Name: Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Stitch-Technik zur Herstellung großflächiger nanopatternierter Substrate aus kleinen Siliziumformen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nanotopographischer Modulation des Zellverhaltens.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759 und Byars-Tarnay Endowment. Wir danken für die Nutzung der West Virginia University Shared Research Facilities, die teilweise durch NSF EPS-1003907 unterstützt werden.

1. Die Replikation von PDMS-Formen aus einer EBL Mold <ol><li> Fabrizieren Silikonform 29 <ol><li> Schleuderbeschichtungs 200 ul Polymethylmethacrylat (PMMA) -Lösung auf einem 1 × 1 cm Silizium (Si) -Substrat bei 2.500 rpm für 1 min um einen dünnen Film zu bilden. </li><li> Backen die PMMA-Film auf dem Si-Substrat bei 180 ° C für 2 min. </li><li> Schreiben die entworfen Nano auf der PMMA - Film durch einen fokussierten Elektronenstrahl bei einer Flächendosis von 300 &amp; mgr; C / cm 2. </li><li> Entwickeln Sie die PMMA-Nano in Entwickler für 80 Sekunden. </li><li> Hinterlegung der PMMA Nano mit einer Nickelschicht von 50 nm Dicke in eine E-beam Verdampfer bei einer Ausgangsspannung von 10 kV, Emissionsstrom von 0,5 mA und einer Abscheidungsrate von 0,5 Å / sec Verwendung. </li><li> Heben Sie den PMMA Teil in 20 ml-Entferner bei 80 ° C für 20 min ab. </li><li> Reaktives Ionenätzen (RIE) der Nano in das Si-Substrat eine Si Form der gewünschten Tiefe zu erhalten. HINWEIS: Gasgemisch aus TetRafluoromethane (CF 4) / Sauerstoff (O 2) (90% / 10%) bei einem induktiv gekoppelten Plasma (ICP) Leistung von 400 W und RIE Leistung von 150 W verwendet wird Si - Substrat zu einer Tiefe von 560 nm zu ätzen. </li></ol></li><li> Silanisieren Si Form <ol><li> Setzen Sie ein Deckglas und die Si-Form in einem 100 mm PS Petrischale und übertragen sie in einem Glas-Exsikkator in einer Abzugshaube. </li><li> Drop 10 ul 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane auf dem Deckglas. Achtung: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane verursachen Haut Korrosion und schwere Augenschäden. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (PSA). </li><li> Decken Sie die Petrischale teilweise. </li><li> Halten Sie den Exsikkator unter Vakuum für 5 Stunden in einem Abzug der Silanisierung der Si Form zu vervollständigen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie PDMS-Präpolymer <ol><li> Man wiegt 10 g PDMS-Harz und 1,05 g Härter in einem Einweg-Wägeschiffchen. </li><li> Mischen Sie die PDMS-Präpolymer gründlich durch einen Plastiklöffel verwenden. </li><li> Entgasen Sie den PDMS-Präpolymer in einem Kunststoff-Exsikkator unter Vakuum etwa 20 min bis eine klare Mischung beobachtet wird. </li></ol></li><li> Replizieren PDMS Formen <ol><li> Setzen Sie die silanisierten Si Form in einer 60 mm Petrischale. </li><li> Gießen Sie die PDMS-Präpolymer auf der Si-Form in der Petrischale. </li><li> Legen Sie die Petrischale in einem Kunststoff-Exsikkator und Entgasen für etwa 10 Minuten, bis alle Blasen verschwinden. </li><li> Übertragen Sie die Petrischale auf einer Heizplatte und Härten des PDMS-Präpolymer bei 70 ° C für 4 Stunden. </li><li> Ziehen Sie die PDMS-Form von der Si-Form aus sorgfältig von einer Pinzette. HINWEIS: PDMS Formen können für bis zu einer Woche bei Umgebungsbedingungen gelagert werden. Nach dem Aushärten gibt es einige nicht vernetzten PDMS Harzmoleküle und restlichem Vernetzungsmittel in den PDMS Formen 30. Die niedermolekularen Molekülen allmählich diffundieren und sammeln sich an der Oberfläche über die Zeit. Dies wirkt sich auf die topographischen und mechanischen Eigenschaften der PDMS - Oberfläche 31. Die difFusion ist nicht signifikant innerhalb einer Woche. </li></ol></li></ol> 2. Nähen von PDMS-Formen in einem großen, einzigen Form <ol><li> Bereiten Sie mehrere PDMS Formen für Schritt 1.4 wiederholen. HINWEIS: Wiegen gleiche Menge an PDMS-Mischung jedesmal PDMS Formen von gleicher Dicke zu erhalten. </li><li> Bestimmen Sie die Ausrichtung der anisotropen PDMS Nano wie nanogratings unter einem optischen Mikroskop und markieren Sie ihn auf der Rückseite der PDMS-Formen mit einem Filzstift. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Orientierung der isotropen Nanotopographie, wie beispielsweise Nanosäulen zu markieren. </li><li> Reinigen Sie ein Si-Substrat mit Ethanol in einer Abzugshaube und trocknen Sie sie mit Druckluft. </li><li> Schneiden Sie die nicht gemusterten Flächen jedes PDMS-Form mit einem Messer. HINWEIS: Für die PDMS Formen, die an der Peripherie der genähten Form gelegt wird, werden nur die ungemusterten Bereiche in Kontakt mit anderen abgeschnitten werden sollten. </li><li> Legen Sie die getrimmten PDMS-Form mit dem Nano Gesicht nach unten aufdie Spiegelseite des Si-Substrats und dann auszurichten andere Formen der Nähe von, aber nicht die umgebende Form (en) zu berühren. </li><li> Bereiten Sie eine PDMS Klebeschicht <ol><li> PDMS-Präpolymer (PDMS Harz und Härter-Verhältnis: 10: 1,05) gegossen 1 g entgastes auf einem sauberen Objektträger aus Glas (7,5 cm × 2,5 cm), um eine 0,5 mm dicke Schicht zu bilden. </li><li> Backen Sie die PDMS-Schicht bei 100 ° C auf einer Heizplatte für 3-5 min. Verwenden Sie eine Nadel, um die Schicht zu berühren und zu gewährleisten, dass die Schicht teilweise, aber nicht vollständig geheilt. HINWEIS: teilweise gehärtete PDMS kann nicht wie nicht gehärtete PDMS-Präpolymer fließen, aber es ist klebrig, verglichen mit geheilt PDMS. </li></ol></li><li> Legen Sie die PDMS-Schicht auf der Rückseite ausgerichtet PDMS Formen und schnell diese Baugruppe invertieren und übertragen sie auf der Heizplatte. </li><li> Übernehmen einer Druckkraft (5 kPa) unter Verwendung eines Metallblock auf der Oberseite des Montage einen guten Kontakt zwischen dem PDMS Haftschicht und der Rückseite des PDMS Formen zu gewährleisten, und härten die PDMS Klebstoffschicht bei 100 ° C für 1 Std. &lt;br /&gt; Hinweis: Sie sorgfältig die Position des Metallblocks stellen Sie die Neigung der Anordnung zu vermeiden. </li><li> Entfernen Sie den Metallblock und ziehen Sie die einzelnen, genäht PDMS-Form aus dem Si-Substrat ab. </li></ol> 3. Erzeugung eines Master-Form auf PS Substrate Hinweis: Die genähte PDMS-Form auf einem Glasträger immobilisiert kann verwendet werden, eine Mutterform auf einer PS-Platte oder eine PS-Dünnfilm zu erzeugen, aus dem Arbeitsnanostrukturierten Substrate hergestellt werden können. <ol><li> Generieren Sie eine Masterform auf einer PS-Platte <ol><li> Bereiten Sie eine PS-Platte <ol><li> Trocknen Sie die PS-Pellets in einem Vakuumofen bei 80 ° C für zwei Tage. </li><li> Vorheizen eine Pressmaschine bei 230 ° C. </li><li> Bauen Sie eine Aluminiumplatte, eine Polytetrafluorethylen (PTFE) Blatt und das Aluminium-Abstandhalter in einer Reihenfolge von unten nach oben. </li><li> Belastung 3,5 g PS-Pellets in der Aluminiumabstandshalter mit einer quadratischen Öffnung von 3 cm (L) · 3 cm (W) × 0,3 cm (H). HINWEIS: Der Abstandhalter ist etwa 0.1 cm dicker als die PDMS Formen, und somit die endgültige nanostrukturierten PS Substrat beträgt etwa 0,1 cm dick. </li><li> Legen Sie eine andere PTFE-Folie und dann eine andere Aluminiumplatte auf dem Aluminium-Abstandhalter. </li><li> Legen Sie die Montage in der Pressmaschine. </li><li> Vorwärmen der PS-Pellets bei 230ºC für 30 min. </li><li> Tragen Sie einen Kompressionsdruck (0,1 MPa) auf der Baugruppe für 5 min. </li><li> Lassen Sie den Druck und dann einen Kompressionsdruck von 0,5 MPa auf die Montage erneut anwenden. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.1.1.9 mit einem Druckanstieg von 0,5 MPa bis der erwünschte Druck von 1,5 MPa erreicht ist. </li><li> Schalten Sie die Heizung der Pressmaschine ab und kühlen es bei einem konstanten Druck von 1,5 MPa unter 70 ° C nach unten. </li><li> Nehmen Sie die Baugruppe aus und speichern Sie die PS-Platte in einem Vakuumofen bei 80 ° C Feuchtigkeit zu verhindern, dass der PS-Platte erneut eingeben. </li></ol></li><li> Nanoimprint die genähte PDMS-Form in PS-Platte <ol><li> Legen Sie die PS-Platte in einem Aluminium-AbstandhalterAuf einem 3-Zoll-Si-Wafer. HINWEIS: Die Innenabmessungen des Abstandhalters sind die gleichen wie diejenigen der PS-Platte, so dass die PS-Platte passt genau in den Abstandshalter. </li><li> Erhitzen Sie die PS-Platte auf einer Heizplatte bei 250 ° C für 30 min. </li><li> Legen Sie die genäht PDMS-Form mit Nano Gesicht nach unten auf dem geschmolzenen PS-Platte. HINWEIS: Eine Seite der PDMS-Form wird in Kontakt mit der Oberfläche der PS-Platte gelegt erste und eine andere Seite abgesenkt wird allmählich in Kontakt mit der PS Oberfläche die Bildung von Luftblasen an der Grenzfläche zu vermeiden. Achtung: Die Oberfläche der Heizplatte ist heiß. Tragen Sie thermogloves während Nanoimprint Prozess. </li><li> Legen Sie eine Aluminiumplatte auf dem Glasträger der genähten PDMS-Form. </li><li> Tragen Sie einen Kompressionsdruck (12,5 kPa) durch Metallblöcke auf der Aluminiumplatte verwendet und für 3 Minuten warten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Aluminiumplatte nicht gekippt wird. </li><li> Heben und den Metallblock von der Aluminiumplatte ersetzen und increase den Kompressionsdruck auf 25 kPa. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.1.2.6 mit dem Druck stieg auf 50 kPa. HINWEIS: Dieser Schritt ist die Luft zwischen der PDMS-Form und PS-Platte gefangen zu entfernen. </li><li> Aufrechterhaltung der Temperatur der Heizplatte zwischen 240 und 250 ° C unter ständiger Druck von 50 kPa für 15 min. </li><li> Schalten Sie die Kochstelle aus und abkühlen die gesamte Einrichtung. HINWEIS: Ein Lüfter kann dazu verwendet werden, um den Kühlprozess zu beschleunigen. </li><li> Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 ° C liegt, und schälen sorgfältig die genähte PDMS-Form aus der PS-Platte. HINWEIS: Die PS-Substrat hat die Reverse-Nano und kann als Master-Form verwendet werden, arbeiten PDMS-Substrate herzustellen. </li></ol></li></ol></li><li> Generieren Sie eine Masterform auf einem PS-Dünnfilm <ol><li> Bereiten Sie eine PS-Dünnschicht <ol><li> Man löst 1 g PS in 10 ml Toluol in einem Abzug. Vorsicht: Toluol kann Haut irritatio verursachenn und schwere Augenschäden und kann die Organe schädigen bei längerer oder wiederholter Exposition. Tragen Sie geeignete PSA. </li><li> Spin-coat 1 ml PS-Lösung auf einem 2-in-Wafer bei 2500 Upm für 1 min ~ 1 &amp; mgr; m dicken PS-Dünnfilm zu bilden. </li><li> Verdunsten Toluol aus dem Film durch die PS-Film auf Si-Wafer in einer Abzugshaube Einstellung für 3 Tage. </li><li> Einbrennlackieren PS-Dünnfilm in einem Vakuumofen über Nacht bei 80 ° C. </li></ol></li><li> Nanoimprint die PDMS-Form auf einem PS-Dünnfilm <ol><li> Legen Sie die genäht PDMS-Form mit Nanotopographie der Vorderseite nach unten auf der PS-Dünnfilm, der auf einer Heizplatte eingestellt ist. </li><li> Tragen Sie einen Kompressionsdruck von 12 kPa auf der PDMS-Form von Metallblöcke auf der Glasseite der PDMS-Form verwendet wird. </li><li> Erhöhen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 180 ° C und halten es für 15 min. Achtung: Das geschmolzene PS Film kann als Schmiermittel wirken. Achten Sie darauf, die Metallblöcke ein Abrutschen zu verhindern. </li><li> Schalten Sie die Kochplatteund kühlen das gesamte Setup nach unten. HINWEIS: Ein Lüfter kann dazu verwendet werden, um den Kühlprozess zu beschleunigen. </li><li> Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 ° C sinkt, und schälen sorgfältig die genäht PDMS-Form aus dem PS-Film. HINWEIS: Die nano PS Film wird als Masterform dienen Arbeits PDMS-Substrate herzustellen. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens Hinweis: Human-Epithelzellen kultiviert werden auf die repräsentativen Nanotopographien nanotopographical Modulation von Zellausbreitung zu demonstrieren. <ol><li> Cast PDMS Arbeits Substrate aus der Masterform erzeugt entweder von Schritt 3.1 oder 3.2, je nach Anwendung. </li><li> Mit Hilfe eines hohlen Stahlbogenschlag, schneiden Sie die nanostrukturierten PDMS - Substrate in Scheiben , die die Konfiguration einer bestimmten Multi-Well - Platte (zB 24-Well - Platte) zu passen. </li><li> Verwenden einer Pinzette die PDMS-Discs in die Vertiefungen zu platzieren ofa Multi-Well-Platte. </li><li> Sterilisieren der PDMS-Substrate durch 70% Ethanol und dann UV-Exposition, die jeweils für 30 min. </li><li> Waschen Sie die PDMS-Substrate mit 1x steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) dreimal. </li><li> Beschichtung der Substrate PDMS mit extrazellulären Matrixproteins (dh 20 ug / ml Fibronektin) für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die PDMS-Substrate dreimal mit sterilem PBS für jeweils 5 min. </li><li> Suspend menschlichen Lungenkrebszelle A549 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers zählen. </li><li> Platte die Zellen bei einer Aussaatdichte von 2.000 Zellen / cm 2 auf den PDMS Substrate und Kultur sie bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 für einen Tag. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS dreimal. </li><li> Fixieren Sie die Zellen in einer Mischung aus 4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd in PBS für 4 Stunden und entwässern Zellen eine CO 2 kritischen po Verwendungint Trockner für das Scannen von elektronischen mikroskopischen Beobachtung 29. Achtung: Paraformaldehyd und Glutaraldehyd kann zu schweren Verätzungen der Haut und Augenschäden. Betreiben Sie in einer chemischen Haube und geeignete PSA tragen. </li></ol>

