Split-Ubiquitin Basierend Membrane Yeast Two-Hybrid (Mythos) System: Ein wirksames Instrument zur Ermittlung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Das MyTH-System basiert auf dem Konzept des geteilten Ubiquitins, das sich auf die Fähigkeit des Ubiquitins bezieht, stabil in die N-terminale Hälfte NUBI und die C-terminale Hälfte CUB getrennt zu werden, die in der Lage sind, sich zu einem vollständigen, pseudo-ubiquitinartigen Molekül neu zu assemblieren. Während diese Rekonstitution spontan erfolgt, wenn das Wildtyp-NUBI verwendet wird, verringert die Einführung einer Isoleucin-13-auf-Glycin-Mutation, die ein Fragment namens NUBG erzeugt, die Affinität für CUB erheblich und blockiert somit die Bildung des pseudo-Ubiquitins. Wenn NUBG und CUB jeweils an Protein A und Protein B fusioniert sind und A und B in der Lage sind, miteinander zu interagieren, kann das pseudo-Ubiquitin-Molekül erneut gebildet werden.

In der Mythologie sind integrale Membran-Baits mit einem Angriff fusioniert, der aus dem CUB-Fragment verbunden mit einem künstlichen Transkriptionsfaktor besteht. Während die Preys mit dem NUBG-Fragment fusioniert sind, führt eine Interaktion zwischen Bait und Prey zur Rekonstitution des Pseudo-Ubiquitins, das wiederum von zytosolischen De-Ubiquitinierungsenzymen erkannt werden kann, dargestellt als Schere. Diese Enzyme spalten nach dem C-Terminus des CUB, wodurch der Transkriptionsfaktor freigesetzt wird und anschließend in den Zellkern eindringen kann, um das Reporter-System zu aktivieren, wodurch eine selektive Isolierung und Identifizierung von Zellen ermöglicht wird, in denen BA-Prey-Interaktionen stattfinden.

Hallo, ich bin Janie Snyder aus dem Igor STAARs Labor in den Abteilungen Molekulargenetik und Biochemie an der University of Toronto. Heute werde ich Ihnen ein Verfahren für den Membran-Zwei-Hybrid- oder MyTH-Test zeigen, das wir in unserem Labor verwenden, um die Wechselwirkungen integraler Membranproteine zu untersuchen. Beginnen wir also.

Vor der Durchführung der MYTH-Analyse überprüfen Sie, ob sich das N- und/oder C-Terminus Ihres Bait-Proteins im Zytosol der Zelle befindet. Der CUB-LexA-VP16-Tag muss an einem solchen Terminum an Ihr Protein fusioniert sein. Da die für die Freisetzung des Transkriptionsfaktors notwendigen Deubiquitinierungsenzyme im Zytosol lokalisiert sind, können Sie, falls die Topologie Ihres Bait-Proteins nicht bekannt ist, Konstrukte erzeugen, die sowohl am N- als auch am C-Terminus markiert sind, und mithilfe des weiter unten beschriebenen N-U-B-G-I-Kontrolltests prüfen, ob eines dieser Konstrukte für die MYTH-Analyse geeignet ist, was darauf hindeutet, dass ein bestimmtes Terminum zytosolisch orientiert ist.

Als Nächstes entscheiden Sie, welcher der beiden Hauptvarianten des Myth-Verfahrens für Ihr Experiment geeignet ist. Für native Hefe-Proteine ist das integrierte Myth (immy) die Methode der Wahl. Bei Imy werden Bates endogen mit dem CUB-LexA-VP16-Tag markiert, wodurch sie weiterhin unter der Kontrolle ihres nativen Promotors stehen.

Dies ist vorteilhaft, da die Wildtyp-Expressionsstärke von Bates Probleme im Zusammenhang mit der Proteinüberexpression beseitigt, wie beispielsweise eine erhöhte Zahl falsch-positiver Ergebnisse für nicht-native Hefe-Proteine. Traditioneller Myth oder T-Myth kann verwendet werden, wobei CU B Lex A V VP 16-Tag-Bait von einem Plasmid überexprimiert werden. Wir konzentrieren uns in diesem Protokoll auf T-Myth, da diese Myth-Form breiter anwendbar ist. Mit Ausnahme der anfänglichen Bait-Konstruktion und der verwendeten Medien werden beide Myth-Formen im Wesentlichen identisch durchgeführt. Der Bait muss in einen geeigneten Vektor kloniert werden, um ihn für die Markierung und Expression vorzubereiten.

