Name: Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Erfahren Sie die schnelle Isolierung von BMPR-IB+ Fettgewebe-Stromazellen für die Schädeldachheilung. Diese Methode nutzt frisches menschliches Gewebe und ein in vivo-Assay zur Evaluation des osteogenen Potenzials.

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C.D.M. wurde durch das Resident Research Scholarship des American College of Surgeons (ACS) unterstützt. M.S.H. wurde durch das California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow Training Grant TG2-01159 unterstützt. M.S.H., H.P.L. und M.T.L. wurden durch den Research Grant Award der American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) unterstützt. H.P.L. wurde durch das NIH-Stipendium R01 GM087609 und ein Geschenk von Ingrid Lai und Bill Shu zu Ehren von Anthony Shu unterstützt. H.P.L. und M.T.L. wurden vom Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine und der Oak Foundation unterstützt. M.T.L. wurde durch die NIH-Zuschüsse U01 HL099776, R01 DE021683-01 und RC2 DE020771 unterstützt. D.C.W. wurde durch das NIH-Stipendium 1K08DE024269, das Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine und den Faculty Scholar Award des Stanford University Child Health Research Institute unterstützt.

HINWEIS: Die Proben wurden von Patienten erhalten, die informierte Zustimmung gegeben hat. Alle Protokolle wurden von der entsprechenden Stanford University Institutional Review Board überprüft und genehmigt. Während menschliche Gewebe und Zellen Handhabung, immer an Biosafety Level 2 (BSL2) Vorsichtsmaßnahmen, wie von Ihrer Einrichtung angegeben. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Vorbereitung FACS-Puffer: Füge 10 ml FBS, 5 ml Poloxamer 188 und 5 ml Pen-Strep und 500 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Bereiten Sie Mischung zu verdauen: In 0.375 g C. hemolyticum Kollagenase Typ II - Pulver und 5 ml Poloxamer 188 auf 500 mL sterile 199 / EBSS Medium. </li><li> Bereiten Standardmedium: In 50 ml FBS und 5 ml Pen-Strep bis 500 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium. </li></ol> 2. Ernte und Isolierung von ASCS HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine angemessene institutionelle Genehmigungen vorhanden sind, für die Verwendung von menschlichem Gewebe und zur Isolierung von human Stammzellen. Erhalten menschlichen Bauch, flankieren oder Oberschenkel subkutanes Fett von einem gesunden Spender elektiven Fettabsaugung. Halten Sie das Fett in einem Kunststoff-Saug-Kanister. <ol><li> In steriler PBS in einem Verhältnis 1: 1, um das Fett in der ursprünglichen Plastikkanister. (Wenn es 500 ml Fett, 500 ml PBS). Mix durch vorsichtiges Schütteln für 30 s. Lassen Sie die wässrige Schicht auf den Boden (Abbildung 1) und dann absaugen und verwerfen die wässrige Phase mit einer 10 - ml Plastikpipette abgesaugt angebracht zu begleichen. </li><li> Dekantieren, das Fett in einen großen Plastikbehälter und fügen Sie Mischung in einem 1 verdauen: 1-Verhältnis. Schließen Sie den Behälter und reinigen Sie die Außenseite mit 70% Ethanol. Verschließen Sie die Kappe mit Paraffinfilm. </li><li> Agitieren diesen Behälter in einem Orbitalschüttler bei 180 Upm bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Neutralisieren Sie die Verdauung durch Zugabe von Standardmedium in einem Verhältnis 1: 1. (Wenn es 1000 ml Fett Mischung, fügen Sie 1000 ml Standardmedium). </li><li> Verteilen der Mischung gleichmäßig in einer geraden Anzahl von 250 ml Kunststoff konische Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge die Mischung bei 300 g für 20 min bei 4 ° C </li><li> Saugen Sie den Überstand und vorsichtig sein, um das Pellet intakt zu lassen. Resuspendieren Pellets in 5 ml Standardmedium für jeden konischen Röhrchen. </li><li> Filtern der Suspension durch ein 100-Mikrometer-Filter in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen. Dann Zentrifuge bei 300 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren und das Pellet in 5 ml Raumtemperatur Puffer RBC-Lyse. Lassen Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur stehen dann für 15 min bei Raumtemperatur (RT) bei 300 xg zentrifugiert. </li><li> Den Überstand aspirieren und das Pellet in 15 ml Standardmedium. Filter wieder durch ein 100-Mikrometer-Filter in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen. </li><li> In einer neuen 50 ml konischen, 15 ml Polysucrose Lösung für die Dichte-basierte Trennung entworfen (siehe Liste der Reagenzien). Dann wird das Rohr in einem Winkel von 45 ° hält, pipettieren sorgfältig die Zellen auf der Seite derdas Rohr , so daß die Zellsuspension sanft Schichten auf der Oberseite der Polysaccharose - Lösung (Abbildung 2). HINWEIS: Es ist wichtig zu Pipette Zellen auf der Oberfläche der Lösung. Nicht Polysucrose Lösung zu einer Suspension von Zellen hinzuzufügen, da dies eine irreversible Mischung erstellen. Ebenso pipettieren nicht die Zellen in der Mitte der Polysaccharose Lösung. </li><li> Zentrifugieren diese Mischung bei 300 xg für 10 min bei RT. Verwenden Sie niedrige Beschleunigung (2 - 3 von 10) und stellen Sie die Bremsfunktion der Zentrifuge auf Null für diesen Schritt. HINWEIS: Drei Schichten werden sichtbar: klar auf dem Boden, bedeckt in der Mitte, und lachsfarbene auf der Oberseite. Die mittlere Schicht enthält die Zellen von Interesse. </li><li> Mit entfernen, um eine 10-ml-Pipette vorsichtig die mittlere Schicht und Transfer in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. HINWEIS: Es ist besser, vollständig die Mittelschicht zu übertragen und dabei einige der oberen und unteren Schichten nehmen, als hinter einigen der mittleren Schicht zu verlassen. </li> &lt;li&gt; Zählen Sie die Zellen, die eine Zählkammer und Gesamtlebendzellzahl zu bestimmen. HINWEIS: Wir verwenden typischerweise Trypanblau zu dem Zellgemisch in einer Endkonzentration von 0,8% in Zählen Zellen zu unterstützen. Tragfähige lebenden Zellen wird der blaue Farbstoff nicht aufnehmen und weiß erscheint. </li></ol> 3. FACS-Sortierung für BMPR-IB Positive-Zellen und Herstellung von zellhaltigen Scaffolds <ol><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren der Zellen in FACS-Puffer bei einer Konzentration von 1 Million Zellen pro 100 &amp; mgr; l (bezogen auf die Zellzahl in Schritt getan 2.13). </li><li> Übertragung von mindestens 10 Millionen Zellen auf ein Kunststoffzentrifugenröhrchen mit &quot;BMPR-IB&quot;. Getrennt davon übertragen eine Million Zellen in 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer zu einem separaten Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff mit &quot;Unstained.&quot; 1 ml FACS-Puffer zum &quot;Unstained&quot; Rohr. Halten Sie den Rest der Zellen in FACS-Puffer auf Eis, während die FACS Teil der exper SortierBeispiel wird getan. Beschriften Sie diese Zellen &quot;unsortiert&quot;. Verwenden Sie diese als Kontrollen später im Experiment. </li><li> Füge eine geeignete Menge eines fluoreszierenden anti-human BMPR-IB-Antikörpers auf die &quot;BMPR-IB&quot; Röhre gemäß der Anweisungen des Herstellers. Pipette, um die Mischung nach oben und unten sanft um den Antikörper zu verteilen. HINWEIS: Wir verwenden ein Mensch BMPR-IB / ALK-6 APC-konjugierte Antikörper bei einer Verdünnung von 1:10 (siehe Liste der Reagenzien für weitere Details). Allerdings wird Antikörper von verschiedenen Herstellern haben unterschiedliche Konzentrationen verwendet. </li><li> Decken Sie den Eisbehälter in einer Weise, die Licht abhält. Erlauben der Zelle / Antikörpergemisch 30 min (oder entsprechend den Anweisungen des Herstellers Antikörper) zu sitzen. HINWEIS: Wenn die Anti BMPR-IB-Antikörper als primäre unkonjugierten Antikörper kommt, der einen zweiten Antikörper erfordert, führen eine separate Färbeschritt auf Eis mit dem sekundären Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Zentrifugieren Sie beide Schläuche an300 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand aspirieren, darauf achten, daß das Pellet abzusaugen. Resuspendieren der pelletierten Zellen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge wieder die Röhrchen bei 300 g für 5 min. aspirieren sorgfältig den Überstand und Resuspendieren der Zellen in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 1 Million Zellen pro 1 ml. </li><li> Filtern Sie die &quot;BMPR-IB&quot;, &quot;Unstained&quot; und &quot;unsortiert&quot; Zellen durch 40 Mikron Zelle strainers in neue markierte Glas FACS-Röhrchen. Spülen der Filter mit 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer, um sicherzustellen, dass Zellen nicht in den Filter zurückgelassen. Fügen Sie auch 2 ml Standardmedium zu zwei getrennten Kunststoff-Zentrifugenröhrchen mit &quot;BMPR-IB-positiv&quot; und &quot;BMPR-IB-negativ.