots von Eigelb EM in einem 50 ml konischen Röhrchen. Vortex die verdünnte Eigelbmischung für 1-2 min; Die Mischung sollte eine homogene Emulsion zu sein scheinen. </li><li> Gießen Sie die Mischung durch ein Sieb feinmaschigen Protein Konglomerate zu entfernen und sammeln sich in einem neuen, frischen 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Pulse sonicate die Ei-Mischung mit einem ein Viertel Zoll verjüngte microtip (5-mal (5 x 1 sec, 1 sec aus) pausieren 5-10 sec zwischen jedem Satz; Ausgangsintensität: 6 W) bei RT Liposomen zu erstellen. Sonicator Leistungseinstellungen sind Instrument abhängig und deshalb eine Optimierung für jedes Instrument und microtip erfordern. Hinweis: Kontinuierlich Liposomenmischung rocken bei RT Homogenität bis zum Gebrauch aufrechtzuerhalten. </li></ol></li><li> Fügen Sie die fluoreszierenden Lipids analog zu den Eigelb-Liposome, falls gewünscht. Unmittelbar nach der Ultraschallbehandlung pipettieren die vorbereiteten Lipide in dem Liposom Mischung und vortex bei hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden in die Liposomen zu inkorporieren. Schützen Sie die Mischung aus Licht, das durch das Rohr in Folie wickeln und weiter bei RT zu schaukeln. </li></ol> 3. Fütterung Paradigm <ol><li> Bereiten Sie die Larve für Füttern. <ol><li> Vor dem Futter zu Beginn Bildschirm Larven auf offensichtliche morphologische Defekte, die Fütterung behindern. Transfer Larven bis 60 mm x 15 mm Petrischalen oder 6- oder 12-Well-plaTES, reduzieren EM auf ein Minimum, und mit 5 ml der hergestellten Liposomenlösung ersetzen. </li><li> Bei Bedarf übertragen unfed Kontrollarven bis 5 ml EM und / oder 5 ml 5% Eiweiß in EM und parallel zu behandeln. </li></ol></li><li> Schütteln Sie die Larven in einem inkubiert Wippe (29-31 ° C bei 30 Umdrehungen pro Minute) während der gesamten Futternahrungsaufnahme zu fördern und gleichzeitig weiterhin von Licht abzuschirmen, wenn fluoreszierende Lipid-Analoga vorhanden sind. Wenn Larven Notwendigkeit Licht ausgesetzt werden, minimieren die Belichtung mit einer getönten Glas Inkubator Abdeckung. </li><li> Am Ende der Fütterungsperiode, spülen Sie die frei schwimmenden Larven in EM 3 mal. Anmerkung: Die Larven beginnen Liposomen an einem beliebigen Punkt während des Vorschubs raubend. Wenn es wichtig ist, dass Larven zur gleichen Zeit beginnen Fütterung, Bildschirm für die Nahrungsaufnahme (siehe 3.4) nach 1 Stunde der Fütterung und zurück nur Larven, die begonnen haben, auf die Eigelb-Emulsion Zuführen des Futter abzuschließen. </li><li> Bildschirm, um die Larven zu diesem Zeitpunkt für die Nahrungsaufnahme als kleine Zahl kann nicht eat (in der Regel ~ 0-5%). Untersuchen den Darm der Larven , die anästhesiert wurden oder leicht abgekühlt auf einem Metallblock auf Eis , um zu bestimmen , ob sie eingespeist wurden: Larven , die Liposomen verbraucht wird einen abgedunkelten Darm aufweisen (Abbildung 1). </li><li> Bild oder Prozess Larven für die Nahrungsaufnahme sofort. Alternativ Ort Larven in frischen EM und bei 28 ° C inkubieren metabolische Verarbeitung auftreten zu lassen. </li></ol> 4. Larvae Montage für Live-Imaging <ol><li> Bereiten Sie die Montage Medien. <ol><li> Für 3% Methylcellulose: 0,75 g Methylcellulose zu 25 ml in der Nähe siedende EM, Wirbel, Felsen bei RT 2-3 Tage, bis sie vollständig gelöst und bei 4 ° C über Jahre bei -20 ° C hinzufügen. Wiederholte Zyklen von Einfrieren und Auftauen bei 4 ° C Luftblasen zu entfernen. Lagern Sie 3% Methylcellulose auf Eis, während Larven Montage. </li><li> Für 1,2% niedrig-Mount-Agarose: add 0,3 g niedrigschmelzende Agarose zu 25 ml EM und lösen sich durch zum Kochen zu bringen, aliquoten in 2 ml tUBEs und auf einem Heizblock bei 26-28 ° C halten. Unused Aliquots