Name: Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung und Aufreinigung eines natürlichen Antibiotikums aus Streptomyces diastatochromogenes. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des Biosynthesegenclusters durch Genom-Mining.

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S. Zhang wird vom China Scholarship Council finanziert. Die Autoren sind den ehemaligen Mitarbeitern, die in diesem Labor am Polyketomycin-Projekt arbeiten, und Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler von der Universität Tübingen sehr dankbar für die Bereitstellung des Polyketomycin-Herstellers. Die Forschung wurde von der DFG gefördert (GRK 1976).

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Labor wurde eine genomische Cosmid - Bibliothek von Streptomyces diastatochromogenes erzeugt und abgeschirmt vor vielen Jahren, was zur Identifizierung des polyketomycin Gencluster durch ein extrem zeitaufwändiger Prozess. Charakterisierung einzelner Gene möglich waren Zielgen Deletionen unter Verwendung und Analyse der resultierenden Mutanten 12. Vor kurzem wurde ein Entwurf Genomsequenz von S. diastatochromogenes erhalten die schnelle Identifizierung des polyketomycin Biosynthesegenclusters ermöglicht. Wir könnten die Biosynthesegene leicht erkennen, obwohl der Entwurf Genomsequenz noch viele contigs enthält. Das beschriebene Verfahren kann innerhalb von Monaten erreicht werden. Jedoch umfaßt das Verfahren viele Schritte. Einzelne Schritte können mehrmals fehlschlagen, das Fortschreiten zu den nachfolgenden Schritten zu verhindern: Die Gattung Streptomyces ist bekannt für seine Fähigkeit bioaktiven Verbindungen herzustellen. Während sie tragen oft mehr als 20 BIOSynthetic Gencluster, in der Regel nur eine oder zwei Verbindungen, die unter Laborbedingungen hergestellt werden. Die Anwendung des OSMAC Ansatz (Kultivierung eines Stamms unter verschiedenen Bedingungen) stillen Gencluster aufwachen kann manchmal nicht genug sein. Genetische Manipulation von regulatorischen Genen, wie beispielsweise die pleiotrope Regulatorgene ADPA 44 und BLDA 45,46, ist auch eine wirksame Methode , um die Produktion von anderen Sekundärmetaboliten zu aktivieren. Für die Aufklärung der Struktur der Verbindung, beispielsweise durch NMR - Analyse, in der Regel mehr als 2 mg gereinigte Verbindung notwendig ist . Daher Fermentation von mehr als 10 L-Kultur ist oft erforderlich. Ohne einen Fermenter, die Sauerstoff, pH und Temperaturbedingungen in der Lage zu halten, kann es in einem kleinen Labor schwierig sein, diese Menge an Kultur und anschließende Extraktion zu handhaben. Während der Reinigung kann die Verbindung aufgrund von Oxidation, Strahlung oder Temperatur verändert.Auch sind die mehreren Reinigungsschritten, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit der Verschlechterung verwendet. Wenn die Struktur des Naturstoffs zu untersuchen und die Cluster im Genom, manchmal ist es nicht so einfach, die entsprechenden Cluster zu identifizieren. Erstens, wenn es nur einen Entwurf Genomsequenz ein Teil des Clusters möglicherweise fehlt ist. Zweitens sind nicht alle Gene, die für die Biosynthese erforderlich sind, sind in dem Cluster. Drittens wird manchmal ein Cluster in zwei Teile voneinander von vielen Kilobasen getrennt gespalten. Viertens kann es schwierig sein, zu entscheiden, welches das entsprechende Gen-Cluster ist. Bei großen PKS vom Typ I oder NRPS-Systemen, wo es möglich ist, die Anzahl der Verlängerungseinheiten basierend auf der Anzahl von Modulen oder sogar identifizieren die einzelnen Verlängerungseinheiten durch Analyse der Auswahl Domänen zu berechnen, stellt sich leicht auf. Jedoch im Fall der iterativ arbeitEnzymen die Vorhersage der synthetisierten Verbindungen oft nicht möglich ist, insbesondere wenn die Strain mehr als 40 Gencluster. Fünftens ist die Natur sehr komplex und voller noch unbekannte Verbindungen. Oft ist die Biosynthese ist eine Mischung von verschiedenen Wegen. Wenn die neue Verbindung noch nicht identifiziert worden ist, oder nicht in eine andere Verbindung im Zusammenhang, kann es schwierig sein, den Cluster zu identifizieren, eine Biosynthese Modell vorzuschlagen, und um es zu beweisen. Sobald der Cluster identifiziert wird, ist die einzige Crossover-Technik eine gute und schnelle Methode, um die Hypothese zu überprüfen. PCR, Klonierung in einen Suizidvektor, Konjugation, Auswahl von positiven Klonen und die Produktion Test sind die einzigen Schritte erforderlich. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die Integration des Vektors in das Chromosom nicht stabil ist durch weitere Rekombinationsereignisse. Deshalb, um einzelne Gene, präzise Gendeletionen weiter zu analysieren sind erforderlich. Auch kann es schwierig sein , Streptomyces - Stämmen auf der genetischen Ebene zu manipulieren. Die beschriebene Vorgehensweise kann t zugeordnet werdeno andere Verbindung , die durch einen Streptomyces - Stamm oder einem anderen Mikroorganismus hergestellt. Das Wissen über ein Gencluster und seine synthetisierte Verbindung gibt uns weitere Möglichkeiten zu modifizieren bereits bestehenden Moleküle mit dem Ziel, sie für den Kampf gegen multiresistente Erreger zu verbessern.

