Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer einfachen, kostengünstigen und dennoch vielseitigen Stich-Technik eine große Fläche eines nanostrukturierten Substrats aus kleinen, nanostrukturierten Formen herzustellen. Diese Methode kann dabei helfen, die Modulation von Zellphänotyp und -funktion durch die Nanotopographie des Substrats auf zellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen, beispielsweise die Expression von Fokaladhäsionsproteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz.

Bereiten Sie zunächst die silanisierte Siliziumform im PDMS-Präpolymer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie die silanisierte Siliziumform in eine 60 mm große Petrischale. Gießen Sie das PDMS-Präpolymer auf die Siliziumform in der Petrischale.

Stellen Sie die Petrischale in einen Plastikexsikkator und entgasen Sie sie etwa 10 Minuten lang, bis alle Blasen verschwunden sind. Übertragen Sie die Petrischale auf eine Heizplatte und härten Sie das PDMS-Präpolymer bei 70 Grad Celsius vier Stunden lang aus. Lösen Sie die PDMS-Form vorsichtig mit einer Pinzette von der Silikonform ab.

Bestimmen Sie die Orientierung anisotroper PDMS-Nanomuster, wie z. B. Nanogitter, unter einem optischen Mikroskop und markieren Sie diese mit einem Markierstift auf der Rückseite der PDMS-Formen. Reinigen Sie das Silizium-Substrat mit Ethanol in einem Abzug und trocknen Sie es anschließend mit Druckluft. Schneiden Sie die unstrukturierten Bereiche jeder PDMS-Form mit einer Klinge ab.

Die PDMS-Formen sollten so nah wie möglich, aber ohne die umgebende Form zu berühren, ausgerichtet werden, um den unstrukturierten Bereich zu minimieren und eine Beschädigung der Nanomusterung durch Verformung beim Aufbringen der Kompressionskraft zu vermeiden. Platziere die zugeschnittene PDMS-Form mit der Nanomusterung nach unten auf die Spiegelseite des Silizium-Substrats und richte anschließend die anderen Formen nahe, aber ohne Berührung, zu den umgebenden Formen aus. Es ist entscheidend, darauf zu achten, dass das PDMS in der Basisschicht aushärtet, da ungehärtetes PDMS durch die Spalte zwischen den mehreren Formen fließen und die Nanomuster beschädigen könnte.

Jedoch kann vollständig ausgehärtetes PDMS die mehrfachen Formen nicht miteinander verbinden. Um eine PDMS-Klebeschicht herzustellen, gießen Sie ein Gramm entgastes PDMS-Präpolymer auf einen sauberen Objektträger, um eine 0,5 Millimeter dicke Schicht zu bilden. Härten Sie die PDMS-Schicht drei bis fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius auf einer Heizplatte aus.

Verwenden Sie eine Nadel, um die Schicht zu berühren, und stellen Sie sicher, dass die Schicht teilweise, aber nicht vollständig ausgehärtet ist. Legen Sie die PDMS-Schicht auf die Rückseite der ausgerichteten PDMS-Formen, drehen Sie diese Anordnung schnell um und übertragen Sie sie auf die Heizplatte. Üben Sie eine Druckkraft mithilfe eines Metallblocks auf der Oberseite der Anordnung aus, um einen guten Kontakt zwischen der klebenden PDMS-Schicht und der Rückseite der PDMS-Formen sicherzustellen.

Härten Sie die PDMS-Klebeschicht bei 100 Grad Celsius eine Stunde lang aus. Schalten Sie die Heizplatte aus, entfernen Sie den Metallblock und lösen Sie die zusammengenähte PDMS-Form vorsichtig vom Silizium-Substrat. Um die zusammengenähte PDMS-Form in die PS-Platte zu nanoimprägen, legen Sie die PS-Platte in einen Aluminiumabstandshalter, der auf einer drei Zoll großen Siliziumscheibe platziert ist.