können bei RT oder 20 ° C und kochte erneut zum Zeitpunkt der Verwendung gelagert werden. Achten Sie darauf, dass Agarose kühl genug ist, vor der Belichtung zu Larven zu handhaben oder sie können überheizt. </li></ol></li><li> Für Low-Vergrößerung, mittleren Durchsatz Live-Bildgebung, einen Glasobjektträger auf einem Gewebe auf einem Metallblock auf Eis und warten, bis die Folie zu kühlen. Tragen Sie eine großzügige Menge von 3% Methylcellulose (die bei 4 ° C auf Eis gehalten wurde) auf den Objektträger, übertragen eine Larve auf die 3% Methylcellulose, mit einer Angelschnur Poker (0,41 mm Durchmesser Angelschnur auf den aufgeklebten Ende eines Kapillarrohrs Glas) schaffen eine troth überschüssige EM abzulassen (so dass Methylcellulose wird nicht verdünnt) und die Larven positionieren, wie gewünscht. </li><li> Für kurzfristige (&lt;20 min), hoher Vergrößerung Echtzeit-Bildgebung mit einem aufrechten Öl emersion Ziel, montieren Larven mit dem Deck lean-to-Methode. <ol><li> Verwenden Sie Cyanoacrylat basierten Klebstoff (Superglue) zuaa 22 mm x 30 mm Deckglas an einem Ende eines Glasobjektträger befestigen. Verwenden Sie einen Poker eine dünne Linie von 3% Methylcellulose zu setzen auf dem Schlitten neben dem Deckglas und übertragen Larven auf den Schlitten mit einer großen Bohrung Pasteur-Pipette. Überschüssiges EM, damit es nicht die Methylcellulose zu verdünnen. </li><li> Mit einem Poker positionieren sanft Larven in der Methylcellulose auf ihren Seiten (linke Seite bis zur Bild mehr von der Leber, der rechten Seite nach oben auf Bild, um die Gallenblase) mit ihren Köpfen neben dem Deckglas. </li><li> Spot superglue in den Ecken eines zweiten Deckglas und legen sanft eine Kante des Deckglases auf dem montierten Deckglas und die andere auf der Folie, die Larven überbrücken. Achten Sie darauf, nicht Überdruck in diesem Schritt anzuwenden oder mit dem Ziel, während Bildgebung, so dass Larven heil bleiben. </li></ol></li><li> Für langfristige, hoher Vergrößerung Bildgebung mit einem aufrechten Tauchziel, montieren Larven in Agarose. Fügen Sie eine Larve auf eine kleine Teilmenge von 1,2% niedriger Schmelz Agarose dann übertragen dieLarve in einem kleinen Volumen von Agarose zu einer Petrischale. <ol><li> Lage, schnell die Larven mit einem Poker vor dem Agarose verfestigt. Lassen Sie die Agarose für 2-3 min zu trocknen und die Agarose vollständig mit frischem EM bedecken Austrocknen zu verhindern. </li></ol></li><li> Für langfristige, hoher Vergrößerung Bildgebung mit einem invertierten Ziel, montieren Larven auf einem Glasbodenschale in Agarose. <ol><li> Kühlen Sie einen Metallblock auf dem Eis. Die Schale auf dem Metallblock durch ein Gewebe getrennt zu starke Abkühlung und Larven Einfrieren zu verhindern. Übertragen einer Larve in die Schale und nehmen Sie die EM, indem sie mit einem Gewebe Wicking. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von 28 ° C niedrigschmelzende Agarose (1,2%) an der Spitze der Larve und sofort Position mit einem Poker (linke Seite nach unten auf beste Bild der Leber, rechte Seite nach unten auf Bild der Gallenblase). Entfernen Sie Gericht aus dem kalten Block, lassen für 2-3 Minuten, um zu trocknen, und fügen Sie ein ausreichendes Volumen an frischem EM decken die Agarose (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> 5. NahrungsaufnahmeProbe <ol><li> Am Ende eines Eigelb Liposom Futter mit 6,4 uM BODIPY 16 C, Pool ein Minimum von 10 gewaschen Larven in einem Kunststoff - 1,5 oder 2 - ml - Röhrchen, entfernen EM und gefrier schnappen. Die Proben können vor Licht geschützt für mehrere Monate bei -80 ° C gelagert werden. Hinweis: Wenn möglich, sammeln Sie mehrere Replikationen. Es ist wichtig, unfed Larven in diesem Schritt zu sammeln für