Name: Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Verfahren zur Identifizierung von Proteinen, die mit nuklearen Cofaktoren interagieren, mittels LC-MS/MS-Analyse in HEK 293-Zellen. Diese Methode erleichtert die Untersuchung transkriptioneller Regulierungsmechanismen.

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Diese Studie wurde unterstützt von der Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), der Takeda Science Foundation (HT) und von einer Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.

1. Transfection <ol><li> Samen HEK293 - Zellen in 100-mm - Kulturplatten (2 x 10 6 Zellen / Schale). Kultur die Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 100 ug / ml Streptomycin und 100 Einheiten / ml Penicillin. Inkubieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 5% CO 2 und 37 ° C. </li><li> Am nächsten Tag Transfizieren der Zellen mit 10 ug FLAG-markiertes Plasmid ARIP4 40 ul Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers 11. </li></ol> 2. Protein Extraction <ol><li> Etwa 36 Stunden nach der Transfektion, waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS und die Zellen ernten mit einem Schaber. Übertragen Sie die Zellen in einer 1,5 mltube und zentrifugiert es bei 8000 × g für 2 min bei 4 ° C. Aspirat der Überstand und Zellpellet in 5x der Pelletvolumen von 0,4 M KCl-Puffer (Hochsalzpuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x Protease - Inhibitor - Cocktail). Drehen, um die Mischung für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 17.700 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand (Ganzzellextrakt) in ein neues 2-ml - Röhrchen und fügen 3x das Anfangsvolumen von 0 M KCl - Puffer (Verdünnungspuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl 2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM β-Mercaptoethanol, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail). </li><li> Führen Sie eine weitere Zentrifugation (17.700 × g für 10 min bei 4 ° C) und den Überstand (Gesamtzellextrakt) in ein neues 2-ml-Tube. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol><li> Während der Zentrifugation (2.4), wasche 50 ul anti-FLAG Perlen mit PBS, 0,1 M Glycin-Hydrochlorid, und dann wurde 1 M Tris-Hydrochlorid, gefolgt von zweimaligem Waschen mit 0,1 M KCl Puffer (Puffer mit niedrigem Salz: 20 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 10 mM b-Mercaptoethanol, Inhibitorcocktail 1x Protease). Die Zentrifugation für diesen Waschvorgang wird bei 2.000 xg für 1 min bei 4 ° C durchgeführt wird. </li><li> Mischungs 50 ul FLAG Kügelchen mit den Ganzzellextrakte und drehen vorsichtig die Mischung 4 h bei 2-4 ° C (1% des gesamten Zellextrakts aus Schritt 2.4 auch bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung aufbewahrt werden sollte, als Eingang). </li><li> Übertragung der Probe auf ein Mikrozentrifugensäule (Schwerkraft drop). Halten Sie die Durchfluss in einem 1,5-ml-Röhrchen, einfrieren mit flüssigem Stickstoff, und speichern Sie sie bei -80 ° C (überprüfen Sie die Proteinwerte sowohl der Eingangs- und Durchfluss Western-Blot-Analyse unter Verwendung). </li><li> 1 ml 0,1 M KCl-Puffer (Puffer mit niedrigem Salz) die FLAG-Perlen (Schwere Tropfen) zu waschen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.4 mindestens vier weitere Male (insgesamt fünf Waschungen). </li></ol> 4. Elution <ol><li> Die Säule in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren es bei 2000 × g für 1 min; die Perlen trocknen. </li><li> Verschließen Sie die Unterseitedie Kolumne. </li><li> Werden 50 &amp; mgr; l (gleich dem Volumen von FLAG beads) von 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5). </li><li> Schütteln Sie die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Platzieren Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren es bei 2.000 × g für 1 min. </li><li> Die eluierte Lösung wird mit 10 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert; gut mischen durch Pipettieren oder durch eine Wirbelmaschine. </li></ol> 5. Alkylierungs- und Trypsinisierung <ol><li> Zugabe von 50 ul 100 mM NH 4 HCO 3, 10 &amp; mgr; l CH 3 CN und 2 ul Dithiothreitol zum Gemisch (112 ul Gesamtvolumen). </li><li> Inkubieren der Probe für 30 min bei 56 ° C. </li><li> Die Probe wird bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l 333 mM Iodacetamid zur Probe und Inkubieren im Dunkeln für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Trypsin (33 ng / ul) zu dem Gemisch und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. </li></ol><ol><li> Nach über Nacht Trypsinierung, transportieren das Endprodukt zu einem LC-MS / MS - Anlage oder an einem Drittlabor Massenspektrometrie zur Analyse 12. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
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<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Effiziente Transfektion ist wichtig, ein erfolgreiches Ergebnis mit diesem Protokoll zu erhalten. Dementsprechend empfehlen wir Western-Blot-Analyse unter Verwendung der immunpräzipitierten FLAG-markierten Protein-Spiegel zu bestimmen. Dieser Schritt ermöglicht es Benutzern, zu überprüfen, ob ihre Protein von Interesse richtig überexprimiert und darüber hinaus, dass die IP wurde erfolgreich durchgeführt. FLAG-markierte Proteinspiegel sollte auch vor der Massenspektrometrie-Analyse überprüft werden. <p class="jove_co...

Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Funktionen. Als solche haben diese Wechselwirkungen wurden in Signaltransduktion in Verbindung gebracht; Proteintransport durch Zellmembranen; Zellstoffwechsel; und mehrere Kernprozesse, einschließlich der DNA - Replikation, DNA - Schäden zu reparieren, Rekombination und Transkription 1, 2, 3, 4. Identifizierung der Proteine ​​in dieser Wechselwirkungen beteiligt ist daher von entscheidender Bedeutung, unser Verständnis dieser zellulären Prozesse voranzutreiben. Immunopräzipitation (IP) ist eine validierte Technik verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu analysieren. Ist , um die Identifizierung von co-immunpräzipitiert Proteine, Massenspektrometrie häufig 5 verwendet zu erleichtern, 6, 7, 8,9. ein bekanntes Mitglied einer Protein-Komplex mit einem Antikörper von Targeting ist es möglich, den Proteinkomplex zu isolieren und seine unbekannten Komponenten über Massenspektrometrie-Analyse, um anschließend zu identifizieren. ARIP4 (Androgen - Rezeptor-interacting protein 4), eine Transkriptions coregulator, in Wechselwirkung mit der Kernrezeptorproteine, um seine Zielpromotoren in einer kontextabhängig 9, 10 zu aktivieren oder zu unterdrücken . ARIP4 interagierende Proteine ​​mit Hilfe der LC-MS / MS-System, um besser auf die Transkriptionsregulationsmechanismen verstehen diese Kernfaktoren regeln, beschreiben wir ein umfassendes Verfahren zur Reinigung und zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail (EDTA-frei) (100x)</td><td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Säulen</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protein herstellungsverfahren für die hochdurchsatz-identifizierung von proteinen interagieren mit nuklearen cofaktor lc-ms / ms-analyse

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transkriptionelle Coregulatoren sind für die effiziente Transkriptionsregulation der nuklearen Chromatinstruktur von entscheidender Bedeutung. Coregulatoren spielen eine Vielzahl von Rollen bei der Regulierung der Transkription. Dazu gehören die direkte Wechselwirkung mit Transkriptionsfaktoren, die kovalente Modifikation von Histonen und anderen Proteinen sowie die gelegentliche Veränderung der Chromatinkonformation. Dementsprechend ist die Etablierung relativ schneller Methoden zur Identifizierung von Proteinen, die innerhalb dieses Netzwerks interagieren, entscheidend, um unser Verständnis der zugrunde liegenden Regulationsmechanismen zu verbessern. Die LC-MS/MS-vermittelte Identifizierung von Proteinbindungspartnern ist eine validierte Technik zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen. Durch die Immunpräzipitation eines zuvor identifizierten Mitglieds eines Proteinkomplexes mit einem Antikörper (gelegentlich mit einem Antikörper für ein markiertes Protein) ist es möglich, seine unbekannten Proteinwechselwirkungen mittels Massenspektrometrie zu identifizieren. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode der Proteinpräparation für die LC-MS/MS-vermittelte Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteininteraktionen vor, an denen nukleäre Cofaktoren und ihre Bindungspartner beteiligt sind. Diese Methode ermöglicht ein besseres Verständnis der transkriptionellen Regulationsmechanismen der anvisierten nuklearen Faktoren.