Natürliche Produkte aus Pflanzen und Mikroorganismen haben immer eine wichtige Quelle für die klinische Entwicklung von Arzneimitteln und Forschung. Das erste Antibiotikum Penicillin wurde 1928 von einem Pilz von Alexander Fleming 1 entdeckt. Heutzutage sind viele natürliche Produkte in der klinischen Behandlung eingesetzt. Eine Gattung bekannt für ihre Fähigkeit , verschiedene Arten von sekundären Metaboliten mit verschiedenen biologischen Aktivitäten herzustellen , ist Streptomyces. Streptomyces sind grampositive Bakterien und gehören zu der Klasse von Actinobacteria und der Ordnung Actinomycetales. Fast zwei Drittel der klinisch verwendeten Antibiotika sind aus Actinomycetales abgeleitet, vor allem aus Streptomyces, wie Amphotericin 2, Daptomycin 3 oder Tetracyclin 4. Zwei Nobelpreise wurden auf dem Gebiet der Streptomyces Antibiotikaforschung ausgezeichnet. Der erste ging an Selman Waksman für die Entdeckung von Streptomycin, wobei die erste einetibiotic wirksam gegen Tuberkulose. 5 Im Jahr 2015 als Teil des Nobelpreis für Physiologie und Medizin, die Entdeckung von Avermectin von S. avermitilis wurde ebenfalls ausgezeichnet. Avermectin wird zur Behandlung von parasitären Erkrankungen 6,7 verwendet. Der traditionelle Ansatz für die Entdeckung von Naturprodukten in Mikroorganismen wie Streptomyces umfaßt im allgemeinen Kultivierung des Stammes unter verschiedenen Wachstumsbedingungen, sowie die Extraktion und Analyse von Sekundärmetaboliten. Bioaktivität Assays (beispielsweise Tests für antibakterielle und Anti - Krebs - Aktivität) werden durchgeführt , um die Aktivität der Verbindung zu erfassen. Schließlich wird die Verbindung von Interesse isoliert, und die chemische Struktur aufgeklärt wird. Die Strukturen von Naturprodukten sind oft aus einzelnen Einheiten zusammengesetzt, die komplexe Moleküle bilden. Es gibt ein paar, aber begrenzt, großen Biosynthesewege zu führenden Blockbildungks, die für die Biosynthese von Naturprodukten verwendet werden. Die wichtigsten Biosynthesewege sind die Polyketid-Bahnen, Bahnen, die zu Terpenoide und Alkaloide, Wege Aminosäuren verwendet und Wege zu Zuckergruppen führen. Jeder Weg wird durch einen Satz von spezifischen Enzymen 8 gekennzeichnet. Auf der Basis der Struktur der Verbindung können diese biosynthetischen Enzyme vorhergesagt werden. Heute kann die detaillierte Strukturanalyse einer Verbindung in Kombination mit der nächsten Generation Sequenzierung und bioinformatischen Analyse helfen den verantwortlichen Biosynthesegenclusters zu identifizieren. Die Cluster-Informationen eröffnet neue Wege für die weitere Naturstoffforschung auf. Dazu gehören die heterologe Expression die Ausbeute des Naturprodukt, gezielte Verbindung Modifikation durch Gen-Deletion oder Veränderung und kombinatorische Biosynthese mit Genen von anderen Bahnen zu erhöhen. Polyketomycin wurde unabhängig von der Kulturbrühe isoliertzwei Stämme, Streptomyces sp. MK277-AF1 9 und Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 10. Die Struktur wurde durch NMR und Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt. Polyketomycin besteht aus einem tetracyclischen decaketid und einem dimethyl Salicylsäure, verbunden durch die beiden Desoxyzucker Einheiten β-D-amicetose und α-L-axenose. Es zeigt zytotoxische und antibiotische Aktivität, auch gegen Gram-positive multidrug-resistente Stämme wie MRSA 11. Eine genomische Cosmid - Bibliothek von S. diastatochromogenes Tü6028 erzeugt wurde und vor vielen Jahren untersucht. Mit Hilfe spezifischer Gensonden die polyketomycin Gencluster mit einer Größe von 52,2 kb, enthält 41 Gene wurden 12 nach mehreren Monaten intensiver Arbeit identifiziert. Vor kurzem wurde ein Entwurf Genomsequenz von S. diastatochromogenes erhalten die schnelle Identifizierung des polyketomycin Gencluster führt. In dieser Übersicht hilft ein Verfahren zu identifizieren ein natürliches Produkt und verdeutlichen seine Biosynthesegenclusters beschrieben werden, als Beispiel polyketomycin. Hier erläutern wir die einzelnen Schritte , die von einem natürlichen Produkt seiner Biosynthesegenclusters für polyketomycin hergestellt gezeigt führen durch Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Das Protokoll umfasst die Identifizierung und Reinigung eines Naturprodukt mit antibiotischen Eigenschaften. Weitere strukturelle Analyse und den Vergleich mit den Ergebnissen aus Genom-Mining führen zur Identifizierung des Biosynthesegenclusters. Dieses Verfahren kann aus einem Streptomyces - Stamm oder einem anderen Mikroorganismus abgeleitet jede andere Verbindung angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>agar</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>5210.4</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>6352.4</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>4175,1</td><td></td></tr><tr><td>Glukose&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>6780.1</td><td></td></tr><tr><td>LB&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>X964.3</td><td></td></tr><tr><td>Malzextrakt&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>X976.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepton&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sojamehl&nbsp;</td><td>W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Deutschland</td><td></td><td>Hensec-Vollsoja</td></tr><tr><td>tryptische Sojabrühe</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>X938.3</td><td>Caso-Bouillon</td></tr><tr><td>Hefeextrakt&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Solvents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>3738.5</td><td></td></tr><tr><td>Aceton&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Avantor Performance Materials B.V., Deventer, Niederlande</td><td>JT-9012-03</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorofrom&nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland</td><td>1530754</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>4720,1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO-d6 (Dimethylsulfoxid-d6) 99,9 Atom% D</td><td>ARMAR Chemicals, D&omm; ttingen, Schweiz</td><td>15200.204</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>6784.4</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>6331.4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsenzyme</td><td>New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polymerase&nbsp;</td><td>New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-Polymerase