die Hintergrundfluoreszenz Lipid zu normalisieren (idealerweise Larven von der gleichen Kupplung verwendet werden). </li><li> Führen Sie eine modifizierte Bligh-Dyer Lipidextraktion 3,21. <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l Homogenisierungspuffer (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) auf die Probe auf Eis (alternativ gereinigtem H 2 O verwendet werden können). Homogenisieren auf Eis mit einem microtip Beschallungsgerät (5 sec gesamt: 1 s auf 1 s aus). Überprüfen Sie, dass Larven sind völlig homogenisiert; wenn nicht, wiederholen. Transfer in ein 13-ml-Einwegglaskulturröhrchen (andere Glasröhren verwendet werden). Hinweis: Chloroform ist gefährlich; führen alle nachfolgenden Lipid-exTraktionsschritte bei RT in einer chemischen Haube. </li><li> Für jeweils 100 &amp; mgr; l verwendet Homogenisierungspuffer, fügen 375 ul 1: 2 (Chloroform: Methanol). Vortex 30-60 sec, Inkubation 10 min, fügen Sie 125 ul Chloroform pro 100 ul verwendet Homogenisierungspuffer, und Vortex 30 Sekunden. </li><li> In 125 ul 200 mM Tris pH 7,5 pro 100 ul Homogenisierungspuffers verwendet, Wirbel 30 sec, und Zentrifuge (2000 x g, 5 min, RT, lichtgeschützt). Entfernen Sie vorsichtig die Proben aus der Zentrifuge. Sie werden in zwei Phasen getrennt werden: eine obere Phase wäßrig ist, über eine Schnittstelle von larvalen Schutt, und eine untere organische Phase (enthält Lipide). </li><li> Mit einem sauberen Glaspipette den Boden, organische Phase sammeln und übertragen sie in ein sauberes 13 ml Glasröhrchen. Hinweis: Achten Sie auf die wässrige Phase und Larven Trümmer an der Schnittstelle zu vermeiden; wenn Verunreinigungen auftreten, Zentrifugationsschritt und recollect wiederholen. Entsorgen Sie die obere, wässrige Phase; kann es hilfreich sein, dies zu entfernen und zu entsorgenPhase vor der organischen Phase zu sammeln. Die Probe kann bis zu 1 Monat bei -80 ° C gelagert werden. </li><li> Die organische Phase wird unter Vakuum (0,12 atm), während sie von Licht zu schützen. Machen Sie nicht weiter um die Proben zu trocknen, nachdem die Flüssigkeit verdampft ist, wie es Lipidlöslichkeit reduzieren. Resuspendieren der Lipide in 2: 1 (Chloroform: Methanol) und auf Eis lagern. Das optimale Volumen der Chloroform: Methanol-Lösung hängt von dem Nachweisverfahren verwendet wird; beginnen niedrig und weiterhin nach Bedarf zu verdünnen. Eine allgemeine Richtlinie ist 10 &amp; mgr; l für 10 gepoolten Larven zu verwenden. </li></ol></li><li> Finde die gesamte Probenvolumina in gleichmäßigen Abständen auf eine DC - Platte kanalisiert und scannen Sie die Platte mit einem Laserscanner routinemäßig für biomolekulare Bildgebung verwendet (zB ein Fluoreszenzplattenleser). Für die fluoreszierende Lipid-Analoga in der Materialliste enthalten, die eine Anregungsmaxima von 500 bis 650 nm und Emissionsmaxima von 510 bis 665 nm haben, verwenden Sie einen 488-nm-Laser und mit Emissions Sammlung bei 520 nm. <ol><li> Quantifizierung der Gesamtfluoreszenz von jedem Ort mit Imaging-Software. Hinweis: Richtige für natürlich durch Subtraktion der Fluoreszenz gepaart, ungefüttert Larven Proben Hintergrund Lipid Fluoreszenz auftritt. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die hier beschriebenen Techniken können Forscher Larven Zebrabärbling mit einer lipidreichen Futter, zu visualisieren diätetischen Lipid Verarbeitung in lebenden Larven und quantifizieren Larven die Nahrungsaufnahme zu behandeln. Um den Erfolg sicherzustellen, sollte besonderes Augenmerk auf einige kritische Schritte gegeben werden. Kommerzielle Hühnereier variieren; mögliche Variabilität zu minimieren, führen wir alle Tests auf Bio-Eier aus Käfigfreie Hühner, die nicht für Omega-3-Fettsäuren angereichert haben. Niedrig...

