Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine große Fläche aus nanostrukturiertem Substrat aus kleinen nanostrukturierten Formen herzustellen, indem eine einfache und kostengünstige, aber dennoch vielseitige Stichtechnik verwendet wird. Diese Methode kann helfen, die Substrat-Nanotopographie, die Modulation des Zellphänotyps und der Zellfunktion auf zellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen, wie z. B. die Expression von fokalen Adhäsionsproteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach und kostengünstig ist.

Bereiten Sie zunächst die silanisierte Silikonform im PDMS-Prepolymer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie die silanisierte Silikonform in eine 60 Millimeter große Petrischale. Gießen Sie das PDMS-Präpolymer auf die Silikonform in der Petrischale.

Stellen Sie die Petrischale in einen Exsikkator aus Plastik und entgasen Sie sie für ca. 10 Minuten, bis alle Blasen verschwunden sind. Übertragen Sie die Petrischale auf eine heiße Platte und härten Sie das PDMS-Prepolymer vier Stunden lang bei 70 Grad Celsius aus. Ziehen Sie die PDMS-Form vorsichtig mit einer Pinzette von der Silikonform ab.

Bestimmen Sie die Orientierung von anisotropen PDMS-Nanomustern, wie z. B. Nanogittern, unter einem Lichtmikroskop und markieren Sie diese mit einem Markierungsstift auf der Rückseite der PDMS-Formen. Reinigen Sie das Silikonsubstrat mit Ethanol in einem Abzug und trocknen Sie es anschließend mit Druckluft. Schneiden Sie die unstrukturierten Bereiche jeder PDMS-Form mit einer Klinge ab.

Die PDMS-Formen sollten so nah wie möglich ausgerichtet werden, aber die umgebende Form nicht berühren, um den unstrukturierten Bereich zu minimieren und eine Berührung mit der Nanomusterverformung zu vermeiden, wenn die Kompressorkraft ausgeübt wird. Platzieren Sie die zugeschnittene PDMS-Form mit dem Nanomuster nach unten auf der Spiegelseite des Silikonsubstrats und richten Sie dann die anderen Formen in der Nähe der umgebenden Formen aus, berühren Sie sie jedoch nicht. Es ist wichtig, zu versuchen, das PDMS in der Basalschicht auszuhärten, da nicht ausgehärtetes PDMS durch den Spalt zwischen den verschiedenen Formen fließen und die Nanomuster beschädigen kann.

Das vollständig ausgehärtete PDMS kann die verschiedenen Formen jedoch nicht miteinander verbinden. Um eine PDMS-Klebeschicht herzustellen, gießen Sie ein Gramm entgastes PDMS-Prepolymer auf einen sauberen Objektträger, um eine 0,5 Millimeter dicke Schicht zu bilden. Die PDMS-Schicht bei 100 Grad Celsius auf einer heißen Platte drei bis fünf Minuten backen.

Berühren Sie die Schicht mit einer Nadel und stellen Sie sicher, dass die Schicht teilweise, aber nicht vollständig ausgehärtet ist. Platzieren Sie die PDMS-Schicht auf der Rückseite der ausgerichteten PDMS-Formen, drehen Sie diese Baugruppe schnell um und übertragen Sie sie auf die Heizplatte. Üben Sie eine Druckkraft mit einem Metallblock auf der Oberseite der Baugruppe aus, um einen guten Kontakt zwischen der PDMS-Klebeschicht und der Rückseite der PDMS-Formen zu gewährleisten.

Härten Sie die PDMS-Klebeschicht eine Stunde lang bei 100 Grad Celsius aus. Schalten Sie die Heizplatte aus, entfernen Sie den Metallblock und ziehen Sie die einfach genähte PDMS-Form vom Silikonsubstrat ab. Um die genähte PDMS-Form in die PS-Platte zu nanoimprinten, platzieren Sie die PS-Platte in einem Aluminium-Abstandshalter, der auf einem drei Zoll großen Siliziumwafer gesetzt ist.