I Large (Klenow) Fragment</td><td>Promega GmbH, Mannheim, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apramycin</td><td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Deutschland&nbsp;</td><td>A7682.0005</td><td></td></tr><tr><td>fosfomycin</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland</td><td>P5396-50G</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid/Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKC1132</td><td>Bierman et al. 1992</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer& nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pokPI_for</td><td>TGATGGTGCCGCTGGCCATGG</td><td>Primer zur Amplifikation eines Fragments, das das pokPI-Gen</td><td></td></tr><tr><td>pokPI_rev</td><td>AGCGTTCACTGTTCCGCCGAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bakterienstämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis COHN ATCC6051</td><td></td><td>Gram-positiver Teststamm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli ET12567 pUZ8002&nbsp;</td><td>MacNeil et al. 1992</td><td>Stamm für die Konjugation</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1</td><td>Blue Agilient Technologies, Santa Clara, USA</td><td>Gramnegativer Teststamm + Klonierungswirt&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces diastatochromogenes T&uuml; 6028</td><td>Paululat et al., 1999</td><td>Polyketomycin producer</td><td></td></tr><tr><td>Online services</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell)</td><td>http://antismash.secondarymetabolites.org/</td> <td>Nachweis des Sekundärmetaboliten-Genclusters</td><td></td></tr><tr><td>BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td><td>findet Ähnlichkeitsbereiche zwischen biologischen Sequenzen</td><td></td></tr><tr><td>GenDB</td><td>https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb</td><td>Annotation von ORFs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene Cluster)</td><td>http://mibig.secondarymetabolites.org/</td> <td>Datenbank biosynthetischer Gencluster</td><td></td></tr><tr><td>NaPDoS</td><td>http://napdos.ucsd.edu/</td> <td>Nachweis von sekundären Metaboliten-Genclustern</td><td></td></tr><tr><td>NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline</td><td>http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/</td> <td>Annotation von ORFs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NRPSpredictor</td><td>http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/</td> <td>Detektion von NRPS-Domänen</td><td></td></tr><tr><td>Prokka (rapid prokaryotic genome annotation)</td><td>http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml</td><td>Annotation von ORFs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RAST (rapid annotation using subsystems technology)</td><td>http://rast.nmpdr.org/</td> <td>Annotation von ORFs&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Weitere Programme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chem Station Rev. A.09.03</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td>Handhabungsprogramm für HPLC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Clone Manager Suite 7</td><td>Wissenschaftliche und pädagogische Software, Cary, USA</td><td>Entwerfen von Klonierungsexperimenten&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Newbler v2.8</td><td>Roche Diagnostics</td><td>Ausrichtung der Sequenzierungs-Reads</td><td></td></tr><tr><td>Maschinen&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC/MS</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Autosampler: G1313A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Pre-Säule: XBridge C18 (20 mm x 4,6 mm; Partikelgröße: 3,5 & Mikro; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Column:Xbridge C18 (100 mm & 4,6 mm; Partikelgröße: 3,5 &mu; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-Vorbereitung Vorsäule: Zorbax B-C18 (9,4 x 150 mm; Partikelgröße: 5 & Mikro; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_semi-prep Säule: Zorbax B-C18 (9,4 x 20 mm; Partikelgröße: 5 & Mikro; m)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Degasser: G1322A&nbsp;</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quarternary Pumpe: G1311A</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Diode Array-Detektor (DAD) G1315B (&lambda; = 254 nm und 400 nm)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_Quadrupole Massendetektor (MSD) G1946D (2-3000 m/z)</td><td>Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>_heating Bad Hei-VAP Value/G3</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>_vacuum Pumpensystem SC 920 G</td><td>KNF&nbsp; Globale Strategien&nbsp; AG, Sursee, Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonstiges Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephadex LH20</td><td>GE Healthcare,&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromafil PVDF-45/15MS (Porengröße 0,45 &Mikro; m; Filter &Oslash; 15 mm)</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, D&uuml; ren, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPE-Säule Oasis HLB 20 35 cc (6g)</td><td>Waters GmbH, Eschborn, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td>Medium: LB, Zusammensetzung: LB, Menge bis 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Bacillus&nbsp; </td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td>Medium: LB, Zusammensetzung: LB, Menge bis 1 L H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Streptomyces sp.</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td>Medium: TSB, Zusammensetzung: CASO Boullion, Menge zu 1 l H2O: 30 g</td></tr><tr><td>Pilze&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td>Medium: YPD, Zusammensetzung: Hefeextrakt, Menge zu 1 L H2O: 10 g</td></tr><tr><td>Pilz&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td>Medium: YPD, Zusammensetzung: Pepton, Menge zu 1 l H2O: 20 g</td></tr><tr><td>Pilz&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td></td><td>Medium: YPD, Zusammensetzung: Glukose, Menge bis 1 l H2O: 20 g</td></tr><tr><td colspan="4">für Agarplatten 2% Agar zugeben</td></tr></tbody></table>

