Bildgebung von Zell-Form-Veränderung und Bewegung der Zellen in Drosophila Gastrulation Mit DE-Cadherin Reporter Transgene Flies
29. Dezember 2016
Hierin beschreiben wir ein Verfahren zur Aufnahme von Live-Bildern der Drosophila-Gastrulation. Dies hat es uns ermöglicht, die apikale Verengung in der frühen Entwicklung besser zu verstehen und die Mechanismen, die zelluläre Bewegungen während der Gewebestrukturmodifikation steuern, weiter zu analysieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die zelluläre Form und Bewegung während der Drosophila-Gastrulation besser zu verstehen. In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Messmethode der Drosophila-Gastrulation zur Verfügung, um die Initiierung morphogenetischer zellulärer Bewegungen in diesem Stadium der Embryonalentwicklung zu testen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellumlagerung zum Zeitpunkt der Gastrulation zusammen mit der apikalen Verengung während der Gastrulation identifiziert werden kann.
Um das Experiment zu beginnen, bereiten Sie eine Mischung aus 375 Millilitern Wasser vor. 125 Milliliter 100% im Handel erhältlicher Apfelsaft. 12,5 Gramm Agar.
12,5 Gramm Glukose. Als nächstes erhitzen Sie die Mischung in der Mikrowelle, bis der Agar geschmolzen ist. Und gießen Sie es in eine drei Zentimeter große Zellkulturschale.
Lagern Sie die Mischung bei 4 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Nach der Zubereitung der Apfelplatte eine dünne Schicht geknetete Hefepaste darauf geben, damit die Fliegen Eier legen können. 25 männliche und 25 weibliche Fliegen in einer Flasche auf einen mit gekneteter Hefe bedeckten Apfelteller legen.
Wickeln Sie die Drosophilas-Plastikflaschen mit Alufolie ein, um die Fliegen dazu zu bringen, mehr Eier zu legen. Bewahren Sie die Flasche über Nacht kopfüber in einem Inkubator auf. Ersetzen Sie am nächsten Morgen die Apfelsaftplatte durch eine frische.
Wickeln Sie die Flasche dann mit Alufolie ein und lassen Sie die Fliegen drei bis vier Stunden lang Eier legen. Nachdem die Fliegen Eier gelegt haben, lösen Sie die Eier mit einem Wattestäbchen vom Teller. Sammeln Sie die Embryonen in einem Sieb und waschen Sie sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
Waschen Sie die Embryonen noch dreimal mit PBS in 12-Well-Kulturschalen. Dechorionieren Sie die Embryonen mit 50% Bleiche in 12-Well-Kulturschalen. Nach dem Dechorionierungsprozess waschen Sie die Embryonen noch dreimal mit PBS.
Übertragen Sie die Embryonen in eine drei Zentimeter große Zellkulturschale, die PBS enthält. Und wählen Sie Embryonen im fünften Stadium unter dem Mikroskop aus, basierend auf dem Grad der Transparenz an ihren Rändern. Entnehmen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze die inszenierten Embryonen.
Legen Sie anschließend zwei ausgewählte Embryonen auf ein Glasdeckglas und entfernen Sie überschüssiges PBS mit Seidenpapier. Richten Sie die Embryonen mit einem fein gedrehten Seidenpapier mit der Rückenseite nach oben auf das Deckglas aus. Befestigen Sie dann die Embryonen mit einer feinen Nadel auf dem Glasdeckglas mit Silikonfett
.Geben Sie einen kleinen Tropfen hohles Kohlenöl 700 auf die Embryonen und legen Sie das Deckglas mit den Embryonen kopfüber auf den eingekerbten Objektträger. Lassen Sie am unteren Rand der Folie etwas Platz. Kleben Sie dann den Deckglas auf die Folie.
Untersuchen Sie schließlich die Embryonen mit einem konfokalen Bildgebungssystem, einem Argon-488-Laser und einem Öl-Immersionsobjektiv. Zeitrafferbilder wurden aus Live-Bildgebung unter Verwendung von DE-Cadherin GFP von Zellbewegungen über 500 Sekunden aufgenommen, um die apikalen Bereiche einzelner Zellen von Drosophila während der Gastrulation zu analysieren. Bei 500 Sekunden sind die apikale Einschnürung und die Einstülpung deutlich sichtbar.
Indem Sie unsere Methode anwenden. Wir können ferner die molekularen Mechanismen der Gastrulation von Drosophila sowie des Übergangs von Epithel zu Mesenchym verstehen, die an der Metastasierung von Krebs beteiligt sind.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Aufnahme von Live-Bildern der Drosophila-Gastrulation vorgestellt, das unser Verständnis der apikalen Konstriktion während der frühen Entwicklung verbessert. Die Technik ermöglicht eine detaillierte Analyse der zellulären Bewegungen, die an der Umgestaltung der Gewebestruktur beteiligt sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Die Gastrulation von Drosophila ist eine kritische Phase der embryonalen Entwicklung.
- Das Verständnis der zellulären Form und Bewegung ist entscheidend, um Entwicklungsprozesse zu erfassen.