&quot; Verwenden Sie diese zwei die sortierten Zellen in der FACS-Maschine zu sammeln. </li><li> Auf der FACS-Maschine, die ungefärbte Zellen verwenden, um eine negative Gate für den Fluoreszenzmarker zu definieren. </li><li> Mit einer 100 Mikron Düse, sortieren BMPR-IB positiven und negativen Zellen in die jeweiligen Rohre conTaining Standardmedium. Bewahren Sie diese Röhrchen bei 4 ° C während der Art gekühlt, wenn die FACS-Maschine hat diese Fähigkeit. HINWEIS: Bitte beachten Sie die JOVE Artikel 13 von Sharon et al. für ein ausgezeichnetes Protokoll für FACS-Sortierung. </li><li> Verwendung eines Hämocytometer, zähle die Zellen in jedem Röhrchen. Zentrifugieren Sie die &quot;BMPR-IB-positiv&quot;, &quot;BMPR-IB-negativ&quot; und &quot;unsortiert&quot; Röhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und den Überstand aspirieren, wobei darauf geachtet, nicht das Zellpellet zu stören. Dann Resuspendieren der Zellen in Standardmedium auf eine Konzentration von 1 Million Zellen pro 250 &amp; mgr; l. </li><li> Erhalten, vorgeschnitten 4 mm PLGA (Poly [milch-co-glykolsäure]) Gerüste mit Hydroxylapatit beschichtet. Legen Sie jedes Gerüst in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte. Cover jede Gerüst mit 50 &amp; mgr; l der Zellsuspension aus einer der drei Gruppen (i .e, 200.000 Zellen.): Unsortiert, BMPR-IB-positiv, und BMPR-IB-negativ (Abbildung 3). HINWEIS: Bittebeziehen sich auf die JOVE Artikel 14 von Lo et al. Einzelheiten über den Bau von PLGA Scaffolds. </li><li> füllen teilweise die umliegenden leeren Brunnen mit Standardmedium, decken Sie die Platte mit dem Deckel (Austrocknung der Gerüste zu verhindern), und in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C für 30 min inkubiert. </li></ol> 4. Schaffung von Schädeldach Mängel und Anwendung von ACS-haltigen Scaffold HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine angemessene institutionelle Genehmigungen liegen vor für die Schaffung von Kalvariamodell Defekte in lebenden Mäusen. Dieses Protokoll wurde von der Stanford University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. <ol><li> Anesthetize eine CD-1-Nacktmaus entweder inhalativen Isofluran Gas oder eines injizierten lang wirkendes Anästhetikum Cocktail verwendet wird. <ol><li> So verwenden Sie Gas allein, legen Sie die Maus in eine Anästhesie Kammer und starten die Zufuhr von Sauerstoff bei 2 - 3 l / min bei einer Konzentration von 2% Isofluran. Sobald die Maus fully bewusstlos, legen Sie sie anfällig auf eine Warmwasserumlauf Decke mit einem saugfähigen Kissen und legen seine Schnauze in eine Narkose Bugnase mit der gleichen Konzentration von Sauerstoff und Isofluran. sorgfältig überwachen, die Atemfrequenz und die Konzentration von Isofluran nach Bedarf anpassen. </li><li> eines injizierten lang wirkendes Anästhetikum Cocktail, betäuben die Maus in einer Anästhesiekammer zu verwenden, wie oben beschrieben, und dann das Anästhetikum Cocktail injizieren. Entfernen Sie die Maus aus der Narkose Kammer und beobachten ihr Verhalten. HINWEIS: Die Maus kurz von der Anästhesie entstehen kann, aber innerhalb von mehreren Minuten vollständig sollte wieder unter der Wirkung des injizierten Anästhetikums anästhesiert werden. Übertragen Sie die Maus in eine warme Wasserkreislaufdecke mit einem saugfähigen Kissen bedeckt. HINWEIS: Für eine Anästhetikum Cocktail empfehlen wir eine Mischung, die Ketamin 10 mg / ml und Xylazin 1 mg / ml in normaler Kochsalzlösung, intraperitoneal geliefert. Die Standarddosis dieser Mischung ist300 &amp; mgr; l für eine 30 g-Maus, die 100 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg Ketamin entspricht. Siehe die Diskussion Abschnitt für weitere Details in Bezug auf die injizierbare Betäubungsmittel. </li><li> Verwenden Sie einen Zeh Prise Manöver, um die Tiefe der Anästhesie bestimmen. Eine ausreichend narkotisiert Maus wird seine Pfote nicht zurückziehen, wenn sie leicht durch den Chirurgen eingeklemmt wird. </li><li> Gelten Augensalbe Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. </li><li> Verwalten 1 mg / kg Buprenorphin SR subkutan. HINWEIS: Analgesie vor der Operation, führt zu besseren Schmerzlinderung. </li><li> Während des gesamten Verfahrens, zur Überwachung der Atemfrequenz der Maus. HINWEIS: - 100 Atemzüge / min Eine Maus richtig unter Isofluran betäubt sollte eine Atemfrequenz von 50 haben. Eine erhöhte Atemfrequenz zeigt an, dass der Anästhesie zu hell ist, während eine verminderte Atemfrequenz kann darauf hindeuten, dass der Anästhesie zu tief ist. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Haut des dorsalen des Schädels mit Povidon-IODine Lösung von 70% Ethanol dreimal gefolgt. Drape mit sterilen Tüchern, ausgesetzt, um die Operationsstelle zu verlassen. HINWEIS: Tragen Sie sterile OP-Handschuhe und halten sterile Technik während des Verfahrens. Berühren Sie nur sterile Flächen und Gegenstände wie die sterile Abdeckung und die autoklaviert Instrumente. Haben ein Assistent Beleuchtung, offene Naht Pakete anpassen, usw. </li><li> Mit einem 15-Blatt-Skalpell, machen Sie eine sagittale Mittelschnitt, die die Mehrheit der dorsalen Schädel erstreckt. Mit einem feinen Zahnzange ziehen sich die Haut auf der rechten Seite des Einschnitts den rechten Scheitelbein zu belichten. </li><li> Mit einem Bohrer mit einem autoklaviert 4 mm diamantbeschichtete Trepanfräse Bit, bohren, um einen Defekt durch den Scheitelbein. Sie nicht, den Defekt Vergangenheit Knochen in die Dura mater Schicht erstrecken. (Figur 4) </li><li> Legen Sie ein Gerüst in den Defekt, und schließen Sie dann die Hautschnitt mit fließendem Nylonfaden. </li><li> Überwachen Sie die Maus und bieten Standard postoperativen Versorgung einL aut institutionellen Richtlinien. <ol><li> Halten Sie die Maus auf einem sauberen Papiertuch in einem sauberen Käfig, während er sich erholt. Die eine Hälfte des Käfigs sollte über einen Warmwasserumlauf Decke angebracht werden und die Maus sollte ursprünglich in dieser Halbzeit platziert werden. </li><li> Seien Sie nicht eine Maus unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt zu ambulate hat. Verwenden Sie keine Maus zurück, die Operation zu einem Käfig mit anderen Mäusen unterzogen wurde, bis es vollständig zurückgewonnen wird. </li></ol></li><li> Wiederholen der obigen Schritte mit einem neuen Maus für jedes Gerüst, das getestet werden soll. Sterilisieren von chirurgischen Instrumenten in zwischen Operationen eine heiße Perle Sterilisator oder andere geeignete Verfahren. </li><li> Kurz nach dem Verfahren, und anschließend bei 2, 4, 6 und 8 Wochen, verwenden micro CT Scanning die Rate der Calvaria Defektverschluss zu analysieren. HINWEIS: Siehe den Artikel von Levi et al. 6 für eine Beschreibung der Mikro - CT - Scan von Kalvariamodell Defekte. </li><li> Wenn das Experiment ist complete, euthanize die Mäuse durch sie in eine saubere Euthanasie Kammer platziert und bei einer Rate von 2 L / min ein Strom von Kohlendioxidgas in die Kammer beginnt. Nach Respiration vollständig aufgehört haben (nach ca. 10 min) durchführen Euthanasie Zervikaldislokation zu bestätigen. </li><li> Gegebenenfalls kann nach der Versuch abgeschlossen ist, verwenden Sektionierung und histologische Färbung innerhalb des Defekts Knochenbildung zu bewerten. HINWEIS: Siehe den Artikel von McArdle et al. 12 Einzelheiten der Knochen Vorbereitung Proben für die Histologie. Für einen Überblick über Techniken histologischen und Färbung finden Sie eine histologische Handbuch wie dem Handbuch für Klinische Pathologie 15. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Angaben zu machen.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls Während der Ernte der ASCs, ist der kritische Schritt ausreichende Verdauung von Fett mit Kollagenase. Eine unzureichende Verdauung wird in einer geringen Ausbeute an ASCS führen. Während der FACS-Sortierung von BMPR-IB + Zellen ist es wichtig, das Tor für Positivität sorgfältig zu definieren. Tore zu lose Definition in sortierten Populationen resultieren, die nicht rein sind. Bei der Erstellung des Kalvariamodell Defekt, ist es entscheidend, den Mang...