Derzeit sind verschiedene T-myth-Vektoren verfügbar, wie beispielsweise BV vier, p, a, BV vier und PCM BV vier, die die Konstruktion carboxyterminal markierter Bates, Beit Cub Lexie und VP 16 unter Kontrolle eines sehr starken TF-eins-starken A-DH-eins- und eines schwachen CYC-eins-Promotors ermöglichen. Sobald der gewünschte Effektor ausgewählt wurde, wird das Plasmid mittels Restriktionsverdau am entsprechenden Restriktionsenzym-Schnittstelle gespalten. Die Spaltung sollte dabei nur unmittelbar in der Nähe der CU B Lxe VP 16-Markierung erfolgen, und zwar upstream der Markierung für eine carboxyterminale Markierung oder downstream für eine aminoterminale Markierung.

Beispielsweise ist beim Einsatz des PAM-BV-Vektors SFI eine ideale Wahl; nachdem das Plasmid verdaut und bei minus 20 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung gelagert wurde, besteht der nächste Schritt darin, Primer für die Amplifikation und Klonierung des Gens von Interesse zu entwerfen. Das 5'-Ende Ihres Vorwärtsprimers muss etwa 35 bis 40 Nukleotide upstream der Restriktionsstelle entsprechen. Das 3'-Ende hingegen muss mit den ersten 18 bis 20 Nukleotiden des Zielgens übereinstimmen, welches ein DRB2 ist, das den Beta-2-Generikusrezeptor kodiert.

Im vorliegenden Beispiel muss das 5'-Ende des reversen Primers mit dem komplementären Strang von etwa 35 bis 40 Nukleotiden, die stromabwärts der Restriktionsstelle liegen, übereinstimmen. Das 3'-Ende soll mit dem komplementären Strang der letzten 18 bis 20 Nukleotide des Zielgens übereinstimmen, wobei der Stoppcodon weggelassen wird, wenn – wie im gezeigten Beispiel – ein CUB-Lexa-VP16-Tag am C-Terminus angebracht wird. Abhängig davon, ob eine N- oder C-terminale Markierung durchgeführt wird, ist sicherzustellen, dass die ausgewählten 35 bis 40 Nukleotide der Plasmidsequenz, die im vorwärts- oder rückwärtsgerichteten Primer verwendet werden, dazu führen, dass das Zielgen im Leseraster mit dem CUB-Lexa-VP16-Tag geklont wird. Da im vorliegenden Beispiel der C-Terminus des ADRB2-Proteins markiert wird.

Die 35 Basen der A MBV-Sequenz im reversen Primer wurden so ausgewählt, dass die A DRB2- und CUB-Gensequenzen im selben Leseraster liegen. Amplifizieren Sie das Gen der Interesse mittels PCR unter Verwendung der ausgewählten Primer. Die PCR-Parameter hängen vom jeweiligen Enzym und den spezifischen Primern ab, um eine Umgebung zu schaffen, in der eine lückenreparierende homologe Rekombination stattfinden kann. Das zuvor digestierte Plasmid und das amplifizierte Gen der Interesse werden mittels eines Standardverfahrens zur Hefetransformation, wie es von Geets und Woods beschrieben wurde, in einen geeigneten Hefestamm transformiert.

Nachdem die transformierte Hefe auf der Platte gewachsen ist, eine einzelne Kolonie des Stammes entnehmen und in fünf Milliliter SD-Medium ohne Leucin ansäen. Die flüssige Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius wachsen lassen, bis sie die Sättigung erreicht hat. Die Zellen bei 700 × g fünf Minuten lang zentrifugieren, den Überstand entfernen und die Bait-Plasmid-DNA aus dem Zellpellet mit einem handelsüblichen Minipräp-Kit isolieren.

Befolgen Sie den Standardprotokollschritt mit einer Modifikation, um eine ausreichende Hefezelllyse bei einem kleinen Volumen von 0,5 Millimol Sodalime-Glaskügelchen zum Pellet nach der anfänglichen Resuspendierung sicherzustellen, und wirbeln Sie fünf Minuten lang kräftig. Fahren Sie anschließend wie üblich mit dem kommerziellen Protokoll fort. Transformieren Sie die isolierte Hefe-DNA in einen chemisch kompetenten Escherichia coli-Stamm, der für die Plasmidvermehrung geeignet ist und eine Transformationsrate von mindestens 1 × 10⁷ Zellen pro Mikrogramm DNA aufweist.