Wir identifizierten ein starkes ARIP4 Signal, etwa 160 KDa, sowie diejenigen eines Mock Probe Kontrolle und mehrere andere unbekannte Proteine (Abbildung 1). LC-MS / MS - Analyse sowohl die ARIP4 komplexe Peptide und die potentiellen Peptid - Cofaktoren in der Fraktion von FLAG - Kügelchen (Tabelle 1) identifiziert. p62 (Sequestosome1), einem bekannten ARIP4 Cofaktor 11 wurde in der Analyse (Tabelle 1) identifizie...

Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine ​​etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.

Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteine zu identifizieren, die mit einem nukleären Koregulator über eine LC-MS/MS-Analyse interagieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der transkriptionellen Mechanismen der Genregulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir die mit einem nukleären Koregulator interagierenden Proteine identifizieren können.Außerdem ermöglicht diese Methode ein besseres Verständnis der transkriptionellen regulatorischen Mechanismen der gezielten nukleären Faktoren. Gewinnen Sie HEK-293-Zellen, die 36 Stunden nach Transvektion Flag-markiertes ARIP4 exprimieren, indem Sie den Zellrasen mit eiskalter PBS-Lösung waschen und die Zellen mit einem Zellabstreifer sammeln. Überführen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie anschließend zwei Minuten bei 8000 × g und vier Grad Celsius.Den Überstand abpipettieren und das Zellpellet in dem Fünffachen des Pelletvolumens an Puffer mit hohem Salzgehalt resuspendieren. Die Mischung 20 Minuten bei vier Grad Celsius rotieren lassen. Nach 20 Minuten Rotation das Gefäß bei 17.700 g zehn Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren

a-protein-preparation-method-for-high-throughput-identification

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

Wir präsentieren eine Variation der QUICK (quantitativen Immunpräzipitation mit Knockdown kombiniert) Ansatz, der zuvor wurde eingeführt, um zwischen wahr und falsch Protein-Protein-Wechselwirkungen zu unterscheiden. Unser Ansatz basiert...

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

SILAC Immunpräzipitationsexperimenten stellt ein wirksames Mittel zur Entdeckung neuer Protein-Protein-Interaktionen. Dadurch, dass die genaue relative Quantifizierung von Protein Hülle und Fülle in den Kontroll-und Testproben, true Wechselwirkungen können leicht von experimentellen Verunreinigungen unterschieden werden, und niedriger Affinität Wechselwirkungen durch die Verwendung von weniger strengen Pufferbedingungen erhalten.

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Ein neuronales Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Protokoll wird hier beschrieben, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen zu charakterisieren. Lysosomale Membranproteine und Proteine, die mit Lysosomen interagieren (stabil oder vorübergehend), können in dieser Methode mit hervorragender intrazellulärer räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen genau quantifiziert werden.

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Erfassung und Identifizierung krankheitsspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen aus nativen Zellen und Geweben mit Hilfe chemischer Sonden und Massenspektrometrie ermöglicht. Die resultierenden Interaktionsdatensätze werden über eine spezielle webbasierte Plattform analysiert, um dynamische Netzwerkdysfunktionen und Veränderungen des Signalwegs im Zusammenhang mit Krankheiten aufzudecken.

Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur Identifizierung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen.

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Verfahren zur Identifizierung von Proteinen, die mit nuklearen Cofaktoren interagieren, mittels LC-MS/MS-Analyse in HEK 293-Zellen. Diese Methode erleichtert die Untersuchung transkriptioneller Regulierungsmechanismen.

Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse (Video) | JoVE Journal

Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse

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