Erhitzen Sie die PS-Platte 30 Minuten lang auf einer Heizplatte auf 250 Grad Celsius. Anschließend platzieren Sie die zusammengesetzte PDMS-Form mit der nanostrukturierten Seite nach unten auf die geschmolzene PS-Platte. Danach legen Sie eine Aluminiumplatte auf die Glasplatte der zusammengesetzten PDMS-Form.

Üben Sie einen Druck durch Metallblöcke auf der Aluminiumplatte aus und warten Sie drei Minuten. Heben Sie den Metallblock von der Aluminiumplatte ab, setzen Sie ihn erneut auf und erhöhen Sie den Druck auf 25 Kilopascal. Wiederholen Sie diesen Schritt anschließend mit einem erhöhten Druck von 50 Kilopascal.

Halten Sie die Temperatur des Heizplättchens bei konstantem Druck von 50 Kilopascal zwischen 240 und 250 Grad Celsius für 15 Minuten aufrecht. Schalten Sie das Heizplättchen aus und kühlen Sie die gesamte Apparatur ab. Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 Grad Celsius gesunken ist, und lösen Sie vorsichtig die genähte PDMS-Form von der PS-Platte.

Um die PDMS-Form auf einem PS-Dünnschichtfilm nanozu prägen, platzieren Sie die zusammengesetzte PDMS-Form mit der nanostrukturierten Oberfläche nach unten auf dem PS-Dünnschichtfilm, der auf einer Heizplatte liegt. Üben Sie einen Druck von 12 Kilopascal auf die PDMS-Form aus, indem Sie Metallblöcke auf den Glasobjektträger der PDMS-Form legen. Erhöhen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 180 Grad Celsius und halten Sie diese 15 Minuten lang konstant.

Schalten Sie das Heizgerät aus und kühlen Sie die gesamte Apparatur ab. Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 Grad Celsius gefallen ist, und lösen Sie vorsichtig die strukturierte PDMS-Form vom PS-Film. Schneiden Sie mit einem hohlen Stahlrundstanzwerkzeug die nanostrukturierten PDMS-Substrate in Scheiben, die der Konfiguration einer bestimmten Mehrfach-Well-Platte entsprechen.

Verwenden Sie dann Pinzetten, um die PDMS-Scheiben in die Vertiefungen der Mehrfach-Platte zu legen. Sterilisieren Sie die PDMS-Substrate durch 30-minütige Behandlung mit 70 % Ethanol. Danach aspirieren Sie das Ethanol und führen anschließend eine Bestrahlung mit UV-Licht für 30 Minuten durch.

Waschen Sie die PDMS-Substrate dreimal mit 1X steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Anschließend beschichten Sie die PDMS-Substrate 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem extrazellulären Matrixprotein. Spülen Sie die PDMS-Substrate dreimal mit steriler PBS, jeweils fünf Minuten lang.

Suspendieren Sie humane A549-Lungenkarzinomzellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fetalem Kälberserum und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 2.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf den PDMS-Substraten aus. Kultivieren Sie die Zellen einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid und beobachten Sie sie danach.

Das erzeugte Nanomuster auf der PS-Platte und dem Dünnfilm wird hier gezeigt. Die Pfeile zeigen die Polymererhebungen in den Zwischenräumen der zusammengenähten PDMS-Formen an. Diese REM-Aufnahmen zeigen, dass die PDMS-Arbeitssubstrate durch Anwendung der Nähtechnik exakt vom mittels Elektronenstrahllithographie erzeugten Nanomuster übertragen werden.

Hier sind repräsentative REM-Bilder von A549-Zellen, die auf Nanorillen und Nanosäulen kultiviert wurden. Die Zellen zeigen eine ausgerichtete Morphologie auf den Nanorillen, während sie sich auf den Nanosäulen zufällig ausbreiten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man durch das Zusammensetzen mehrerer kleiner, definierten nanobestückter Formen ein großflächiges, nanostrukturiertes Substrat herstellt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Toluol und Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann, und tragen Sie stets geeignete persönliche Schutzausrüstung, während Sie die Verfahren durchführen.