Schnelle Isolierung von BMPR-IB + Fettgewebe gewonnene Stromazellen für die Verwendung in einem Schädeldachdefektheilung Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, spezifische Zellpopulationen von aus Fettgewebe stammenden stromalen Zellen zu isolieren und ihre osteogene Aktivität mittels eines In-vivo-Assays zu testen. Die Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der kraniofazialen regenerativen Biologie zu beantworten, beispielsweise wie aus Fettgewebe stammende Stammzellen genutzt werden können, um voll funktionsfähiges Knochengewebe in beschädigten Knochendefekten zu bilden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Zellen schnell aus frischem menschlichem Gewebe isoliert werden können, wodurch vermieden wird, dass sie Zeit in Zellkultur verbringen – bekanntermaßen verändert dies die Expression von Genen und Zelloberflächenmarkern.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf Patienten mit großen Knochendefekten, wie sie durch Krebs, Trauma oder Infektion verursacht werden. In Zukunft könnte es möglich sein, Zellpopulationen von ASCs zu isolieren und sie regenerativ anzuwenden. Eine visuelle Darstellung dieser Technik ist entscheidend, da die Erstellung des kranialen Defekts schwer zu erlernen ist, hauptsächlich weil der Defekt an einem gewölbten Schädel angelegt wird und sich sehr nahe an der Dura mater befindet.

Für dieses Protokoll wird subkutanes Fett aus dem Bauchbereich, der Flanke oder dem Oberschenkel eines gesunden menschlichen Spenders gesammelt und in einem Kunststoff-Saugbehälter aufbewahrt. Geben Sie dem Fett eine gleiche Menge steriler PBS hinzu und mischen Sie es durch vorsichtiges Schütteln 30 Sekunden lang. Lassen Sie die wässrige Phase absetzen und entfernen Sie diese anschließend mit einer 10-Milliliter-Kunststoffpipette.

Anschließend gießen Sie das Fett in einen großen Plastikbehälter und geben eine gleiche Menge des Verdauungsgemisches hinzu. Reinigen Sie den verschlossenen Fettbehälter mit 70 %igem Ethanol und verschließen Sie ihn mit Paraffin. Schütteln Sie den Behälter dann 30 Minuten lang bei 180 Umdrehungen pro Minute in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator.

Als Nächstes wird die Verdauung neutralisiert, indem das Reaktionsvolumen durch Zugabe von Standardmedium verdoppelt wird. Die Zellen werden abzentrifugiert, der Überstand vorsichtig entfernt und jedes Pellet in 5 Milliliter Standardmedium resuspendiert. Anschließend werden alle Suspensionen durch einen 100-Mikrometer-Filter in ein 50-Milliliter-Konischgefäß überführt.

Zentrifugieren Sie das Filtrat 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 300 G. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter RBC-Lysepuffer bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Suspension anschließend fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zur Lyse. Danach zentrifugieren Sie die Probe bei Raumtemperatur 15 Minuten lang und führen Sie die Trennschritte gemäß dem Textprotokoll durch.

Eine korrekte Zellsortierung ist für dieses Protokoll entscheidend. Zunächst werden die Zellen in FACS-Puffer bei einer Dichte von einer Million Zellen pro 100 Mikroliter resuspendiert und auf Eis gehalten. Anschließend werden mindestens 10 Millionen Zellen in ein auf Eis stehendes, mit BMPR-1B beschriftetes Plastikzentrifugenröhrchen überführt.

Überführen Sie eine Million Zellen in ein auf Eis gekühltes, als unbehandelt gekennzeichnetes Gefäß und geben Sie ein Milliliter FACS-Puffer hinzu. Kennzeichnen Sie die verbleibenden Zellen als nicht sortiert. Geben Sie anschließend den Antikörper zur BMPR-1B-Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig durch leichtes Auf- und Abpipettieren.

Lassen Sie dieses Gemisch die vom Hersteller empfohlene Zeit lang inkubieren. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen für die FACS-Sortierung und resuspendieren Sie sie vorsichtig in einem Milliliter FACS-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt erneut und stellen Sie die Zellen erneut auf eine Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter ein.