von einem natürlichen produkt in seine biosynthesegenclusters: eine demonstration mit polyketomycin aus streptomyces diastatochromogenes tü6028

From a Natural Product to Its Biosynthetic Gene Cluster: A Demonstration Using Polyketomycin from Streptomyces diastatochromogenes T&#252;6028

Streptomyces - Stämme sind für ihre Fähigkeit bekannt , eine Menge von verschiedenen Verbindungen mit verschiedenen biologischen Aktivitäten herzustellen. Kultivierung unter verschiedenen Bedingungen führt oft zur Herstellung neuer Verbindungen. Daher Produktionskulturen der Stämme werden mit Ethylacetat extrahiert, und die Rohextrakte durch HPLC analysiert. Weiterhin werden die Extrakte für die Bioaktivität von verschiedenen Assays getestet. Für die Strukturaufklärung der Verbindung von Interesse wird durch eine Kombination verschiedener Chromatographie-Verfahren gereinigt. Die Sequenzierung des Genoms gekoppelt mit Genomanalyse ermöglicht die Identifizierung von einem natürlichen Produkt Biosynthesegenclusters verschiedene Computerprogramme verwendete. Um zu bestätigen, dass das richtige Gen-Cluster identifiziert wurde, Gen-Inaktivierung Experimente durchgeführt werden müssen. Die resultierenden Mutanten sind für die Produktion der jeweiligen Naturprodukt analysiert. Sobald die richtige Gencluster inaktiviert wurde, dieStamm ausfallen sollte, die Verbindung herzustellen. Der Workflow wird für die antibakterielle Verbindung polyketomycin von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 produziert gezeigt. Vor rund zehn Jahren, als der Genomsequenzierung noch sehr teuer war, das Klonen und die Identifizierung eines Gens Cluster war ein sehr zeitaufwändiger Prozess. Schnelle Genomsequenzierung mit Genomanalyse kombiniert beschleunigt die Studie der Cluster Identifizierung und neue Wege eröffnet, um die Biosynthese erforschen und neue natürliche Produkte durch genetische Methoden zu erzeugen. Das Protokoll in diesem Dokument beschrieben sind, können aus einem Streptomyces - Stamm oder einem anderen Mikroorganismus abgeleitet jede andere Verbindung zugeordnet werden.