Wichtige Knochendefekten aus der Verletzung, Infektion oder invasiven Krebs haben einen erheblichen Einfluss auf eines Patienten Erholung und Lebensqualität. Es gibt Techniken , um diese Defekte mit gesunden Knochen von einer anderen Stelle des Patienten eigenen Körper, aber diese Übertragung trägt seine eigene Morbidität und das Risiko von Komplikationen 1, 2, 3 zu füllen. Darüber hinaus sind einige Mängel so groß oder komplex, dass genügend Spenderknochen vorliegt, um den Defekt zu füllen. Prosthetic Geräte sind eine mögliche Option für Knochendefekte Füllung , aber diese sind mit mehreren Nachteilen , einschließlich Infektionsrisiko, Hardware - Fehler zugeordnet ist , und Fremdkörperreaktion 4. Aus diesen Gründen besteht ein großes Interesse an der Möglichkeit von Engineering biologischen Knochenersatzmaterialien von patienteneigenen Zellen 5 verwendet wird . Adipöse abgeleiteten Stromazellen (ASC)haben das Potenzial für diese Anwendung , da sie reichlich vorhanden in den patienteneigenen Fettgewebe sind , und sie haben die Fähigkeit zu heilen Knochendefekte nachgewiesen durch die Generierung neuer Knochengewebe 6, 7. ASCs sind eine heterogene Population von Zellen , und mehrere Studien haben gezeigt , dass für bestimmte Zelloberflächenmarker 8 Auswählen Zellpopulationen mit einer verbesserten osteogenen Aktivität produzieren kann, 9. ASCS mit dem höchsten osteogene Potenzial Auswahl würde die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass ein Gerüst mit diesen Zellen ausgesät könnte einen großen Knochendefekt zu regenerieren. Bone morphogenetic protein (BMP) Signalisierungs ist kritisch für die Regulierung Knochendifferenzierung und die Bildung 10 und den BMP - Rezeptor Typ IB (BMPR-IB) ist bekannt für die Osteogenese in ASCs 11 wichtig. Vor kurzem haben wir, dass die Expression von BMPR-IB gezeigt, kann be 12 verwendet für ASCS mit verbesserten osteogenen Aktivität auszuwählen. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Isolierung von ASCs aus menschlichem Fett durch einen Test ihrer osteogene Aktivität gefolgt BMPR-IB-exprimierenden unter Verwendung eines in vivo Calvaria Defektmodell.