Nach der Gewinnung der Plasmid-DNA aus den transformierten E. coli muss die korrekte Konstruktion des Bait-Plasmids vor der Verwendung durch Sequenzierung überprüft werden. Bait-Stämme müssen analysiert werden, um sicherzustellen, dass die Bait-Proteine korrekt in die Hefe-Membran lokalisiert sind. Die Lokalisation wird mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Die Einbindung eines YFP-Moleküls in die Bait-Tag-Sequenz ermöglicht die direkte Visualisierung lebender Zellen und wird häufig in iMY verwendet.

Alternativ kann ein Standard-Immunfluoreszenzansatz unter Verwendung eines Antikörpers gegen die Lex-A- oder VP16-Komponenten des Tags verwendet werden, nachdem die korrekte Lokalisation des Köders etabliert wurde. Es ist notwendig sicherzustellen, dass der Köder nicht allein aktivierend für IE ist, das Reportersystem also weder allein noch in Gegenwart von nichtinteragierenden Kontrollproteinen aktiviert. Um sicherzustellen, dass der Köder nicht selbstaktivierend ist, verwenden wir den N-U-B-G-I-Test. Bei diesem Test.

Der Bait wird mit einem interagierenden positiven und einem nicht interagierenden negativen Kontrollpräparat transformiert, und anschließend werden verschiedene Verdünnungen jedes Transformanten auf geeigneten selektiven Medien aufgebracht. Der Bait muss auf selektivem Medium in Gegenwart der positiven Kontrolle wachsen und darf in Gegenwart der negativen Kontrolle nicht wachsen, um für die Verwendung im MYTH geeignet zu sein. Nachdem der Bait validiert wurde, kann der MYTH-Reportersystemstamm, der den Bait enthält, mit einer Bibliothek von Interesse (Prey-Bibliothek) transformiert werden, um nach Protein-Protein-Interaktionen zu screenen.

Um mit dieser groß angelegten Hefe-Transformation zu beginnen, impfieren Sie eine einzelne Kolonie des Myth-Reporter-Stamms, der Ihren Köder enthält, in fünf Milliliter SD-Medium ohne Leucin und inkubieren Sie über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Verdünnen Sie die Übernachtkultur in 200 Milliliter SD-Medium ohne Leucin und inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius unter Schütteln, bis ein OD 600 von 0,6 bis 0,7 erreicht ist. Sobald das Ziel-OD 600 erreicht ist, teilen Sie die 200-Milliliter-Kultur auf vier 50-Milliliter-Schraubverschluss-Zentrifugenröhrchen auf und gewinnen die Zellen durch Zentrifugation.

Nachdem die Pellets mit sterilem zweifach destilliertem Wasser und Lithiumacetat-Tris-DTA-Lösung gewaschen wurden, suspendieren wir jede Pellet in 600 µL Lithiumacetat-Tris-DTA-Lösung in jeweils vier 15-mL-Schraubzentrifugenröhrchen. Geben Sie 2,5 mL PEG-Lithiumacetat-Lösung, 600 µL der resuspendierten Zellen, 100 µL Salmonensperma-DNA-Lösung und sieben Mikrogramm Beutebibliothek-DNA vier hinzu. Vortexen Sie die Röhrchen eine Minute lang, um eine gründliche Vermischung sicherzustellen, und inkubieren Sie sie anschließend 45 Minuten lang in einem 30 °C warmen Wasserbad.

Mischen Sie nach der 45-minütigen Inkubation alle 15 Minuten kurz. Geben Sie 160 Mikroliter Dimethylsulfoxid oder DMSO zu jedem Reaktionsgefäß hinzu und mischen Sie sofort durch Umstülpen der Röhrchen. Inkubieren Sie 20 Minuten im Wasserbad bei 42 Grad Celsius.

Wenn der Hitzeschock abgeschlossen ist, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie sie. Suspendieren Sie jedes der Pellets in drei Milliliter zweifach konzentriertem Y-P-A-D. Vereinigen Sie alle Proben in einem einzigen 50-Milliliter-Schraubverschluss-Zentrifugenröhrchen.

Inkubieren Sie die Zellen zur Erholung 90 Minuten bei 30 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Zellpellet in 4,9 Milliliter steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung unter Verwendung von 100 Mikrolitern der resuspendierten Zellen. Bereiten Sie eine zehnfache serielle Verdünnung in steriler 0,9%iger Natriumchloridlösung von 10× bis 10.000× vor, geben Sie jeweils 100 Mikroliter der 100×- und 1000×-Verdünnung auf selektives Medium und inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für zwei bis drei Tage.