In dieser Übersicht beschreiben wir die einzelnen Schritte von der Identifizierung eines Antibiotikums zu seinem Biosynthesegenclusters führt. Vor vielen Jahren wir eine Cosmid - Bibliothek geklont, um sie in Phagen verpackt transduzierten Wirtszellen E. coli, und hatte tausende von Kolonien zu screenen , um die Klone zu identifizieren , mit überlappenden Regionen polyketomycin Cluster. Sequenzierung der Cosmide wurde auch ein schwieriger und teurer Prozess 12. Um weitere Studien zur Belastung zu führen sequenziert wir das gesamte Genom von Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Mit dem Entwurf des Genomsequenz leicht identifiziert wir das Gencluster von polyketomycin und anderen Clustern kodieren, viel versprechende Verbindungen. 7 vergleicht die "alte" Methode der Biosynthese - Cluster durch Klonierung einer Cosmid - Bibliothek und elaborative Screening identifiziert unddie "neue" Verfahren durch Sequenzierung ganzer Genome mit anschließender Genom-Mining auf einer rauhen Zeitskala. Die neuen Sequenzierungstechnologien und neue Genom-Mining-Programme beschleunigen den gesamten Prozess. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54952/54952fig7.jpg"> Abbildung 7: Vergleich der "alten" und "neuen" Verfahren zur Herstellung eines Biosynthesegenclusters zuordnen. Die "alte" Verfahren umfasst Klonierung einer Cosmid-Bibliothek mit der Auswahl von positiven Klonen und Sequenzieren des entsprechenden Cosmids (n) (oben); Die "neue" Verfahren umfasst gesamte Genomsequenzierung und -mining alle sekundären Metaboliten Genclustern auf dem Genom des Stammes (unten) gelegen zu identifizieren. Dauer der einzelnen Schritte werden auf einer groben Zeitskala gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54952/54952fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll von (A) die Identifizierung eines Naturprodukt mit antibiotische Aktivität, (B) die Reinigung der Verbindung, (C) das erste Modell seiner Biosynthese, (D) Genomsequenzierung / -mining und die ( E) die Überprüfung der Biosynthesegenclusters.

Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Streptomyces strains are known for their capability to produce a lot of different compounds with various bioactivities. Cultivation under different ...