<table><tbody><tr><td>100 Mikron Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 Klingen Skalpell</td><td>Miltex</td><td>4-515</td><td></td></tr><tr><td>24 Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>40 Mikron Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Ethilon Nylonnaht, 18", P-3 Nadel, &nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1698G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BMPR-IB Primärantikörper</td><td>R& D systems</td><td>FAB5051A</td><td></td></tr><tr><td>BioGel PI OP-Handschuhe</td><td>M&ouml; lnlycke Health Care</td><td>ALA42675Z</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejo Nadeltreiber</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>CD1 nackte Maus</td><td>Charles River</td><td>086</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II Pulver</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer: Kreismesser 4,0 mm</td><td>Xemax Surgical</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer: Z500 Brushless</td><td>Micromotor NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gicbo</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Saugfähige Unterlagen, 20" x 24"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Steriles Watte-Mullpad, 4" x 4"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 199/EBSS medium</td><td>GE&nbsp; Biowissenschaften</td><td>SH30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isofluran</td><td>Henry Schein &nbsp;</td><td></td><td></td>050033</tr><tr><td>Mikropinzette mit Zähnen</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Mikropinzette mit Zähnen</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinfilm (Parafilm)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PLGA-Gerüste</td><td>Proprietäre Formulierung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188, 10%</td><td>Sigma</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Polyliniertes steriles Feld, 18" x 24"</td><td>Busse Krankenhaus Einwegartikel</td><td>696</td><td>Schneiden Sie ein rechteckiges Loch der entsprechenden Größe</td></tr><tr><td>Polysaccharose Lösung: Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Povidon Jod Vorbereitungslösung</td><td>Medline</td><td>MDS093944H</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vaseline Augensalbe, 1/8 oz. Tube</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysepuffer</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Alkoholvorbereitungstapfer</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle isolierung von bmpr-ib + fettgewebe gewonnene stromazellen für die verwendung in einem schädeldachdefektheilung modell