Die Mechanismen, mit denen der Darm Nahrungslipid Verarbeitung reguliert, steuert die Leber komplexe Lipidsynthese und Lipoprotein-Metabolismus und wie diese Organe mit dem zentralen Nervensystem arbeiten Nahrungsaufnahme zu steuern, sind nicht vollständig verstanden. Es ist der biomedizinischen Interesse, diese Biologie in Anbetracht der aktuellen Epidemien von Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf- Erkrankungen aufzuklären, Diabetes und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung. Studien in der Zellkultur und Mäusen haben die Mehrheit der unser Verständnis der mechanistischen Beziehungen zwischen Nahrungslipiden und Krankheit, und Zebrabärbling (Danio rerio) sind , sich als ideales Modell zur Verfügung gestellt , diese Arbeit zu ergänzen. Zebrabärblinge haben ähnliche gastrointestinale (GI) Organe, den Fettstoffwechsel und Lipoprotein Transport zu den höheren Wirbeltieren 1,2, entwickeln sich schnell und sind genetisch manipulierbaren. Die optische Klarheit des Larven Zebrabärbling erleichtert in vivo - Studien, eine particular Vorteil für das Studium des GI - System als extrazelluläre Milieu (dh, Galle, Mikrobiota, endokrine Signalisierung) ist praktisch unmöglich , zu modellieren , ex vivo. Entsprechend wird ein Körper der Forschung der genetischen Lenkbarkeit und Zuträglichkeit Kombination Bildgebung von Zebrabärblingembryonen zu leben eine Vielzahl von Nahrungs Manipulationen ( mit hohem Fettgehalt 3,4, -Cholesterin 5 und Kohlenhydrat - Diäten 6,7) und Modelle von kardiovaskulären Erkrankungen 8, Diabetes 9,10, Hepatosteatose 11-13 und Fettleibigkeit 14-16, entstehen eine Vielzahl von metabolischen Erkenntnisse zur Verfügung zu stellen. Ein wesentlicher Aspekt der Larven Zebrabärbling in Stoffwechselforschung des Übergangs ist die Optimierung der in anderen Modelltiere auf den Zebrabärbling und die Entwicklung neuer Assays entwickelt Techniken, die die einzigartigen Stärken der Zebrabärbling nutzen. Dieses Protokoll stellt Techniken entwickelt und optimiert Larven Zebrabärbling zu füttern ein lipid-reiche Mahlzeit, zu visualisieren diätetischen Lipid Verarbeitung von ganzen Körper zu subzellulärer Auflösung, und die Nahrungsaufnahme zu messen. Chicken egg yolk wurde gewählt, um die lipidreichen Mahlzeit zu schreiben, da es ein hohes Maß an Fetten und Cholesterin enthält (Lipide komponieren ~ 58% der Hühner Eigelb, von denen ca. 5% Cholesterin, 60% Triglyceride sind, und 35% sind Phospholipide ). Chicken egg yolk bietet mehr Fett als typische kommerzielle Zebrabärbling Mikropellet Lebensmittel (~ 15% Lipide) und dem Vorteil , dass es eine standardisierte Feed mit bekannten Prozentsätze der spezifischen Fettsäuren Art ist, wie Zebrabärbling Diäten und Fütterungs Regimenter nicht über labs 17 standardisiert. Darüber hinaus visualisieren fluoreszierende Lipid - Analoga im Eigelb zur Verfügung gestellt Transport und Akkumulation von Nahrungslipiden 18, Bild Zellkomponenten einschließlich Lipidtröpfchen , die durch die beiden als Vitalfarbstoffe 3 und durch kovalente Einbindung in komplexe Lipide wirken, untersuchen Stoffwechsel durch Dünnschichtchromatographie (TLC) 19 </sup&gt; Und Hochleistungs - Flüssigchromatographie (HPLC) (nicht veröffentlichte Daten SAF) und einen quantitativen Assay für die Gesamtnahrungsaufnahme 20 bereitzustellen.