- Die apikale Konstriktion spielt eine bedeutende Rolle bei morphogenetischen Bewegungen.
- Lebend-Aufnahmetechniken können Einblicke in dynamische zelluläre Verhaltensweisen liefern.
Zweck der Studie
- Verbesserung des Verständnisses der zellulären Bewegungen während der Gastrulation von Drosophila.
- Entwicklung einer robusten Methode zur Messung morphogenetischer zellulärer Bewegungen.
- Identifizierung von Zellumordnungen und apikaler Konstriktion während der Gastrulation.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer spezifischen Mischung für die Bildgebung.
- Live-Bildgebung von Drosophila-Embryonen während der Gastrulation.
- Analyse zellulärer Bewegungen und Formveränderungen.
- Identifizierung zentraler morphogenetischer Ereignisse.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Aufnahme von Live-Bildern der Drosophila-Gastrulation.
- Identifizierung der apikalen Konstriktion und der Zellumordnung.
- Verbessertes Verständnis der zellulären Dynamik während der frühen Entwicklung.
- Robuste Methodik für zukünftige Studien in der Entwicklungsbiologie.
Schlussfolgerungen
- Das Verfahren liefert wertvolle Einblicke in die Gastrulation von Drosophila.
- Die Live-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung zellulärer Bewegungen.
- Die Ergebnisse tragen zum umfassenderen Verständnis entwicklungsbiologischer Prozesse bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Live-Bildgebung von Zellformveränderungen und Bewegungen während der Gastrulation von Drosophila bietet eine robuste Plattform zur Aufklärung der molekularen Mechanismen des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT), einem Prozess, der mit Fibrose und Krebsmetastasierung assoziiert ist. Diese Methode ermöglicht die hochauflösende Visualisierung apikaler Konstriktion und zellulärer Neuordnung und unterstützt eine zuverlässige Vorhersage bei der Validierung früher Wirkstoffziele für EMT-bezogene Signalwege. Der Ansatz stärkt die translationale Kontinuität von der Entwicklungsbiologie hin zu krankheitsrelevanten mechanistischen Studien in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Genfunktion und Pfaddynamik im Zusammenhang mit der EMT in einem lebenden, multizellulären Kontext.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Visualisierung morphogenetischer Ereignisse, die mit Krankheitsmechanismen verknüpft sind.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung für Gene, die die apikale Konstriktion und Zellschicksensübergänge steuern.
- Bietet vorhersagbare Sicherheit bei der Priorisierung von EMT-modulierenden Zielstrukturen in Onkologie- und Fibrose-Portfolios.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert ein validiertes Abbildungssystem zur Quantifizierung von Zellbewegungen und Formveränderungen in Echtzeit.
- Ermöglicht reproduzierbare Messungen der apikalen Konstriktion und der Zellumordnung als quantitative Assayausgaben.
- Unterstützt die Standardisierung von phänotypischen Screening-Plattformen für EMT-modulierende Substanzen.
- Bereitet robuste biologische Systeme für nachgeschaltete High-Content-Screening-Workflows vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft entwicklungsbedingte EMT-Prozesse mit krankheitsrelevanten Modellen der Metastasierung und Gewebeumbildung.
- Liefert mechanistische Erkenntnisse, die die Auswahl translationsfördernder Biomarker für präklinische Studien informieren.
- Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung von EMT-zielgerichteten Kandidaten basierend auf phänotypischen Nachweisen an lebenden Zellen.
- Stärkt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in bereichen der EMT-getriebenen Erkrankungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese bildgebende Methode ist in den Entdeckungsprozess integriert, der von der frühen Hypothesenprüfung bis hin zur präklinischen Modellentwicklung für EMT-bezogene Zielstrukturen reicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen für EMT- und morphogenetische Regulatoren.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse zu Zellform und -bewegung und ermöglicht die Bereitstellung von Assays.
- Analytik: Stellt bildbasierte Hochdurchsatzdaten für den vergleichenden Nachweis genetischer oder pharmakologischer Störungen bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet Entwicklungsmechanismen mit krankheitsrelevanten EMT-Modellen zur Biomarker-Korrelierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform, die an verschiedene EMT- und Morphogenese-Studien angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Vorhersagesicherheit und die mechanistische Risikominimierung für Entdeckungsprogramme, die auf EMT abzielen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, skalierbare Bildgebungsworkflows für die Reproduzierbarkeit über Projekte hinweg.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien bei EMT-getriebenen Indikationen.
- Portfolio-Wirkung: Fördert die risikoadjustierte Priorisierung von EMT-modulierenden Wirkstoffen über therapeutische Bereiche hinweg.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Live-Bildgebung, konfokaler Mikroskopie und Drosophila-Embryologie.
- Setzt Zugang zu hochentwickelten Bildgebungsinstrumenten und analytischer Software für die Zeitrafferauswertung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Embryonalstadieneinteilung und den Bildgebungsprotokollen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Die Übertragung auf andere Modellsysteme kann eine Optimierung der Reporterkonstrukte und Bildgebungsbedingungen erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören Durchsatzbegrenzungen und die Notwendigkeit einer präzisen Handhabung der Embryonen.