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<li>Yang, Y., Kulangara, K., Sia, J., Wang, L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+Microfluidic+Cell+Culture+Platform+Embedded+with+Nanoscale+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of a Microfluidic Cell Culture Platform Embedded with Nanoscale Features.</a> Lab Chip. 11 (9), 1638-1646 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotopographical+modulation+of+cell+function+through+nuclear+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Nanotopographical modulation of cell function through nuclear deformation.</a> Acs Appl. Mater. Inter. 8 (8), 5082-5092 (2016).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Kulangara, K., Lam, R. T. S., Dharmawan, R., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Topographical+and+Mechanical+Property+Alterations+Induced+by+Oxygen+Plasma+Modification+on+Stem+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Effects of Topographical and Mechanical Property Alterations Induced by Oxygen Plasma Modification on Stem Cell Behavior.</a> ACS Nano. 6 (10), 8591-8598 (2012).</li>
<li>Hua, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Imprint+Lithography+with+Molecular-Scale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Polymer Imprint Lithography with Molecular-Scale Resolution.</a> Nano Lett. 4 (12), 2467-2471 (2004).</li>
<li>Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+molded+polydimethylsiloxane+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures.</a> Adv. Mater. 9 (9), 741-746 (1997).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige und dennoch vielseitige Methode einen großen Bereich von nanostrukturierten Substrat zu erzeugen. Um treu hochdefinierte Nano, große Aufmerksamkeit erweitern sollte auf mehrere kritische Schritte bezahlt werden. Die erste ist die mehrere PDMS Formen zu trimmen. Ungemusterten Bereiche der PDMS Formen entfernt werden müssen. Zusätzlich sollten die Seitenwände der Formen geschnitten werden vertikal so perfekt wie möglich, die Lücken zwischen den Formen zu minimieren. Zus...