<table><tbody><tr><td>Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulofnatsalz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anästhesie für Zebrafischlarven</td></tr><tr><td>Hühnereier</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Organische, käfigfreie Eier, nicht angereichert mit Omege-3-Fettsäuren</td></tr><tr><td>Ultraschallprozessor 3000 Ultraschallgerät</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>Zur Herstellung von Eigelb-Liposomen</td></tr><tr><td>Sonabox Akustikgehäuse</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>Zur Herstellung von Eigelb-Liposomen</td></tr><tr><td>1/8" konische Mikrospitze</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>Zur Herstellung von Eigelb-Liposomen</td></tr><tr><td>Braune Fläschchen (4 ml, Glas)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Lipidspeicher; umfasst Fläschchen, offene Kappen und Kappensepten</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Inkubationsschüttler für Futtermittel</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Fluoreszierendes Lipid-Analogon; (4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-hexadecansäure)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Fluoreszierendes Lipid-Analogon; (4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-dodecansäure)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Fluoreszierendes Lipid-Analogon; (4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-pentansäure)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Fluoreszierendes Lipidanalogon; (4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionsäure)</td></tr><tr><td>TopFluor Cholesterin&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Fluoreszierendes Lipidanalogon; 23-(Dipyrromethenbordifluorid)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>Fettsäurefrei BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>Für die TopFluor-Cholesterin-Solubilisierung</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Eindeckmedien für die Bildgebung lebender Larven; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Low Melt</td><td>Agarose Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Eindeckmedien für lebende Larven Bildgebung; 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR Objektträger&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Montieren von Larven für Live-Imaging</td></tr><tr><td>Deckgläser&nbsp;</td><td>Deckglas</td><td>12-544A</td><td>Einbettlarven für Live-Aufnahmen</td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Einbettlarven für Live-Aufnahmen</td></tr><tr><td>Fluorschale (Glasbodenschale)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Einbettlarven für Live-Imaging; 35 mm Schale, 23 mm Glas, 0,17 mm Glasstärke&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Mikroskop für Live-Aufnahmen mit hoher Vergrößerung</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Mikroskop für Live-Aufnahmen mit geringer Vergrößerung</td></tr><tr><td>Glaskulturröhrchen</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Lipid-Extraktion; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Lipidextraktion</td></tr><tr><td>Kanalisierte DC-Platten</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Assay für die Nahrungsaufnahme; LK5D Kieselgel 150 A, 20 x 20 cm, 250 μm dick; Eingestellte</td></tr><tr><td>kanalisierte DC-Platten</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Probe der Nahrungsaufnahme; Direkter Ersatz für Whatman Scientific DC-Platten</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Fluoreszenzplatten-Reader für Lebensmittelaufnahme-Assay</td></tr><tr><td>ImageQuant-Software</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analyse von Lebensmittelaufnahme-Assay</td></tr><tr><td>5 3/4' Einweg-Pasteurpipetten aus Borosilikatglas mit breiter Bohrung&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Übertragung von Larven</td></tr></tbody></table>

high-fat feeding paradigm für larval zebrabärbling: füttern, live-imaging und quantifizierung der nahrungsaufnahme

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafische entwickeln sich zu einem Modell für die Verarbeitung von Nahrungslipiden und Stoffwechselkrankheiten. Dieses Protokoll beschreibt, wie Zebrafischlarven mit einer lipidreichen Mahlzeit gefüttert werden, die aus einer Emulsion von Hühnereigelb-Liposomen besteht, die durch Beschallung von Eigelb in Embryomedien hergestellt wird. Es werden detaillierte Anweisungen gegeben, um Larven auf den Verzehr von Eigelb zu untersuchen, damit Larven, die sich nicht ernähren, die Versuchsergebnisse nicht verfälschen. Die Hühnereigelb-Liposomen können mit fluoreszierenden Lipidanaloga, einschließlich Fettsäuren und Cholesterin, versetzt werden, was sowohl eine systemische als auch eine subzelluläre Visualisierung der Lipidverarbeitung in der Nahrung ermöglicht. Es werden mehrere Methoden zur Montage von Larven beschrieben, die für die kurz- und langfristige Live-Bildgebung sowohl mit aufrechten als auch mit invertierten Objektiven bei hoher und niedriger Vergrößerung förderlich sind. Zusätzlich wird ein Assay zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme von Larven vorgestellt, indem die Lipide von Larven, die mit fluoreszierenden Lipidanaloga gefüttert wurden, extrahiert, die Lipide auf einer Dünnschichtchromatographieplatte aufgespottet und die Fluoreszenz quantifiziert wird. Abschließend werden kritische Aspekte der Verfahren, wichtige Kontrollen, Optionen zur Modifikation der Protokolle zur Beantwortung spezifischer experimenteller Fragestellungen und mögliche Einschränkungen diskutiert. Diese Techniken können nicht nur auf fokussierte, hypothesengetriebene Untersuchungen angewendet werden, sondern auch auf eine Vielzahl von Bildschirmen und Live-Bildgebungstechniken zur Untersuchung des Fettstoffwechsels in der Nahrung und der Kontrolle der Nahrungsaufnahme.