Das übergeordnete Ziel dieses Arbeitsablaufs ist es, ein Naturprodukt mit antibiotischer Wirkung zu identifizieren, die Verbindung zu reinigen und ihren biosynthetischen Gencluster durch Genome Mining zu bestimmen. Neue Antibiotika werden aufgrund der wachsenden Zahl myto-resistenter Erreger dringend benötigt. Streptomycin-Stämme sind als Antibiotikaproduzenten bekannt, und wir sollten dieses Potenzial nutzen.Mit dem Wissen über ein heterogenes Antibiotika-Biocin-Cluster können wir einen Biosyntheseweg vorschlagen und die Verbindung weiter modifizieren. Dieses Verfahren hilft Ihnen, den entsprechenden Gencluster zu identifizieren. Das Radio wird mit einem Streptomycin-Stamm demonstriert.Es kann aber auch auf andere Mikroorganismen angewendet werden. Zu Beginn werfen Sie den Streptomycin-Stamm unter verschiedene Bedingungen, wie z. B. unterschiedliche Medien oder Inkubationszeit. Die Zellen werden 10 Minuten lang bei 3.000 G Zentrifugation geerntet und die Überstände in einen neuen Kolben überführt.Für die Extraktion von Verbindungen aus der Kulturbrühe wird der Überstand durch Zugabe von einer molaren Salzsäure auf PH4 eingestellt. Und überführen Sie es in einen Trenntrichter. Fügen Sie dann die gleiche Menge Ethalacetat hinzu und schütteln Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 180 U/min.Als nächstes wird die Ethalacetatphase aufgefangen und durch ein Filterpapier in einen Rundkolben überführt. Das Ethalacetat wird durch Rotationsverdampfung bei 40 Grad Celsius und 240 bar verdampft. Für die Extraktion von Verbindungen aus dem Myzel resuspendieren die Zellen in einem zweifachen Volumen Aceton.Schütteln Sie die Zellen in einem Röhrchen bei 180 U/min für 30 Minuten. Filtern Sie die Flüssigkeit durch Filterpapier. Anschließend wird das Aceton mit einem Rotationsverdampfer bei 40 Grad Celsius und 550 bar verdampft.Lösen Sie den getrockneten Extrakt in 20 Millilitern Wasser auf und setzen Sie die Extraktion der Verbindungen wie zuvor fort. Lösen Sie dann die getrockneten Extrakte in Methanol auf. Filtern Sie sie durch einen 0,45 Mikrometer großen Filter mit Porengröße.Und übertragen Sie die Extrakte in HPLC-Fläschchen. Injizieren Sie die Proben in die HPLC-Maschine und analysieren Sie den Rohextrakt, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die antibiotische Aktivität mit Hilfe des Scheibendiffusionsassays zu identifizieren, verteilen Sie verschiedene Vorkulturen des Teststamms auf die entsprechenden Agarplatten.Pipettieren Sie dann 20 bis 50 Mikroliter des gelösten Extrakts auf sterile Papierscheiben. Bereiten Sie außerdem eine Negativkontrolle mit Lösungsmittel und eine Positivkontrolle mit einem geeigneten Antibiotikum vor. Nachdem Sie die Papierscheiben 30 Minuten lang getrocknet haben, übertragen Sie sie auf die Platten mit den Testkulturen.Die Test-Dehnungsplatten unter geeigneten Bedingungen inkubieren. Bestimmen Sie dann die scheinbaren Hemmzonen für jeden Teststamm. Wenn eine Hemmzone vorhanden ist, reinigen Sie die verantwortliche Verbindung aus dem großtechnischen Anbau und klären Sie die Struktur auf, wie im Textprotokoll beschrieben.Während der Reinigung kann sich eine Verbindung durch Oxidation, Strahlung oder Temperatur verändern. Je mehr Reinigungstabletten verwendet werden, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit einer Degradation. Bis zu fünf Milligramm Verbindung, was das Minimum ist, das für die Analyse des gemeinsamen Genoms benötigt wird.Analysieren Sie die chemische Struktur der isolierten Verbindung und prognostizieren Sie Enzyme, die an ihrer Biosynthese beteiligt sein könnten. Hier wird Polycidomycin als Beispiel verwendet, um das Verfahren zu demonstrieren. Unterteilen Sie zunächst die Struktur in offensichtliche Einzelgruppen.Polycidomycin besteht aus einem tetracyclischen Teil, zwei Monosacchariden und Dimethylsalicylsäure. Als nächstes prognostizieren wir mutmaßliche Gene in dem Cluster, von dem die Einheiten abgeleitet sein