Eine Reihe neuerer Befunde zeigen, dass die Substrat-Nanotopographie einen ausgeprägten Einfluss auf das Zellverhalten hat, von der Zelladhäsion über die Ausbreitung und Migration bis hin zur Proliferation und Differenzierung1-6. Zum Beispiel wurden in Zellen, die auf tiefen Nanogittern kultiviert wurden, eine kleinere Zellgröße und eine niedrigere Proliferationsrate beobachtet, die sogar zur Apoptose führte, obwohl die Zellausrichtung, -verlängerung und -migration im Vergleich zu den flachen Kontrollen2,7-10 verbessert wurden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Nanotopographie die Differenzierung von Stammzellen in bestimmte Linien wie Neuron2,11,12, Muskel13 und Knochen3,4 erleichtert. Darüber hinaus besteht aufgrund der zunehmenden Besorgnis über die Toxizität technisch hergestellter Nanomaterialien14,15 die Notwendigkeit, die Nanotopographie in physiologisch relevante In-vitro-Modelle einzubeziehen, um eine genaue Risikobewertung von Nanomaterialien zu ermöglichen. Um die biochemischen und molekularbiologischen Analysen durchzuführen, werden genügend Zellen benötigt, um auf einer großen Fläche nanostrukturierten Substrats gezüchtet zu werden. Herkömmliche Nanofabrikationstechniken haben jedoch Grenzen, um hochdefinierte Nanomuster über einen großen Bereich zu erzeugen.
Selbstorganisation einschließlich Kolloidlithographie16 und Polymerentmischung17 kann problemlos großflächige Nanostrukturen zu geringen Kosten erzeugen. Da die Selbstorganisation auf Wechselwirkungen zwischen den assemblierenden Elementen, wie kolloidalen Partikeln und Makromolekülen, und möglichen Wechselwirkungen zwischen diesen Elementen und dem Substrat beruht, kann sie kein eigenständiges Verfahren zur Herstellung von Nanostrukturen mit präziser räumlicher Positionierung und beliebigen Formen sein18. Auch die damit einhergehende hohe Fehlerdichte ist ein Nachteil. Eine präzise räumliche Kontrolle von Nanomustern kann durch die Verwendung einer schablonenförmigen Selbstorganisation erreicht werden, die lithographische Top-Down-Ansätze verwendet, um die topographische und/oder chemische Schablone bereitzustellen, um die Bottom-up-Assemblierung der Assemblierungselemente19-21 zu leiten. Alternative Nanofabrikationstechniken, wie die Step-and-Flash-Lithographie22 und eine Rolle-zu-Rolle-Nanoimprinting-Lithographie23, wurden entwickelt, sind aber aufgrund ihres ausgeklügelten Prozesses oder des Bedarfs an Spezialgeräten nur begrenzt einsetzbar. Nichtsdestotrotz wird ein Template oder eine Masterform mit definierten nanoskaligen Mustern für schablonenbasierte oder alternative Nanofabrikationstechniken benötigt. 
Solche Schablonen und Urformen werden konventionell mit fokussierter Elektronen-, Ionen- oder Photonenstrahllithographie erzeugt. So können beispielsweise mit der Elektronenstrahllithographie (EBL)24 und der fokussierten Ionenstrahllithographie25 definierte Muster mit einer Auflösung von unter 5 nm erzeugt werden. Die Zwei-Photonen-Lithographie hat eine Strukturgröße von nur 30 nm26 gezeigt. Obwohl die fokussierten Strahllithographietechniken die Erzeugung wohldefinierter nanoskaliger Strukturen ermöglichen, schränken die Kapitalinvestitionen und der zeitaufwändige und kostspielige Prozess ihre breite Verwendung in der akademischen Forschung ein27. Daher ist es sehr wünschenswert, ermöglichende und dennoch erschwingliche Techniken zu entwickeln, um eine große Fläche nanostrukturierter Oberflächen mit hoher Wiedergabetreue herzustellen.
Wir haben über eine einfache, kostengünstige Stichtechnik berichtet, mit der eine große Fläche nanostrukturierter Oberfläche aus einer kleinen, gut definierten Formerzeugt werden kann 28. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren von der Replikation von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS)-Formen unter Verwendung eines EBL-geschriebenen Musters über den Zusammenbau mehrerer PDMS-Formen zu einer einzigen großen Form bis hin zur Erzeugung einer Masterform auf polymeren wie Polystyrol (PS)-Substraten und der Herstellung von Arbeitssubstraten. Mit den expandierten nanostrukturierten Substraten konnten wir die nanotopographische Modulation der Zellausbreitung demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>JEOL Field Emission SEM</td><td>JEOL</td><td>JSM-7600F</td><td>EBL</td></tr><tr><td>E-Beam-Verdampfer</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>Modell: LAB 18 E-Beam-Verdampfer</td><td>Nickelabscheidung</td></tr><tr><td>Trion Minilock III ICP/RIE</td><td>Trion technology</td><td>Modell: Minilock-phantom III</td><td></td></tr><tr><td>Pressmaschine</td><td>PHI Hydraulic Press</td><td>Molde: SQ-230H</td><td></td></tr><tr><td>Spin</td><td>Coater Laurell Technologien</td><td>Modle: WS-400A-6NPP-LITE</td><td></td></tr><tr><td>CO2 kritischer Trockner</td><td>Tousimis</td><td>Modle: Autosamdri-815</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>1080</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumplatten</td><td>McMaster-carr</td><td>9057K123</td><td></td></tr><tr><td>Teflonplatten</td><td>McMaster-carr</td><td>8711K92</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>FALCON</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>60 mm Petrischale</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Abdeckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-34</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Wägeschiffchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-913-360</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Exsikkator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42025-000</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110049SH</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>5726</td><td></td></tr><tr><td>Klinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr><tr><td>Metallblöcke</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punch</td><td>Brettuns Village Leather Craft Supplies</td><td>Arch Punch</td><td></td></tr><tr><td>Poly(methylmethacrylat)</td><td>MicroChem</td><td>495 PMMA A4</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Kit</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol</td><td>Dow Chemical</td><td>Styron 685D</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluoroctylmethyldichlorsilan</td><td>Oakwood Chemical</td><td>7142</td><td></td></tr><tr><td>Entwickler</td><td>MicroChem</td><td>MIBK/IPA im Verhältnis</td><td></td>1:3</tr><tr><td>Entferner</td><td>MicroChem</td><td>Entferner PG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Fisher Scientific</td><td>T324-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiziertes Adlermedium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>15712-S</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>A549 Zellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr></tbody></table>