Wenn bei 29-31 ° C auf einer Wippe zugeführt wird, wird die Mehrheit der gesunden Larven (≥95%) innerhalb von 1 Stunde essen. Nach Erhalt der Eigelb-Emulsion aufwendig, verdunkelt sich der Larvendarm in Farbe. Sehr dunkle Darm kann bei 2 Stunden (Abbildung 1) beobachtet werden. Wenn Larven unfed sind oder zu füttern fehlschlagen, bleibt der Darm klar. Die Larven gefüttert Eiweiß zeigen einen aufgeblähten Darm-Lumen, das nicht in der Farbe nicht verdunkeln. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi...

Zebrafische entwickeln sich zu einem wertvollen Modell für die Verarbeitung von Nahrungslipiden und Stoffwechselkrankheiten. Beschrieben werden Protokolle von lipidreichem Larvenfutter, Live-Imaging von fluoreszierenden Lipidanaloga in der Nahrung und die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme. Diese Techniken können auf eine Vielzahl von Screening-, Bildgebungs- und hypothesengesteuerten Untersuchungstechniken angewendet werden.

High-fat Feeding Paradigm für Larval Zebrabärbling: Füttern, Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls besteht darin, Zebrafischlarven eine fettreiche Mahlzeit zu verabreichen, die mit einem fluoreszierenden Lipid-Analogon angereichert werden kann, um die Larven zur Visualisierung der Lipidaufnahmedynamik vorzubereiten und die Aufnahme von Nahrungslipiden zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen aus den Bereichen Stoffwechsel und Gastrointestinalbiologie zu beantworten, beispielsweise wie Nahrungslipide metabolisiert werden und wie die Nahrungsaufnahme reguliert ist. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass fluoreszierende Lipid-Analoge effizient über diätetische Liposome zugeführt werden können.Die optische Transparenz des Zebrafischlarven ermöglicht die Mikroskopie zur Darstellung der subzellulären Lipidverarbeitung. Zunächst wird ein Milligramm pulverisiertes fluoreszierendes Lipid-Analogon in zwei Milliliter 100 % Chloroform suspendiert, um eine Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter zu erhalten. Das Analogon wird in Aliquots in braune Glasröhrchen mit Schraubverschlüssen abgefüllt, die mit dem Lösungsmittel verträglich sind und eine Teflon-Dichtung enthalten.Bewahren Sie diese Bestände im Gefrierschrank auf. Geben Sie 10,4 Mikroliter der 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter fluoreszierenden Lipid-Analog-Bestandslösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und trocknen Sie unter einem Strom von Stickstoff ab, wobei darauf geachtet werden muss, das Lipid nicht aus dem Röhrchen zu blasen. Lösen Sie das getrocknete Lipid unmittelbar in fünf Mikrolitern 100%igem Ethanol durch Pipettieren eines Stroms entlang der Röhrchenwände wieder auf.Fügen Sie dann 95 Mikroliter Embryomedium hinzu und mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, bis die Mischung homogen erscheint. Schützen Sie das Gefäß vor Licht und lagern Sie es bei Bedarf auf Eis. Um eine fluoreszierende Cholesterin-Liposomenlösung herzustellen, geben Sie so viel fluoreszierendes Cholesterin-Analog-Stammlösung in ein 1,5-Milliliter-Gefäß, dass eine Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter erreicht wird, wenn es der Eigelbemulsion zugesetzt wird.Trocknen Sie den Cholesterin-Standard unter einem Strom von Stickstoff, wie zuvor. Lösen Sie das fluoreszierende Cholesterin-Analogon sofort in 15 Mikrolitern 100 % Ethanol bei Raumtemperatur auf, indem Sie einen Strom entlang der Röhrenwand pipettieren. Und mischen Sie es mit 85 Mikrolitern 1 % fettfreiem BSA und Wasser.Es ist wichtig, den fluoreszenten Lipid-Analog vollständig in Ethanol und Embryomedien zu lösen, bevor er der Eigelbemulsion zugegeben wird, um eine homogene Verteilung des Lipids im Futter und eine gleichmäßige Verfügbarkeit für alle Larven zu gewährleisten. Schützen Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie vor Licht und lagern Sie ihn auf Eis. Um die Fütterungslösung herzustellen, geben Sie 19 Milliliter Embryomedium in ein 50-Milliliter-Kegelrohr und fügen dann ein 1-Milliliter-Aliquot Eigelb