Leiten Sie nun alle drei Zellpopulationen durch 40-Mikron-Zellsiebe in Glas-FACS-Röhrchen. Verwenden Sie 500 Mikroliter FACS-Puffer, um die letzten Zellen von den Filtern abzuspülen. Bereiten Sie nun zwei Sammelgefäße für die antikörperpositive und -negative Population vor.

Befüllen Sie jede Probe mit zwei Milliliter Standardzellkulturmedium. Führen Sie am FACS-Gerät zuerst die unbehandelten Zellen aus und verwenden Sie die Ergebnisse, um ein negatives Tor für den fluoreszierenden Marker festzulegen. Anschließend sortieren Sie die gefärbten Zellen mithilfe einer 100-Mikron-Düse in die jeweiligen Röhrchen mit Standardmedium. Falls möglich, halten Sie diese Röhrchen während des Sortierens bei vier Grad Celsius gekühlt.

Fahren Sie fort, indem Sie die Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll in das Gerüst einbringen. Nach der Anästhesie des Tieres schneiden Sie die Haare von der Operationsstelle ab und desinfizieren die freigelegte Haut dreimal abwechselnd mit Povidon-Iod-Lösung und 70 %igem Ethanol. Anschließend wird das Tier mit einem Tuch abgedeckt, wobei die Operationsstelle freiliegt.

Verwenden Sie nun ein Skalpell mit 15er Klinge, um einen sagittalen medianen Schnitt vorzunehmen, der sich über den größten Teil des dorsalen Schädels erstreckt. Ziehen Sie anschließend mit feinzahnigen Pinzetten die Haut auf der rechten Seite des Schnittes zurück, um den rechten Parietalknochen freizulegen. Bereiten Sie den Bohrer mit einem autoklavierten vier Millimeter großen, diamantbeschichteten Trepanbohrer vor.

Bohren Sie anschließend einen Defekt durch den Parietalknochen, erweitern Sie den Defekt jedoch nicht über den Knochen hinaus und lassen Sie die Dura-mater-Schicht unberührt. Platzieren Sie nun einen Scaffold, der Zellen oder eine Kontrolllösung enthält, in den Defekt und verschließen Sie den Hautschnitt mit einer laufenden Nylonnaht. Fahren Sie danach gemäß den im Textprotokoll angegebenen Anweisungen mit der postoperativen Mauspelage fort.

Mikro-CT-Aufnahmen des Schädeldefekts, die am Tag der Operation durchgeführt wurden, zeigen deutlich den neuen Defekt. Wiederholte Scans zu späteren Zeitpunkten zeigen, dass die mit BMPR-1B-positiven Zellen besiedelten Defekte sich schneller schließen als solche mit BMPR-1B-negativen oder unsortierten Zellen. Wenn die Heilung als Prozentsatz des vollständigen Wundverschlusses quantifiziert wird, wird der Unterschied deutlich sichtbar.

Anschließend wurden die Teile der Schädel, die die Defekte enthielten, entkalkt und gefärbt, um neues und am Kontrollknochen regeneriertes Knochengewebe mittels der Movat-Fünffachfärbung nachzuweisen, die Knorpel vom Knochen sowie alle dazwischenliegenden Reifungsstadien unterscheidet. Im Vergleich zu unsortierten Zellen zeigten BMPR-1B-positive Zellen einen starken Einfluss auf den Regenerationsprozess, insbesondere deutlich entlang der Defektränder. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis für das klinische Potenzial dieses Experiments haben, spezifische ASCs aus Patienten zu isolieren und sie zur Heilung von Knochendefekten einzusetzen.

Viele nachgeschaltete Experimente können daraus abgeleitet werden, um noch mehr Fragen zur Knochenheilung zu beantworten, wie beispielsweise FACS zur Isolierung von ASCs mit unterschiedlichen Linienkommittments, Mikro-CT zur Analyse der Heilung verschiedener Zelltypen und Gewebe über die Zeit hinweg sowie das Schädeldefektmodell in diesem Experiment, um Ideen für weitere Experimente zur Knochenheilung zu entwickeln. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe äußerst gefährlich sein kann. Stellen Sie sicher, dass Sie angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen, einschließlich des Tragens von Handschuhen, der Verwendung von Augenschutz und der ordnungsgemäßen Entsorgung aller gefährlichen Abfälle.