könnten. Hier könnte die tetracyclische Einheit von einer Polyschlüssel-Synphase Typ II abgeleitet werden, während die dimethylsalicylische Einheit von einer iterativen Poly-Schlüsseltyp-Synphase Typ I abgeleitet sein kann. Ebenso könnten die beiden Zuckereinheiten, bei denen es sich um 6 Desoxyzucker handelt, während der Biosynthese aus Glukose synthetisiert werden, an der eine dNDP-Glucose-4, 6-Dehydratase beteiligt ist, und durch zwei Glykosyltransferasen gebunden werden.Sequenzieren Sie die genomische DNA mit Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation. Zur Identifizierung des Sekundärmetaboliten-Genclusters werden Programme wie antiSMASH, Natural Product Domain Seeker oder NRPS Predicter durchgeführt. Reichen Sie die Genomsequenz im Fasta-Format ein.Nach einigen Stunden werden die Ergebnisse über einen E-Mail-Link verschickt. Im Genomentwurf von Streptimyoces diastatochromogenes identifizierte antiSMASH 22 mutmaßliche Gencluster. Analysieren Sie die mutmaßlichen Gencluster auf ihre enzymatischen Signalwege.Suche nach Clustern, die Gene enthalten, die an der Synthese deiner Verbindung beteiligt sein könnten. In Astatochromogenen enthält Cluster II Poly-Keytype-Synphase-Typ-II-Gene, drei Gene für ein iteratives PKS Typ I und dTDP-Glucose-4, ein 6-Dehydratase-Gen und zwei Glykosyltransferasen, die für Gene kodieren. Um den Cluster mit anderen Clustern vergleichen zu können, stellt antiSMASH einen Link zur MIBiG-Datenbank zur Verfügung, die Annotationen und weitere Informationen über ähnliche biosynthetische Gencluster und deren Produkte enthält.Vergleichen Sie die Struktur der Verbindung mit anderen bekannten Verbindungen, um nach Ähnlichkeiten zu suchen. Die Identifizierung des verantwortlichen biosynthetischen Genclusters könnte einfach sein. In einigen wenigen Fällen kann es aber auch sehr schwierig werden.Um zu überprüfen, ob der vorgeschlagene Gencluster für die Biosynthese der Verbindung verantwortlich ist, suchen Sie nach einem Gen innerhalb des Clusters, das für ein Enzym mit einer zentralen Funktion für die Biosynthese kodiert. Um den Poly-Cidomycin-Gencluster zu bestätigen, wurde das für Ketosynthase alpha kodierende Gen pokPI one aus dem PKS Typ II selektiert und durch eine Out-of-Frame-Deletion inaktiviert. Nach dem Klonieren und Konjugieren des Single-Crossover-Konstrukts, wie im Textprotokoll beschrieben.Überprüfen Sie die einzelnen Crossover-Mutanten. Beimpfen Sie dazu 100 Milliliter Produktionsmedien mit einzelnen Klonen, die die verifizierte Genunterbrechung enthalten. Inkubieren Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor.Fahren Sie mit der Extraktion des Rohextrakts fort, wie zuvor gezeigt. Abschließend überprüfen Sie die Herstellung mittels HPLC-MS-Analyse, wie im Textprotokoll beschrieben. Der entsprechende Peak im HPLC-Chromatogramm und die Masse für die Verbindung sollten nicht nachweisbar sein.Der biosynthetische Gencluster Polycidomycin wurde durch ein Gendeletionsexperiment verifiziert. Hier ist das HPLC-Chromatogramm des Rohextrakts des Wildtyps S.Diastatochromogenes und des mutierten Stammes mit interrupte pokPI one Gen zu sehen. Der mutierte Stamm produziert kein Polycidomycin mehr.Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren innerhalb weniger Monate durchgeführt werden. Vor vielen Jahren nahm die Identifizierung eines biosynthetischen Genclusters viel Zeit in Anspruch. Heute beschleunigen Genomsequenzierung und Genome Mining diesen Prozess stark.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie von einer neuartigen Verbindung zu ihrem biosynthetischen Gencluster gelangen. Wir haben das gesamte Verfahren in einzelnen Schritten gezeigt, so dass Sie diese nun jedem anderen Naturprodukthersteller zuordnen können. Das Wissen über den Gencluster und seine synthetisierten Verbindungen gibt uns Einblick in die Biosynthesewege.Dies gibt uns weitere Möglichkeiten, bereits vorhandene Moleküle zu modifizieren, um sie zu verbessern.

