Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen
26. Dezember 2016
Die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele, die von präklinischen Tests zu Versuchen am Menschen übergehen, ist eine wissenschaftliche Priorität. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier einen funktionellen genomischen Ansatz, um die Auswirkungen der Genverarmung auf Sphäroide von Krebszelllinien zu untersuchen, die menschliche Krebserkrankungen in vivo besser modellieren.
Das Ziel dieses siRNA-Screening-Protokolls ist es, den Einfluss von Gen-Silencing auf das Wachstum von Sphäroiden in Krebszelllinien zu untersuchen. Im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen Zellkulturtechniken weisen Krebs-Sphäroide Bedingungen auf, die denen in Tumoren in vivo ähnlicher sind. Diese Methode ist nützlich für die funktionelle Bewertung häufig veränderter Gene bei menschlichen Krebserkrankungen und, was noch wichtiger ist, sie kann verwendet werden, um zu bestimmen, welche Gene unter komplexeren Kulturbedingungen, wie sie in dreidimensionalen Kulturen und insbesondere unter Hypoxie zu beobachten sind, potenzielle Onkogene oder Tumorsuppressoren sind.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht anpassbar ist, so dass Forscher sie verwenden können, um ihre speziellen Gene zu untersuchen, die in ihren bevorzugten Zelllinien von Interesse sind. Wir glauben, dass es auf aktuellen gezielten sRNA-Screening-Ansätzen aufbaut. Es wird allgemein anerkannt, dass gezielte Screenings anstelle von Ganzgenomstämmen es Wissenschaftlern ermöglichen, spezifische Fragen zu stellen und robustere Ergebnisse zu erzielen.
Wir haben die Wirkung von Gen-Silencing auf die Lebensfähigkeit und Größe von Sphäroiden analysiert, aber Sie können auch biometrische Farbstoffe für eine andere Bildschirmauslesung verwenden, z. B. Apoptose. Die Demonstration des Verfahrens ist Patty Wai aus unserem Labor. Beginnen Sie mit dem Auftauen von 96-Well-Platten, die die siRNA-Bibliothek enthalten, bei Raumtemperatur.
Dann fünf Minuten lang mit einer Tischzentrifuge bei 1.000 g drehen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter reduziertes Serummedium mit dem optimierten Transfektionsreagenz in die Vertiefungen jeder Platte zu geben. 15 Minuten inkubieren, damit sich Transfektionskomplexe, die siRNA enthalten, bilden können.
Wie bei jeder Screening-Pipeline sollte die Sphäroidbildungskapazität von Zelllinien unter Transfektionsbedingungen vor der Durchführung des vollständigen Screenings robust optimiert werden. Anschließend trypsinisieren Sie die zu siebenden Zellen, bis sie sich vom Kolben lösen. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit einem geeigneten Volumen zelllinienspezifischem Medium, geben Sie es in ein Zentrifugenröhrchen und drehen Sie es fünf Minuten lang bei 1.000 g in einer Tischzentrifuge, um die Zellen zu sammeln.
Der Überstand wird verworfen und das Pellet in eine einzellige Suspension mit einem geeigneten Volumen des Mediums resuspendiert. Führen Sie eine Zellzählung mit einem automatischen Zellzähler durch. Verdünnen Sie dann die Suspension mit kaltem Medium auf 5.000 Zellen pro 180 Mikroliter.
Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Reservoir. Mischen Sie die Zellsuspension mit einer Mehrkanalpipette, die auf 180 Mikroliter eingestellt ist, und übertragen Sie sie auf die 96-Well-Platte, die die siRNA enthält. Zentrifugieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 1.000 g in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 4 Grad Celsius und inkubieren Sie die Platte dann in einem 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator.
An dieser Stelle erscheinen die Zellen als Mosaik am Boden der Vertiefungen. Beobachten Sie die Zellen nach 24 Stunden unter dem Mikroskop. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Zellen zu einem einzigen Sphäroid in der Mitte der Vertiefung aggregiert werden.
Geben Sie 100 Mikroliter vollständiges Medium in jede Vertiefung, um das Wachstum zu fördern, bevor Sie in den Inkubator zurückkehren. Entfernen Sie nach drei Tagen des Wachstums vorsichtig 100 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 100 Mikroliter frisches Medium hinzu. Untersuchen Sie am siebten Tag die Sphäroide unter einem Mikroskop und fahren Sie dann mit der Quantifizierung der Sphäroidgröße auf einem Plattenlesegerät fort, das das Sphäroidwachstum im Laufe der Zeit quantitativ überwachen kann.