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive Krebserkrankungen, schwere Verletzungen und Infektionen können Knochendefekte verursachen, die zu groß sind, um mit bereits vorhandenem Knochen aus dem eigenen Körper des Patienten rekonstruiert zu werden. Die Fähigkeit, Knochen de novo mit den eigenen Zellen eines Patienten zu züchten, würde es ermöglichen, knöcherne Defekte mit ausreichend Gewebe zu füllen, ohne die Morbidität der Entnahme von nativem Knochen. Es besteht Interesse an der Verwendung von aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen (ASCs) als Quelle für das Tissue Engineering, da diese aus einer reichlich vorhandenen Quelle gewonnen werden: dem eigenen Fettgewebe des Patienten. ASCs sind jedoch eine heterogene Population, und einige Subpopulationen können in dieser Anwendung effektiver sein als andere. Die Isolierung der osteogensten Population von ASCs könnte die Effizienz und Effektivität eines Knochenzüchtungsprozesses verbessern. In diesem Protokoll werden ASCs aus subkutanem Fettgewebe eines menschlichen Spenders gewonnen. Die Subpopulation der ASCs, die den Marker BMPR-IB exprimieren, wird mit Hilfe von FACS isoliert. Diese Zellen werden dann auf einen in vivo Assay zur Heilung von Schädeldefekten angewendet und es wurde festgestellt, dass sie im Vergleich zu unsortierten Zellen ein verbessertes osteogenes Regenerationspotenzial aufweisen.