hinzu.Versetzen Sie die Mischung eine bis zwei Minuten lang im Vortex, um eine homogene Emulsion zu erhalten. Gießen Sie die Mischung durch ein feines Sieb, um Proteinaggregate zu entfernen, und sammeln Sie sie in einem frischen 50-Milliliter-Konischglas. Anschließend werden die Eimischung fünfmal kurz ultraschallbehandelt (je ein Sekunde an, eine Sekunde aus) mit einer 1/4-Zoll-konischen Mikrotip bei sechs Watt.Wiederholen Sie das Beschallungsprogramm insgesamt viermal. Dadurch entstehen die Liposomen, die ab sofort bis zur Verwendung kontinuierlich geschüttelt werden müssen, um die Homogenität aufrechtzuerhalten. Geben Sie unmittelbar nach der Beschallung die geeignete Menge an fluoreszierenden Lipid-Analoga zu fünf Millilitern der Liposomenmischung hinzu.Vortexen Sie 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit, um die fluoreszierenden Lipidanaloga in die Liposomen einzubinden. Schützen Sie die Mischung vor Licht, indem Sie das Röhrchen mit Folie umwickeln, und stellen Sie es zurück auf den Schüttler. Geben Sie fünfzig Larven in eine Fütterungsschale, entfernen Sie das Embryomedium und fügen Sie 5 Milliliter Nahrung hinzu.Um die Nahrungsaufnahme zu fördern, schaukeln Sie die Larven vorsichtig in einem beheizten Schüttler und schützen Sie sie vor Licht, falls fluoreszierende Lipidanaloga verwendet werden. Am Ende der Fütterungsphase waschen Sie die Larven dreimal mit je fünf Milliliter Embryomedium. Um die Larven zu immobilisieren, legen Sie einen Metallblock auf Eis, legen ein Tuch darüber, um eine übermäßige Abkühlung zu verhindern, und geben Sie dann die Larven in die Schale mit Embryomedium darauf, um sie abzukühlen.Beobachten Sie die Larven unter dem Stereomikroskop mit 10x-Vergrößerung und bestimmen Sie, welche von ihnen die Liposomennahrung aufgenommen haben. Larven, die Liposomen aufgenommen haben, weisen einen verdunkelten Darm auf. Es ist entscheidend, die Nahrungsaufnahme der Larven durch Überprüfung auf einen verdunkelten Darm zu bestimmen.Typischerweise fressen ein bis fünf Prozent der Larven nicht und könnten die experimentellen Ergebnisse verfälschen, wenn sie nicht identifiziert und entfernt werden. Für Langzeit-Aufnahmen mit hoher Vergrößerung und einem invertierten Objektiv kühlen Sie die Larven zunächst auf einem Metallblock auf Eis ab. Überführen Sie eine Larve in eine Glasbodenkulturschale und entfernen Sie das Embryomedium durch Abwickeln mit einem Tissue. Geben Sie einen Tropfen 1,2 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt von 42 Grad Celsius auf die Larve und positionieren Sie diese sofort mit einem Pokers. Nehmen Sie die Schale vom Kälteblock und lassen Sie die Agarose zwei bis drei Minuten lang stehen. Geben Sie abschließend eine ausreichende Menge frisches Embryomedium hinzu, um die Agarose zu bedecken und Austrocknung zu verhindern.Die Proben sind nun bereit für die Bildgebung. Am Ende einer Liposomenfütterung sammeln Sie mindestens 10 gewaschene Larven in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Entfernen Sie das Embryomedium und gefrieren Sie die Larven anschließend sofort ein.Wiederholen Sie den Vorgang in einem separaten Gefäß mit 10 nicht gefütterten Larven als Kontrolle. Während die Probe auf Eis gehalten wird, 100 µL Puffer für die Homogenisierung zu jedem Gefäß hinzufügen und anschließend mit einem Mikrotip-Sonikator homogenisieren. Das Gewebe in ein 13-mL-Kulturgefäß überführen.Geben Sie 375 Mikroliter eines bis zwei Chloroform zu Methanol zu jeder Homogenisierungspuffer-Suspension hinzu. Vortexen Sie 30 bis 60 Sekunden und inkubieren Sie anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie weitere 125 Mikroliter Chloroform hinzu und vortexen Sie 30 Sekunden.Fügen Sie anschließend 125 Mikroliter 200 Millimolar TRIS pH 7,5 hinzu, wirbeln Sie 30 Sekunden lang und zentrifugieren Sie dann fünf Minuten lang bei 2000 × g, lichtgeschützt. Entnehmen Sie die Proben vorsichtig aus der Zentrifuge, um die getrennten Phasen nicht zu stören. Sammeln Sie mit einer sauberen Glaspipette die untere organische Phase und überführen