Um die Sphäroidgröße zu quantifizieren, öffnen Sie zunächst die Software auf dem Computer. Wählen Sie 96-Well-Platte aus, wählen Sie den entsprechenden Plattentyp aus, und geben Sie einen Experimentnamen ein. Setzen Sie dann die 96-Well-Platte mit den Sphäroiden in ein Mikrotiterplatten-Zytometer ein.
Wählen Sie als Nächstes die Anwendung Tumorsphere aus. Wählen Sie den bildbasierten Fokus, um den Fokus so zu ändern, dass das Sphäroid scharf ist und einen optimalen Kontrast aufweist. Wählen Sie die Vertiefungen aus, die gescannt werden sollen, und starten Sie den Scan.
Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Objektmaske die Sphäroidgröße genau darstellt. Stellen Sie für BT474-Sphäroide, die sieben Tage lang gezüchtet wurden, die Genauigkeit auf Hoch und den minimalen Koloniedurchmesser auf 200 Mikrometer ein. Verwenden Sie die Exportfunktion, um die Daten in Form einer annotierten Datendatei zu exportieren, die analysiert wird, um siRNAs mit einem statistisch signifikanten Effekt auf die Sphäroidfläche zu identifizieren.
Entfernen Sie nach der Bildgebung 100 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 100 Mikroliter Lumineszenz-Viabilitätsfarbstoff hinzu, um die Zellviabilität zu bestimmen. Nachdem Sie die Platten 15 Minuten lang inkubiert haben, scannen Sie die Platte mit einem lumineszierenden Plattenleser. Dieses Protokoll kann auch für die Verwendung mit anderen Krebszelllinien angepasst werden.
Das umgekehrte Transfektionsverfahren von Nicht-Targeting-Kontrollen hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Lebensfähigkeit einer der getesteten Linien, während die Transfektion von Ubiquitin B, einer positiven zelltötenden Kontrolle, die Lebensfähigkeit signifikant verringerte. BT474-Zellen wurden mit der humanen siGENOME siRNA-Bibliothek mit 200 Genen in dreifacher Ausfertigung reversiert. Sphäroidfläche und Lebensfähigkeit wurden beobachtet.
Es wurden signifikante Ausreißer mit einem Z-Wert von mehr als 1,7 identifiziert. SiRNAs, die die Sphäroidfläche und -viabilität signifikant vergrößert oder reduziert haben, sind blau schattiert, und rot stellt die Kontroll-siRNAs dar. Diese Mikroaufnahmen zeigen repräsentative Bilder von BT474-Sphäroiden sieben Tage nach der reversen Transfektion mit E-Cadherin, einer Nicht-Targeting-Kontrolle, PIK3CA-, ERBB2- oder SF3B1-siRNA.
Dieses Histogramm zeigt, wie sich die Behandlung mit jeder siRNA sieben Tage nach der reversen Transfektion auf die Lebensfähigkeit der Zellen auswirkte. Der Knockdown von ERBB2 und PIK3CA reduzierte die Zellviabilität im Vergleich zu Kontrollen signifikant. Dieses Bild zeigt, dass die Sphäroide erfolgreich immungefärbt werden können, um die Auswirkungen des Gen-Silencing auf Zielproteine aufzudecken.
Einmal gemeistert, können mehrere hundert Gene an einem Tag in mehreren Zelllinien gescreent werden, was die robuste Identifizierung potenziell neuer Gene ermöglicht, die für das Überleben in dreidimensionalen Kulturen wichtig sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Krebszell-Sphäroide erfolgreich kultivieren können, die für sRNA-vermitteltes Gen-Silencing geeignet sind. Sie werden auch in der Lage sein, die Auswirkungen des Gen-Silencing zu untersuchen, indem Sie Immunhistochemie an den Sphäroiden durchführen.
Dies kann wertvolle räumliche Informationen liefern, die Sie über die zugrunde liegende Biologie informieren können.
Übersicht
Dieser Artikel stellt einen funktionalen Genomik-Ansatz zur Identifizierung potenzieller Wirkstoffziele durch Untersuchung von Gendepletionseffekten auf Krebszelllinien-Sphäroden vor. Diese Sphäroden bieten ein genaueres Modell menschlicher Tumoren in vivo im Vergleich zu traditionellen 2D-Kulturen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Funktionale Genomik
- Krebsbiologie
- Zellkulturtechniken
Hintergrund
- Gen-Silencing kann Onkogene und Tumorsuppressoren aufdecken.