Micro-CT am Tag der Operation durchgeführt wird den Schädeldefekt deutlich zeigen. Zu diesem Zeitpunkt gibt es keine Einwachsen in die 4 mm Defekt sein. Nachfolgende Abtastungen werden über die Zeit erhalten, die Größe des Fehlers im Laufe der Zeit zu quantifizieren verglichen mit der Basislinie. Defekte beimpft mit BMPR-IB + Zellen sollten schnellere Schließung des Defektes zeigen , wenn sie mit BMPR-IB- und unsortiert Zellen (Abbildung 5) verglichen. Zusätzlich kann de...

Aus Fett gewonnene Stromazellen können nützlich sein, um neues Gewebe aus den eigenen Zellen eines Patienten zu züchten. Wir präsentieren ein Protokoll für die Isolierung einer Subpopulation von humanen Fettgewebe-abgeleiteten Stromazellen (ASCs) mit erhöhtem osteogenem Potenzial, gefolgt von der Anwendung der Zellen in einem in vivo Kalvarienberg-Heilungsassay.

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, spezifische Zellpopulationen von aus Fettgewebe stammenden stromalen Zellen zu isolieren und ihre osteogene Aktivität mittels eines In-vivo-Assays zu testen. Die Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der kraniofazialen regenerativen Biologie zu beantworten, beispielsweise wie aus Fettgewebe stammende Stammzellen genutzt werden können, um voll funktionsfähiges Knochengewebe in beschädigten Knochendefekten zu bilden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Zellen schnell aus frischem menschlichem Gewebe isoliert werden können, wodurch vermieden wird, dass sie Zeit in Zellkultur verbringen – bekanntermaßen verändert dies die Expression von Genen und Zelloberflächenmarkern.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf Patienten mit großen Knochendefekten, wie sie durch Krebs, Trauma oder Infektion verursacht werden. In Zukunft könnte es möglich sein, Zellpopulationen von ASCs zu isolieren und sie regenerativ anzuwenden. Eine visuelle Darstellung dieser Technik ist entscheidend, da die Erstellung des kranialen Defekts schwer zu erlernen ist, hauptsächlich weil der Defekt an einem gewölbten