Sie sie in ein sauberes 13-Milliliter-Glasröhrchen.Vermeiden Sie sorgfältig die Übertragung der oberen wässrigen oder der mittleren larvalen Trümmerphase und entsorgen Sie diese. Trocknen Sie die organische Phase unter Vakuum bei 0,12 atmosphärischem Druck, wobei Sie sie vor Licht schützen, und achten Sie darauf, den Vorgang zu beenden, sobald die Flüssigkeit verdampft ist. Resuspendieren Sie eine einzelne Probe in 10 Mikrolitern eines 2:1-Chloroform-Methanol-Gemischs und geben Sie das gesamte Probenvolumen auf eine kanalisierte Dünnschicht-Chromatographieplatte. Wiederholen Sie den Vorgang mit den verbleibenden Proben, wobei die Aufträge in gleichmäßigen Abständen erfolgen sollen. Abschließend scannen Sie die Platte mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät. Die Untersuchung von Larven, die unter Versuchsbedingungen auf einem Schüttler gehalten wurden, zeigt verdunkelte Därme, was typisch für Fische ist, die die Eigelbemulsion aufgenommen haben.Larven, die nicht gefüttert wurden, haben gewöhnlich klare Därme, sodass sich jene, die während der Fütterungsphase die Nahrungsformel nicht aufgenommen haben, leicht unterscheiden lassen. Eine Larve, die mit einem fluoreszierenden Lipid-Analogon gefüttert wurde, macht den Transport und die Anreicherung dieses Nahrungslipids sichtbar. Hier ist das fluoreszierende Signal acht Stunden nach der Fütterung in den gesamten Verdauungsorganen zu sehen.Verschiedene Lipid-Analoga werden in unterschiedliche Sätze zellulärer Strukturen eingebaut und visualisieren diese somit, da sie unterschiedlich in komplexe Lipide umgewandelt werden. Hierbei markieren Fluorescent-C16- und C12-Analoga Lipidtröpfchen. Fluorescent-C5 markiert hepatische und pankreatische Gänge, Lipidtröpfchen, zelluläre Membranen und arterielle Netzwerke.Und die fluoreszierende C2-Analogmarke färbt hepatische und pankreatische Gänge sowie Zellmembranen. Mithilfe von Fressverhaltenstests an Larven wurde die Nahrungsaufnahme von Wildtyp-Larven im Vergleich zu transgenen Larven, die Apolipoprotein A4B1 überexprimieren, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die transgenen Larven über einen Zeitraum von vier Stunden weniger fraßen als die Wildtyp-Larven. Die Zuchtbedingungen wurden durch Verwendung gepaarter, nücherner Kontrolllarven normalisiert.Die Quantifizierung der Fluoreszenz von Wildtyp- und transgenen Larven, die nach der Fütterung Apo A4 überexprimieren, zeigt eine signifikant verringerte Aufnahme durch die transgenen Larven im Vergleich zum Wildtyp. Sobald die Methode beherrscht ist, kann das färbbare Eigelb-Lipid-Analog-Futter in etwa 15 Minuten hergestellt werden. Die Nahrungsaufnahme kann aus 10 bis 12 gepoolten Proben innerhalb von ungefähr vier Stunden quantifiziert werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Larven auf Entwicklungsdefekte zu untersuchen, die die Nahrungsaufnahme beeinträchtigen könnten, beispielsweise eine fehlgebildete Kieferstruktur, einen unterentwickelten Darm oder verminderte Beweglichkeit. Methoden wie pharmakologische Behandlungen oder Genom-Editierung können in dieses experimentelle Protokoll integriert werden, um zusätzliche Fragestell游戏副本 zu beantworten, etwa wie spezifische Proteine und zelluläre Signalwege die Nahrungsaufnahme und den Lipidstoffwechsel regulieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf den Gebieten der gastrointestinalen Physiologie und der Zellbiologie den Weg, um den Transport und die Ansammlung von Nahrungslipiden in Zebrafisch-Larven sichtbar zu machen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein lipidesreiches Futter für Zebrafischlarven herstellt, Larven auf Nahrungsaufnahme untersucht, Larven für kurz- und langfristige Bildgebung präpariert und den Nahrungsaufnahme quantifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Ultraschallzerstörer gefährlich sein kann. Beim Durchführen dieses Verfahrens sollte Gehörschutz getragen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Microgavage der Zebrafischlarven

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