der ausbau nano substraten stichtechnik für nanotopographical modulation des zellverhaltens

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Die Substrat-Nanotopographie hat sich als potenter Modulator des Zellphänotyps und der Zellfunktion erwiesen. Um die Nanotopographie-Modulation des Zellverhaltens zu analysieren, ist eine große Fläche des nanostrukturierten Substrats wünschenswert, damit genügend Zellen auf der Nanotopographie für nachfolgende biochemische und molekularbiologische Analysen kultiviert werden können. Aktuelle Nanofabrikationstechniken haben jedoch Grenzen, um hochdefinierte Nanomuster über einen großen Bereich zu erzeugen. Hier stellen wir eine Methode vor, um nanostrukturierte Substrate von einem kleinen, hochdefinierten Nanomuster auf eine große Fläche mit Hilfe der Stichtechnik zu erweitern. Das Verfahren kombiniert mehrere Techniken, darunter die weiche Lithographie zur Replikation von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS)-Formen aus einer genau definierten Form, die Stichtechnik, um mehrere PDMS-Formen zu einer einzigen großen Form zusammenzusetzen, und die Nanoprägung zur Erzeugung einer Masterform auf Polystyrol (PS)-Substraten. Mit der PS-Urform stellen wir PDMS-Arbeitssubstrate her und demonstrieren die nanotopographische Modulation der Zellausbreitung. Diese Methode bietet eine einfache, erschwingliche und dennoch vielseitige Möglichkeit, gut definierte Nanomuster über große Flächen zu erzeugen, und wird möglicherweise erweitert, um mikro-/nanoskalige Bauelemente mit Hybridkomponenten herzustellen.

<html> Die Stichtechnik kann einen großen Bereich von nanostrukturierten Substrate mit hoher Genauigkeit erzeugen. Figur 1a und 1b die große Fläche von Nanostrukturen aus dem genähten PDMS - Form zu PS - Platte und PS - Dünnfilm auf einem Si - Substrat bzw. übertragen anzuzeigen. Der Vergleich zwischen dem ursprünglichen EBL geschriebene Form (Abbildung 1c) und die endgültigen PDMS Arbeitssubstrat (Abbildung 1d) bestätigt...

Es wird ein Protokoll zur Herstellung einer großen Fläche von nanostrukturiertem Substrat aus kleinen nanostrukturierten Formen zur Untersuchung der nanotopographischen Modulation des Zellverhaltens vorgestellt.

Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer einfachen, kostengünstigen und dennoch vielseitigen Stich-Technik eine große Fläche eines nanostrukturierten Substrats aus kleinen, nanostrukturierten Formen herzustellen. Diese Methode kann dabei helfen, die Modulation von Zellphänotyp und -funktion durch die Nanotopographie des Substrats auf zellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen, beispielsweise die Expression von Fokaladhäsionsproteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz.Bereiten Sie zunächst die silanisierte Siliziumform im PDMS-Präpolymer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie die silanisierte Siliziumform in eine 60 mm große Petrischale. Gießen Sie das PDMS-Präpolymer auf die Siliziumform in der Petrischale.Stellen Sie die Petrischale in einen Plastikexsikkator und entgasen Sie sie etwa 10 Minuten lang, bis alle Blasen verschwunden sind. Übertragen Sie die Petrischale auf eine Heizplatte und härten Sie das PDMS-Präpolymer bei 70 Grad Celsius vier Stunden lang aus. Lösen Sie die PDMS-Form vorsichtig mit einer Pinzette von der Silikonform ab.Bestimmen Sie die Orientierung anisotroper PDMS-Nanomuster, wie z. B. Nanogitter, unter einem optischen Mikroskop und markieren Sie diese mit einem Markierstift auf der Rückseite der PDMS-Formen. Reinigen Sie das Silizium-Substrat mit Ethanol in einem Abzug und trocknen Sie es anschließend mit Druckluft. Schneiden Sie die unstrukturierten Bereiche jeder PDMS-Form mit einer Klinge ab.Die PDMS-Formen sollten so nah wie möglich, aber ohne die umgebende Form zu berühren, ausgerichtet werden, um den unstrukturierten Bereich zu minimieren und eine Beschädigung der Nanomusterung durch Verformung beim Aufbringen der Kompressionskraft zu vermeiden. Platziere die zugeschnittene PDMS-Form mit der Nanomusterung nach unten auf die Spiegelseite des Silizium-Substrats und richte anschließend die anderen Formen nahe, aber ohne Berührung, zu den umgebenden Formen aus. Es ist entscheidend, darauf zu achten, dass das PDMS in der Basisschicht aushärtet, da ungehärtetes PDMS durch die Spalte zwischen den mehreren Formen fließen und die Nanomuster beschädigen könnte.Jedoch kann vollständig ausgehärtetes PDMS die mehrfachen Formen nicht miteinander verbinden. Um eine PDMS-Klebeschicht herzustellen, gießen Sie ein Gramm entgastes PDMS-Präpolymer auf einen sauberen Objektträger, um eine 0,5 Millimeter dicke Schicht zu bilden. Härten Sie die PDMS-Schicht drei bis fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius auf einer Heizplatte aus.Verwenden Sie eine Nadel, um die Schicht zu berühren, und stellen Sie sicher, dass die Schicht teilweise, aber nicht vollständig ausgehärtet ist. Legen Sie die PDMS-Schicht auf die Rückseite der ausgerichteten PDMS-Formen, drehen Sie diese Anordnung schnell um und übertragen Sie sie auf die Heizplatte. Üben Sie eine Druckkraft mithilfe eines Metallblocks auf der Oberseite der Anordnung aus, um einen guten Kontakt zwischen der klebenden PDMS-Schicht und der Rückseite der PDMS-Formen sicherzustellen.Härten Sie die PDMS-Klebeschicht bei 100 Grad Celsius eine Stunde lang aus. Schalten Sie die Heizplatte aus, entfernen Sie den Metallblock und lösen Sie die zusammengenähte PDMS-Form vorsichtig vom Silizium-Substrat. Um die zusammengenähte PDMS-Form in die PS-Platte zu nanoimprägen, legen Sie die PS-Platte in einen Aluminiumabstandshalter, der auf einer drei Zoll großen Siliziumscheibe platziert ist.Erhitzen Sie die PS-Platte 30 Minuten lang auf einer Heizplatte auf 250 Grad Celsius. Anschließend platzieren Sie die zusammengesetzte PDMS-Form mit der nanostrukturierten Seite nach unten auf die geschmolzene PS-Platte. Danach legen Sie eine Aluminiumplatte auf die Glasplatte der zusammengesetzten PDMS-Form.Üben Sie einen Druck durch Metallblöcke auf der Aluminiumplatte aus und warten Sie drei Minuten. Heben Sie den Metallblock von der Aluminiumplatte ab, setzen Sie ihn erneut auf und erhöhen Sie den Druck auf 25 Kilopascal. Wiederholen Sie diesen Schritt anschließend mit einem erhöhten Druck von 50 Kilopascal.Halten Sie die Temperatur des Heizplättchens bei konstantem Druck von 50 Kilopascal zwischen 240 und 250 Grad Celsius für 15 Minuten aufrecht. Schalten Sie das Heizplättchen aus und kühlen Sie die gesamte Apparatur ab. Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 Grad Celsius gesunken ist, und lösen Sie vorsichtig die genähte PDMS-Form von der PS-Platte.Um die PDMS-Form auf einem PS-Dünnschichtfilm nanozu prägen, platzieren Sie die zusammengesetzte PDMS-Form mit der nanostrukturierten Oberfläche nach unten auf dem PS-Dünnschichtfilm, der auf einer Heizplatte liegt. Üben Sie einen Druck von 12 Kilopascal auf die PDMS-Form aus, indem Sie Metallblöcke auf den Glasobjektträger der PDMS-Form legen. Erhöhen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 180 Grad Celsius und halten Sie diese 15 Minuten lang konstant. Schalten Sie das Heizgerät aus und kühlen Sie die gesamte Apparatur ab. Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 Grad Celsius gefallen ist, und lösen Sie vorsichtig die strukturierte PDMS-Form vom PS-Film. Schneiden Sie mit einem hohlen Stahlrundstanzwerkzeug die nanostrukturierten PDMS-Substrate in Scheiben, die der Konfiguration einer bestimmten Mehrfach-Well-Platte entsprechen.Verwenden Sie dann Pinzetten, um die PDMS-Scheiben in die Vertiefungen der Mehrfach-Platte zu legen. Sterilisieren Sie die PDMS-Substrate durch 30-minütige Behandlung mit 70 % Ethanol. Danach aspirieren Sie das Ethanol und führen anschließend eine Bestrahlung mit UV-Licht für 30 Minuten durch.Waschen Sie die PDMS-Substrate dreimal mit 1X steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Anschließend beschichten Sie die PDMS-Substrate 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem extrazellulären Matrixprotein. Spülen Sie die PDMS-Substrate dreimal mit steriler PBS, jeweils fünf Minuten lang.Suspendieren Sie humane A549-Lungenkarzinomzellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fetalem Kälberserum und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 2.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf den PDMS-Substraten aus. Kultivieren Sie die Zellen einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid und beobachten Sie sie danach.Das erzeugte Nanomuster auf der PS-Platte und dem Dünnfilm wird hier gezeigt. Die Pfeile zeigen die Polymererhebungen in den Zwischenräumen der zusammengenähten PDMS-Formen an. Diese REM-Aufnahmen zeigen, dass die PDMS-Arbeitssubstrate durch Anwendung der Nähtechnik exakt vom mittels Elektronenstrahllithographie erzeugten Nanomuster übertragen werden.Hier sind repräsentative REM-Bilder von A549-Zellen, die auf Nanorillen und Nanosäulen kultiviert wurden. Die Zellen zeigen eine ausgerichtete Morphologie auf den Nanorillen, während sie sich auf den Nanosäulen zufällig ausbreiten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man durch das Zusammensetzen mehrerer kleiner, definierten nanobestückter Formen ein großflächiges, nanostrukturiertes Substrat herstellt.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Toluol und Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und tragen Sie stets geeignete persönliche Schutzausrüstung, während Sie die Verfahren durchführen.