- Krebssphäroden ahmen die Tumormikroumgebung genauer nach als 2D-Kulturen.
- Gezieltes siRNA-Screening ermöglicht eine spezifische Genuntersuchung.
- Hypoxische Bedingungen können mit dieser Methode untersucht werden.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Auswirkungen von Gen-Silencing auf das Wachstum von Krebssphäroden.
- Identifizierung von Genen, die als neue Wirkstoffziele dienen könnten.
- Verbesserung des Verständnisses der Genfunktion in einer 3D-Kulturumgebung.
Verwendete Methoden
- siRNA-Screening in Krebszelllinien-Sphäroden.
- Optimierung der Transfektionsbedingungen für eine robuste Sphärodenbildung.
- Quantifizierung der Sphärodengröße und -lebensfähigkeit mittels Bildzytometrie.
- Analyse der Auswirkungen der Gen-Silencing auf Zelllebensfähigkeit und -wachstum.
Hauptergebnisse
- Es wurden signifikante Auswirkungen spezifischer siRNAs auf die Lebensfähigkeit und Größe der Sphäroden beobachtet.
- Der Knockdown von ERBB2 und PIK3CA reduzierte die Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu Kontrollen.
- Eine robuste Identifizierung von Genen, die für das Überleben in 3D-Kultur wichtig sind, wurde erreicht.
- Die Anpassungsfähigkeit der Methode für verschiedene Krebszelllinien wurde demonstriert.
Schlussfolgerungen
- Dieser Ansatz ermöglicht das Screening von Hunderten von Genen an einem einzigen Tag.
- Es bietet ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele bei Krebs.
- Die Methode verbessert das Verständnis der Genfunktion in einem physiologisch relevanteren Kontext.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Functional genomics screening in 3D cancer spheroid models enhances target validation by revealing gene dependencies under physiologically relevant conditions. This approach improves predictive confidence in identifying novel drug targets by capturing tumor microenvironment influences often missed in 2D cultures. The method supports early discovery decisions by linking gene silencing effects to spheroid growth and viability, enabling mechanistic de-risking of candidate targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing the impact of gene silencing on cancer spheroid growth and viability.
- Operational Value: Enables functional assessment of frequently altered genes in human cancers under complex culture conditions.
- Predictive Value: Identifies potential oncogenes or tumor suppressors that are critical for survival in 3D culture, supporting target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Utilizes siRNA screening to generate quantitative readouts of spheroid area and viability for gene effect analysis.
- Operational Value: Requires optimization of transfection conditions and spheroid formation capacity to ensure robust and reproducible screening outcomes.
- Assay Readiness: Employs imaging cytometry and luminescent viability dyes to enable high-content, quantitative monitoring of spheroid growth over time.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Confirms spatial impact of gene dependencies via immunohistochemistry, linking molecular findings to protein-level changes in spheroids.
- Preclinical Continuity: Demonstrates dependency on HER2 amplification and PIK3CA mutation in BT474 spheroids, validating known cancer drivers in a 3D model.
- Mechanistic De-risking: Provides spatial and functional validation of gene effects, reducing ambiguity in target mechanism before downstream investment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly for targets requiring validation in complex, hypoxia-prone tumor models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to spheroid viability and size changes.
- Screening: Enables assay standardization through reverse transfection protocols and standardized spheroid formation in 96-well formats.
- Analytics: Generates quantitative spheroid area and viability data via imaging cytometry and luminescent readouts, enabling statistical identification of significant hits (e.g., z-score >1.7).
- Translational Research: Connects gene silencing effects to spatial protein expression via immunohistochemistry, enhancing biomarker alignment and mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Adaptable across cancer cell lines and siRNA libraries, positioning it as a reusable platform for target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by revealing gene dependencies in a tumor-relevant 3D context.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized spheroid formation, transfection optimization, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from 2D models and increasing confidence in target essentiality.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional evidence from physiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, transfection techniques, and 3D model handling to ensure robust spheroid formation.
- Dependent on access to imaging cytometry and luminescent plate readers for quantitative spheroid size and viability assessment.
- Necessitates optimization of transfection conditions and cell density (5,000 cells/180 µL) for consistent spheroid formation across wells.
- Requires adaptation considerations when extending to other cancer cell lines or hypoxia-modulated conditions.
- Practical limitation: Screening throughput depends on siRNA library size and imaging capacity, though hundreds of genes can be screened per day once optimized.