from-natural-product-to-its-biosynthetic-gene-cluster-demonstration

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Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Synthese hoher Ausbeuten rekombinanter Proteine aus einem zellfreien Transkriptionstranslationssystem (TX-TL) von Streptomyces venezuelae .

Ein ertragreiches Streptomyces-Transkriptions-Translation-Toolkit für synthetische Biologie und Naturstoffanwendungen

Wir beschreiben ein einfaches Verfahren zur chromosomalen Einzelkopie-Komplementierung eines Efflux-Pumpengens unter Verwendung eines mini-Tn7-basierten Expressionssystems in einen gentechnisch veränderten Efflux-defizienten Stamm von Acinetobacter baumannii. Dieses präzise genetische Werkzeug ermöglicht eine kontrollierte Genexpression, die für die Charakterisierung von Effluxpumpen in multiresistenten Krankheitserregern von entscheidender Bedeutung ist.

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

Hier wird ein Protokoll für das Design, die Konstruktion und die Bereitstellung eines tetracyclingesteuerten induzierbaren synthetischen Schaltkreises vorgestellt. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise auf die Parasiteneliminierung und die Zytokinexpression kann durch Kanalisierung der vorgestellten Pipeline untersucht werden. Dieses Protokoll ist relevant für Forscher, die synthetische Schaltkreise bei Infektionskrankheiten untersuchen.

Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

Erfahren Sie die Identifizierung und Aufreinigung eines natürlichen Antibiotikums aus Streptomyces diastatochromogenes. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung des Biosynthesegenclusters durch Genom-Mining.

Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 (Video) | JoVE Journal

Von einem natürlichen Produkt in seine Biosynthesegenclusters: Eine Demonstration Mit Polyketomycin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

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