Diese Platten dienen als Kontrolle und werden verwendet, um die Effizienz der Transformation gleichwertig zu berechnen. Verteilen Sie die verbleibenden 4,8 Milliliter der resuspendierten Zellen und geben Sie sie auf große 150-Millimeter-Platten, anschließend inkubieren bei 30 Grad Celsius für drei bis vier Tage. Sobald Kolonien gewachsen sind, resuspendieren Sie einzelne Kolonien – jede repräsentiert Zellen, die ein potenziell wechselwirkendes Bait-Prey-Paar enthalten – in 100 Mikrolitern 0,9 %iger Natriumchloridlösung und geben jeweils 5-Mikroliter-Aliquote in selektives Medium mit XG; lassen Sie sie nur zwei bis vier Tage lang wachsen.

Kolonien mit kräftigem Wachstum und blauer Färbung werden für die weitere Analyse ausgewählt. Nach der Isolierung und Sequenzierung der Plasmide aus den positiven Hefe-Kolonien werden alle Sequenzierungsdaten zusammengestellt und analysiert, um eine vorläufige Liste der Interaktoren zu erstellen. Um diese Interaktionen erneut zu überprüfen, wird der Bait-Abhängigkeitstest angewendet.

Bei diesem Test werden alle Beute-Plasmide, die die identifizierten Interaktoren exprimieren, erneut in den ursprünglichen Köder-Stamm sowie in den Stamm, der einen Kontroll-Köder enthält, transformiert; dieser Kontroll-Köder besteht aus einer einzelnen Transmembrandomäne, die an die CUB-Lex-Domäne sowie ein VP16-Tag fusioniert ist. Resuspendieren Sie einzelne Kolonien dieser Transformationen in 100 Mikrolitern sterilem, doppelt destilliertem Wasser und pipettieren Sie jeweils fünf Mikroliter auf die entsprechenden selektiven Medien plus X-sc. Idealerweise sollten mehrere Transformanten für jede Beute ausgewählt werden, und sowohl der ursprüngliche Köder als auch der künstliche Köder sollten auf derselben Platte aufgetragen werden. Inkubieren Sie die Platten zwei bis vier Tage bei 30 Grad Celsius. Hefe-Zellen, die den künstlichen Köder tragen, sowie Beute-Proteine, die eine Aktivierung des Reportersystems verursachen, gelten als unspezifisch bindend; diese spezifische Beute wird daher von der Liste der Interaktoren entfernt.

Lob, das Wachstum und Blaufärbung in Hefe verursacht, die den gewünschten Köder, nicht jedoch den künstlichen Köder enthält. Bestätigen Sie eine spezifische Wechselwirkung. Falls jedoch Hefe, die das Beutemolekül und Ihren gewünschten Köder enthält, nicht wächst.

Diese Beute wird aus der Liste der Interaktoren entfernt. Die verbleibenden Beutepartner bilden die vollständige Liste der in dem MYTH-Screen identifizierten Interaktoren. Nach Abschluss des MYTH-Verfahrens verfügen Sie über eine Interaktions-Übersichtskarte.

Dies stellt eine Sammlung von potenziellen Wechselwirkungen dar, die der Forscher mithilfe spezifischer, fallweise festgelegter Untersuchungen weiter analysieren muss. Um die biologische Bedeutung jeder Wechselwirkung zu beurteilen, haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man den Membran-Ein-Hybrid- oder MyTH-Test durchführt, um wechselwirkende Partner eines Proteins von Interesse zu identifizieren. Bei der Durchführung des MyTH-Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass sich das N- und/oder C-Terminus Ihres Proteins von Interesse im Zytoplasma der Zelle befindet, und dementsprechend Ihre Markierungsstrategie zu planen.

Außerdem ist es wichtig, sorgfältig zu überprüfen, ob Ihre Bait-Stämme den Bait korrekt exprimieren und ob dieser richtig lokalisiert ist. Außerdem sollte der NUB-GI-Kontrolltest durchgeführt werden, da er hilfreich bei der Etablierung der Screening-Bedingungen ist. Schließlich sollten alle mit MYTH detektierten Interaktionen unabhängig bestätigt werden.

Wenn Sie diese einfachen Schritte befolgen, sollten Sie die bestmöglichen Ergebnisse aus dem Myth-Verfahren erhalten. Nun, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.