Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das genomweite Replikations-Timing-Programm einer Zelle der Wahl abzubilden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Replikationsfeld zu beantworten. Zum Beispiel, wie sich das genomische Replikationsprogramm bei Gesundheit und Krankheit verändert.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle und einfache Möglichkeit bietet, den Replikationszeitpunkt in verschiedenen Zellen und unter verschiedenen Bedingungen abzubilden. Der Mann, der das Faxverfahren schreibt, ist Dan Lehmann, ein Faxexperte an der Medizinischen Fakultät. Dieses Verfahren beginnt in der Regel mit mindestens ein bis zwei mal zehn bis sechs schnell wachsenden, unsynchronisierten Zellen.

Bei adhärenten Zellen aspirieren und waschen Sie jede Platte mit drei Millilitern PBS ohne Kalzium oder Magnesium. Entsorgen Sie das PBS und geben Sie einen Milliliter handelsübliches Trypsin-EDTA auf jede Platte. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bis sie sich lösen.

Fügen Sie drei Milliliter Nährmedium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und sammeln Sie die Zellen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen oder einem Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen. Halten Sie die Zellen auf Eis. Zu Beginn des Verfahrens zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 x G bei vier Grad Celsius.

Aspirieren und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter kaltem PBS. Drehen Sie dann die Zellen nach unten. Entfernen Sie nach der zweiten Wäsche das PBS und resuspendieren Sie die Zellen in 250 Mikrolitern kaltem PBS.

Während Sie das Rohr vorsichtig vortexen, fügen Sie langsam tropfenweise 800 Mikroliter minus 20 Grad Celsius und 100 Prozent hochreines Ethanol hinzu. Dies führt zu unserer endgültigen Ethanolkonzentration von 70 bis 80 Prozent. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die fixierten Zellen zehn Minuten lang bei 500 x G bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter kaltem PBS. Nach jeder Wäsche runterschleudern.

Nach der zweiten Wäsche aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren jede Zelle mit der folgenden PI-Mischung. Ein Milliliter PBS enthält fünf Mikroliter von zehn Milligramm pro Milliliter RNAas und 50 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Propidiumiodid. Filtrieren Sie die Probe durch ein 35-Mikrometer-Netz in ein 5-Milliliter-Polystyrolröhrchen.

Verschließen Sie die Tube mit Parafilm. 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bewahren Sie die Proben im Dunkeln auf, da Propidiumiodid lichtempfindlich ist.

Die Sortierung der Zellen erfolgt mit Hilfe eines Faxgeräts. Verwenden Sie den 561-Nanometer-Laser, um Zellen anhand ihrer Propidiumiodid-Intensität zu unterscheiden. Verwenden Sie für optimale Ergebnisse die kleinste Düse, die für die jeweilige Zellengröße empfohlen wird.

Bei den meisten Zellen sind es 85 Mikrometer. Verwende einen gleichmäßigen, langsamen Fluss. In der Regel bis zu 300 bis 500 Ereignisse pro Sekunde.

Unterscheiden Sie mit Gating tote Zellen und subzelluläre Trümmer, indem Sie FCS vs. SSC darstellen. Von den lebensfähigen Zellen unterscheiden Sie Dubletten, indem Sie die SSC-Breite gegen die SSC-Höhe plotten, gefolgt von einem FFC-Breitendiagramm gegen FFC-Höhendiagramm und einem Propidiumiodid-Breitendiagramm gegen Propidiumiodid-Höhendiagramm. Für die lebensfähigen Signalzellen zeichnet man ein Histogramm der Propidiumiodid-Flächenintensität, das den DNA-Gehalt der Zellen darstellt.

Sortieren Sie Zellen unter kalten Bedingungen in G1- und S-Phasen. Das Gating für S sollte breit sein und in die Phasen G1 und G2 eindringen. Während das G1-Gating schmal und so weit wie möglich von S entfernt sein sollte.

Für verschiedene Zelltypen kann es schwierig sein, eine gute Zellzyklusverteilung zu erhalten. Es ist am wichtigsten, die G1-Phase ohne S-Phasenzellen einzunehmen. Entfernen Sie Röhren mit sortierten Zellen aus dem Faxgerät.

Halten Sie die Röhren nach der Sortierung auf Eis. Nach der Zellsortierung wird die DNA für jede Probe mit einem kommerziellen DNA-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Als nächstes wird die DNA mit einem fokussierten Ultraschallgerät auf eine durchschnittliche Ziel-Peakgröße von 250 Basenpaaren geschert.

Überprüfen Sie die Größe der reinen DNA durch Elektroforesis. Die empfohlene Größenverteilung beträgt 200 bis 700 Basenpaare mit einem Spitzenwert von etwa 250 Basenpaaren. Anschließend wird die Bibliothek vorbereitet, sequenziert und analysiert, wie im Textprotokoll beschrieben.

Es wird eine Karte zum Zeitpunkt der Replikation für das gesamte Chromosom eins aus embryonalen Fibroblasten der Maus gezeigt. Mit einem genaueren Blick auf eine Region von etwa 50 Megabasen. Die Punkte stellen das normalisierte Verhältnis von S zu G1 für einzelne Fenster dar, und die durchgezogene Linie stellt die Ergebnisse der kubischen Glätte und Interpolation dar.

Hohe S- bis G1-Werte entsprechen der frühen Replikation, während niedrige Werte einer späten Replikation entsprechen. Die roten Pfeile zeigen auf Beispiele für konstante Zeit von Replikationsregionen, und die grünen Pfeile zeigen auf zeitliche Übergangsregionen. Diese Abbildung zeigt die Reproduzierbarkeit der Zeit von Replikationskarten zwischen Triplikaten embryonaler Fibroblasten der Maus im Vergleich zu Triplikaten von Maus-Prä-B-Zellen in der gleichen 18-Megabasen-Region auf Mauschromosom eins.

Die orangefarbenen Pfeile zeigen Beispiele für unterschiedliche Bereiche zwischen den Zelllinien. Eine Heatmap der Speerman-Korrelationen zwischen den sechs Proben bestätigt die Ergebnisse weiter. Einmal gemeistert, kann diese Technik, von der Sammlung der Zellen bis zur Erstellung von Karten, in einer Woche abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie genomische Karten zum Zeitpunkt der Replikation für wachsende Zellen erstellen können.