Die PS-Platte auf einer heißen Platte bei 250 Grad Celsius 30 Minuten erhitzen. Legen Sie dann die genähte PDMS-Form mit den Nanomustern nach unten auf die geschmolzene PS-Platte. Legen Sie als Nächstes eine Aluminiumplatte auf den Glasschieber der genähten PDMS-Form.

Üben Sie mit Metallblöcken auf der Aluminiumplatte einen Druckdruck aus und warten Sie drei Minuten. Heben Sie den Metallblock von der Aluminiumplatte an, setzen Sie ihn wieder ein und erhöhen Sie den Druckdruck auf 25 Kilopascal. Wiederholen Sie dann diesen Schritt mit einem auf 50 Kilopascal erhöhten Druck.

Halten Sie die Temperatur der Heizplatte 15 Minuten lang zwischen 240 und 250 Grad Celsius unter einem konstanten Druck von 50 Kilopascal. Schalten Sie die Kochplatte aus und kühlen Sie das gesamte Setup ab. Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 Grad Celsius gefallen ist, und ziehen Sie die genähte PDMS-Form vorsichtig von der PS-Platte ab.

Um die PDMS-Form auf einen PS-Dünnfilm zu nanoimprinten, platzieren Sie die genähte PDMS-Form mit der Nanotopographie mit der Vorderseite nach unten auf der PS-Dünnschicht, die auf eine Heizplatte gelegt wird. Üben Sie einen Druckdruck von 12 Kilopascal auf die PDMS-Form aus, indem Sie Metallblöcke auf den Glasschieber der PDMS-Form verwenden. Erhöhen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 180 Grad Celsius und halten Sie sie 15 Minuten lang.

Schalten Sie die Kochplatte aus und kühlen Sie das gesamte Setup ab. Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 Grad Celsius gefallen ist, und ziehen Sie die genähte PDMS-Form vorsichtig von der PS-Folie ab. Schneiden Sie die nanostrukturierten PDMS-Substrate mit einem hohlen Stahl-Bogenstempel in Scheiben, um sie an die Konfiguration einer bestimmten Multi-Well-Platte anzupassen.

Setzen Sie dann die PDMS-Discs mit einer Pinzette in die Vertiefungen der Multi-Well-Platte ein. Sterilisieren Sie die PDMS-Substrate 30 Minuten lang mit 70 % Ethanol. Anschließend wird das Ethanol abgesaugt und anschließend 30 Minuten lang UV-Strahlung durchgeführt.

Waschen Sie die PDMS-Substrate dreimal mit 1X steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Beschichten Sie anschließend die PDMS-Substrate 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit extrazellulärem Matrixprotein. Spülen Sie die PDMS-Substrate dreimal mit sterilem PBS aus, jeweils fünf Minuten lang.

Suspendieren Sie humane A549-Lungenkrebszellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Plattieren Sie die Zellen mit einer Aussaatdichte von 2.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf den PDMS-Substraten. Kultivieren Sie die Zellen einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid enthält, und beobachten Sie sie anschließend.

Das erzeugte Nanomuster auf der PS-Platte und der dünne Film sind hier zu sehen. Die Pfeile zeigen die Polymererhöhung in den Zwischenräumen der genähten PDMS-Formen an. Diese REM-Bilder zeigen, dass PDMS-Arbeitssubstrate durch Anwendung der Stitch-Technik originalgetreu aus dem mit Elektronenstrahllithographie geschriebenen Nanomuster übertragen werden.

Hier sind repräsentative REM-Bilder von A549-Zellen zu sehen, die auf Nanogittern und Nanosäulen gezüchtet wurden. Die Zellen zeigen eine ausgerichtete Zellmorphologie auf den Nanogittern, während sich die Zellen zufällig auf den Nanosäulen ausbreiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine große Fläche aus nanostrukturiertem Substrat erzeugen können, indem Sie mehrere, kleine definierte nanostrukturierte Formen zusammennähen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Toluol und Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und tragen Sie bei der Durchführung der Eingriffe immer geeignete persönliche Schutzausrüstung.