Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse
January 24th, 2017
Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung von Proteinen, die mit einem nuklearen Cofaktor interagieren, mittels LC-MS/MS-Analyse. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit transkriptionellen Mechanismen im Bereich der Genregulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Proteine identifizieren können, die mit einem nukleären Cofaktor interagieren.
Darüber hinaus ermöglicht uns diese Methode, die transkriptionellen Regulationsmechanismen der anvisierten nuklearen Faktoren besser zu verstehen. Ernten Sie HEK 293-Zellen, die flaggenmarkiertes ARIP4 exprimieren, 36 Stunden nach der Transvektion, indem Sie das Zellblatt mit eiskaltem PBS waschen und die Zellen mit einem Zellschaber sammeln. Füllen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie dann bei 8000 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius.
Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet im Fünffachen des Pelletvolumens von High Salt Buffer. Drehen Sie die Mischung 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach 20 Minuten Drehung zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 17.700 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie anschließend die Überstände in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie Verdünnungspuffer auf das dreifache Volumen des Überstands hinzu. Führen Sie eine weitere Petrifugation durch und übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen. Während der 10-minütigen Zentrifugation werden 50 Mikroliter Anti-Flaggen-Kügelchen mit PBS gewaschen.
Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2000 g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Waschschritte zuerst mit 1 molaren Glycinhydrochlorid und dann mit einem molaren Trishydrochlorid. Dann zweimal mit salzarmem Puffer waschen.
Mischen Sie anschließend 50 Mikroliter gewaschene Kügelchen mit Ganzzellextrakten. Drehen Sie die Mischung vorsichtig vier Stunden lang bei zwei bis vier Grad Celsius. Verwenden Sie dann eine abgestumpfte Spitze, um die Probe in eine Mikrospinsäule zu überführen, und lassen Sie die Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen tropfen.
Den Durchfluss in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Als nächstes waschen Sie die Fahnenperlen fünfmal mit salzarmem Puffer. Zum Eluieren die Säule in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und eine Minute lang bei 2000 g zentrifugieren, um die Kügelchen zu trocknen.
Verschließen Sie den Boden der Säule und fügen Sie dann 50 Mikroliter 1 molares Glycinhydrochlorid hinzu. Schütteln Sie die Mischung vorsichtig 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen setzen und eine Minute lang bei 2000 g zentrifugieren.
Neutralisieren Sie die eluierte Lösung mit 10 Mikrolitern eines molaren Trishydrochlorids und mischen Sie sie gut durch Pipettieren und Vortexen. Fügen Sie 50 Mikroliter 100 millimolare Ammoniumbicarbonat hinzu. 10 Mikroliter Acetonitril, zwei Mikroliter Dithiothreitol und 50 Mikroliter neutralisierte Probe.
30 Minuten bei 56 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation lassen Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 10 Mikroliter 333 millimolare Iodacetamid in die Probe und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 10 Mikroliter Trypsin in die Mischung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag wird das Endprodukt zur Analyse zu einer LC-MS/MS-Anlage oder zu einem Massenspektrometrielabor eines Drittanbieters transportiert. Dieses Bild zeigt die Silberfärbung von Flaggenepitopen, die mit ARIP4 markiert sind, die in HEK 293-Zellen exprimiert werden, nach Immunfällung mit einem flaggenspezifischen Antikörper und Trennung durch Elektrophorese. Als Kontrolle wurde eine Scheinreinigung an HEK 293-Zellen durchgeführt, die keine exogenen Proteine exprimierten.
Mit unserer Methode ist es möglich, mutmaßliche nukleäre Cofaktoren über ihren Transkriptionsfaktor von Interesse zu identifizieren und unser Verständnis der transkriptionellen Regulationsmechanismen weiter zu verbessern.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert eine Methode zur Reinigung von koregulierenden Interaktionsproteinen mittels LC-MS/MS-Analyse. Die Technik zielt darauf ab, Proteine zu identifizieren, die mit einem nuklearen Cofaktor interagieren, und verbessert unser Verständnis transkriptioneller Regulationsmechanismen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Genregulation
Hintergrund
- Das Verständnis transkriptioneller Mechanismen ist entscheidend für die Genregulation.
- Die Identifizierung von Proteininteraktionen kann Einblicke in zelluläre Prozesse liefern.
- LC-MS/MS ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Analyse von Proteininteraktionen.
- Diese Methode konzentriert sich auf nukleare Cofaktoren und ihre regulatorischen Rollen.
Zweck der Studie
- Proteine zu identifizieren, die mit einem nuklearen Cofaktor interagieren.
- Transkriptionelle Regulationsmechanismen zu erhellen.
- Eine zuverlässige Methode zur Proteinreinigung bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Ernte von HEK 293-Zellen, die flag-markiertes ARIP4 exprimieren.
- Waschen der Zellen mit eiskaltem PBS.
- Einsammeln der Zellen mit einem Zellenkratzer.
- Zentrifugieren der Zellen bei 8000g für zwei Minuten bei 4°C.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung von Proteinen, die mit nuklearen Cofaktoren interagieren.
- Verbessertes Verständnis transkriptioneller Mechanismen.
- Demonstration der Effektivität der LC-MS/MS-Methode.
- Potenzielle Anwendungen in der Genregulationsforschung.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet ein wertvolles Werkzeug zum Studium von Proteininteraktionen.
- Sie trägt zum breiteren Verständnis der Genregulation bei.
- Zukünftige Studien können auf dieser Technik aufbauen, um weitere Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