expanding-nanopatterned-substrates-using-stitch-technique-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Wir berichten über Techniken zur Mikrostruktur nanoporöse Gold Dünnschichten durch Schablonendruck und Photolithographie, sowie Verfahren zur Kultivierung von Zellen auf den mikrofabrizierten Muster. Darüber hinaus beschreiben wir Bildanalysemethoden der Morphologie des Materials und der kultivierten Zellen mit dem Rasterelektronenmikroskop und Fluoreszenzmikroskopie zu charakterisieren.

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO 2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO 2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO 2-Regionen zurückgeschlagen.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Dieses Manuskript stellt eine Technik, um auf adhärenten Zellen oder Gewebe gelten oder freiKräfte mit unidirektionalen Stretching.

Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die intrinsische Fähigkeit zu differenzieren und sich selbst zu organisieren in verschiedene Gewebemuster; obwohl dies erfordert die Darstellung der räumlichen Umweltgradienten. Wir präsentieren Schablone Mikro als einfache und robuste Methode biochemische und mechanische Gradienten zu erzeugen, für HPSC Differenzierungsmuster zu steuern.

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Fertigung der gradient Nanopattern Platten über thermische Nanoimprinting und die Methode der screening-Antworten der menschlichen endotheliale Vorläuferzellen in Nanostrukturen. Durch den Einsatz der beschriebenen Technologie ist es möglich, ein Gerüst zu produzieren, die Zelle Verhalten durch physikalische Reize bearbeiten können.

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.

Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Herstellung von Mikromustern, die die Zellform standardisieren, um Zytoskelettstrukturen in Säugetierzellen zu untersuchen. Diese benutzerfreundliche Technik kann mit handelsüblichen Bildgebungssystemen eingerichtet werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die für Standard-Zellbiologielabore unzugänglich ist.

Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Traditionell wird die Zellkultur auf planaren Substraten durchgeführt, die die natürliche Umgebung von Zellen in vivo schlecht nachahmen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von Zellkultursubstraten mit physiologisch relevanten gekrümmten Geometrien und mikrostrukturierten extrazellulären Proteinen, die systematische Untersuchungen der zellulären Erfassung dieser extrazellulären Hinweise ermöglicht.

Erzeugung von Multicue-Zellmikroumgebungen durch UV-Photostrukturierung von dreidimensionalen Zellkultursubstraten

Lernen Sie eine kostengünstige Stitch-Technik zur Herstellung großflächiger nanopatternierter Substrate aus kleinen Siliziumformen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung nanotopographischer Modulation des Zellverhaltens.

Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

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