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Menschliche perivaskulären Stammzellen (PSCs) sind eine neue Klasse für Stammzell-Skelett-Geweberegeneration ähnlich wie mesenchymale Stammzellen (MSCs). PSCs durch FACS (fluorescence activated cell sorting) kann aus dem Fettgewebe während der üblichen Fettabsaugung Verfahren beschafft isoliert werden, dann mit einem osteoinduktiven Gerüst kombiniert, um die Knochenbildung zu...

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Fettgewebe gewonnen Stromazellen aus lipoaspirate und die Schaffung einer 4 mm kritische Größe Calvaria Defekt Skelett Regeneration zu bewerten.

Reparatur eines Critical-sized Calvaria Defect Modells mit aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen aus Lipoaspirate Geerntet

Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden.  Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) mit autologem Serum, reduziert das Risiko der Abstoßung durch xenogene Material und andere negative Auswirkungen. Es ermöglicht auch die Rückgewinnung von einer Untergruppe von mesodermalen Vorläufern, die frische hMSCs liefern kann. hMSCs in einem Eigen Fibringerinnsels Einbetten ermöglicht eine einfache Handhabung und effektive chirurgische Implantation.

Mesenchymale Stromazellen Zellkultur und Lieferung in Autologe Bedingungen: Ein intelligenter Ansatz für orthopädische Anwendungen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Blutgefäß Bildung in Vivo zu visualisieren und in Echtzeit in 3D Gerüste multiphoton Mikroskopie. Angiogenese in gentechnisch veränderten Gerüste wurde in einem murinen calvarial kritische Knochen-defekt-Modell untersucht. Mehr neue Blutgefäße waren in der Behandlungsgruppe als Kontrollen erkannt.

Visualisierung von Angiogenese durch Multiphoton Mikroskopie In Vivo in gentechnisch veränderten 3D-PLGA/nHAp Gerüst für Calvarial kritische Knochen defekt Reparatur

Wir schlagen eine Zelle Erweiterung Protokoll über makroporöse Microcarriers und deren Verwendung als Delivery-System in einem Bioreaktor Perfusion eine decellularized Gewebe-Matrix zu säen. Wir gehören auch verschiedene Techniken um Zellproliferation und Lebensfähigkeit der Zellen kultiviert auf Microcarriers zu bestimmen. Darüber hinaus zeigen wir die Funktionalität der Zellen nach Bioreaktor Kulturen.

Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor

Die Anzahl der neue Biomaterialien für die Reparatur von großen Knochenläsionen entwickelt wird laufend erweitert, mit dem Ziel zu verbessern, Knochenheilung und Komplikationen im Zusammenhang mit Knochentransplantation überwinden. Hier präsentieren wir Ihnen eine multidisziplinäre Strategie zu Testzwecken vorklinischen Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochen-Reparatur.

Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

Dieser Artikel stellt eine Methode vor, die die vollständige Knochenmarkhaftung und die Durchflusszytometrie-Sortierung für die Isolierung, Kultivierung, Sortierung und Identifizierung von mesenchymalen Knochenmarkstammzellen aus Rattenunterkiefern kombiniert.

Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Die Isolierung von BAMBI-hohenMFGE8-hohen MSCs, einer der drei Hauptuntergruppen der heterogenen humanen UC-MSCs, ist hilfreich, um die Eigenschaften und Funktionen dieses Subtyps für seine zukünftige Anwendung zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit bei bestimmten Erkrankungen vollständig zu verstehen. Hier stellen wir eine Methode zur Sortierung von BAMBIhochMFGE8hoch UC-MSCs vor.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stromazellen mitBAMBI-Gehalt anhohemMFGE8-Nabelschnurgehalt

Erfahren Sie die schnelle Isolierung von BMPR-IB+ Fettgewebe-Stromazellen für die Schädeldachheilung. Diese Methode nutzt frisches menschliches Gewebe und ein in vivo-Assay zur Evaluation des osteogenen Potenzials.

Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

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