Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, synthetische Multigen-Operons unter der Kontrolle einer induzierbaren T7-RNA-Polymerase zu konstruieren, um mehrere Proteine gleichzeitig zu exprimieren. Diese Methode kann Forschern in der synthetischen Biologie und Biochemie helfen, indem sie die Erstellung von Multiprotein-Wegen ermöglicht oder die Untersuchung von Protein-Komplexen, die auf eine Ko-Expression mehrerer Ansätze angewiesen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die gleichzeitige Expression mehrerer Gene in Escherichia coli aus einem einzigen Plasmid ermöglicht.

Den Versuch aus meinem Labor demonstrieren Mohamed Hassan, ein Doktorand, und Angela Thompson, eine Praktikantin. Nachdem die Gene des Interesses gemäß dem Textprotokoll gewonnen und amplifiziert wurden, bereiten Sie die Verdauungsreaktionen für das erste Gen des Interesses und den pMGX-Faktor vor. Verwenden Sie eine 40-Mikroliter-Reaktion mit 0,5 bis 1,5 Mikrogramm DNA in das Indel-Enzym.

Die Reaktionen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend EcoRI hinzufügen und den Verdau weitere eine Stunde lang fortsetzen lassen. NdeI wird vor EcoRI zugegeben, um sicherzustellen, dass der Verdau effektiv erfolgt.

NdeI ist empfindlich gegenüber der Länge der doppelsträngigen DNA auf beiden Seiten der Restriktionsstelle. Die Zugabe zuerst stellt sicher, dass es das vollständige zirkuläre Plasmid schneidet. Laden Sie die Verdauungsreaktionen auf ein 0,7 %iges Agarosegel auf und führen Sie die Elektrophorese der Proben bei 100 Volt für 55 Minuten durch.

Entfernen Sie anschließend mit einem sauberen Skalpell oder Rasierklinge die Bande von Insert und Vektor und geben Sie die ausgeschnittenen Gelstücke in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Reinigen Sie die DNA mithilfe eines Gel-Extraktionskits gemäß dem schriftlichen Protokoll. Bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Ligationsreaktion vor, die 0,15 bis 0,5 Mikrogramm Vektor-DNA, die je nach Größe des Gens geeignete Menge an Insert und ein Mikroliter T4-DNA-Ligase enthält.

Unter aseptischen Bedingungen 100 Mikroliter-Aliquote chemisch kompetenter XL1-Blue E.coli-Zellen fünf Minuten lang auf Eis auftauen. Anschließend fünf Mikroliter der Ligationsansätze, die ein Gen von Interesse enthalten, zu den Zellen hinzufügen. Die Transformationsansätze 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Erhitzen Sie die Zellen anschließend 45 Sekunden lang in einem Wasserbad mit 42 Grad Celsius. Danach stellen Sie die Transformationen auf Eis und geben 200 Mikroliter kaltes LB-Medium hinzu. Lassen Sie die Zellen zwei Minuten lang inkubieren.

Die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 220 Umdrehungen pro Minute eine Stunde lang inkubieren und 100 Mikroliter auf LB-Agarplatten mit einem geeigneten selektierbaren Marker auftragen. Um Kolonien auf mögliche Transformanten zu screenen, vergleichen Sie die Anzahl der Kolonien auf der negativen Kontrolle mit der auf den Ligationsplatten. Ein Verhältnis der Kolonienzahlen von eins zu zwei ist erwünscht.

Wählen Sie vier bis acht einzelne Kolonien aus jeder Ligationsreaktion aus, um 4 Milliliter LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum anzusetzen. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit dem Plasmid-DNA-Isolationskit gemäß dem schriftlichen Protokoll und bereiten Sie 20-Mikroliter-Digesterreaktionen mit 150 bis 500 Nanogramm DNA unter Verwendung von jeweils einem Mikroliter NdeI und EcoRI vor.

Die Verdauungsreaktionen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um Gen zwei in den pMGX-Vektor, der Gen eins enthält, einzufügen, eine 40-Mikroliter-Verdauungsreaktion ansetzen, die 0,5 bis 1,5 Mikrogramm Vektor-DNA mit dem ersten Gen der Untersuchung und ein Mikroliter AVR2 enthält. Die Reaktion 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor 1,5 Mikroliter Calf-intestinale Phosphatase hinzugefügt werden.

30 Minuten länger inkubieren. Danach eine 40-Mikroliter-Verdauungsreaktion aufsetzen, die 0,5 bis 1,5 Mikrogramm des pMGX-Vektors mit dem zweiten Gen von Interesse enthält. Dazu ein Mikroliter AVR2 und xpol verwenden.

Die Reaktion 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Restriktionsverdauungsprodukte auf einem 0,7%-Agarosegel elektrophoretisch trennen. Den Insert und die Vektorbänder mit einem sauberen Skalpellradierer herausschneiden, wie zuvor gezeigt.

Nach der Extraktion der Plasmid-DNA und der Quantifizierung der Probe gemäß dem Textprotokoll ein Ligationsansatz mit einem 3:1 Insert-zu-Vektor-Verhältnis von Gen 2 und pMGX-yfg1 aufsetzen. Einen negativen Kontrollansatz mit nur pMGX-yfg1 einbeziehen. Fünf Mikroliter jedes Ansatzes in XL1-Blue-Zellen transformieren, wie zuvor gezeigt.

Vergleichen Sie anschließend die Kolonienanzahl auf der Negativkontrolle- und den Ligationsplatten. Wenn sich auf der Negativkontrollplatte eine große Anzahl von Kolonien befindet, überprüfen Sie die CIP-Behandlung. Wählen Sie vier bis acht einzelne Kolonien aus der Ligationsreaktion aus und verwenden Sie jeweils eine Kolonie, um vier Mikroliter LB mit dem entsprechenden Antibiotikum anzusiedeln.

Über Nacht bei 37 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute kultivieren. Nach der Isolierung und Quantifizierung der Plasmid-DNA wie zuvor beschrieben, auf effektive Insertion des zweiten Gens mittels eines Verdauungsansatzes prüfen, der 150 bis 500 Nanogramm DNA und ein Mikroliter EcoRI enthält. Die Ansätze zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Für Screening-Zwecke wird EcoRI empfohlen, jedoch können in einigen Fällen mit EcoRI zwei oder mehr Inserte ähnlicher Größe erzeugt werden, die im Gel schwer voneinander zu unterscheiden sind. Zur Sicherstellung des Erfolgs sollte ein alternatives Restriktionsverdauungsenzym wie NdeI verwendet werden. Trennen Sie die Verdauungsreaktionen in einem Agarosegel und suchen Sie nach einem Band, das der Größe des eingefügten Gens 2 entspricht.

Klonen Sie zusätzliche Gene in das Plasmid gemäß dem Textprotokoll. Um das polycistronische Plasmid zu erzeugen, wurden die fünf Gene zunächst in ein geeignetes Plasmid, pMGX A, kloniert. Diese Abbildung zeigt pCR-Blunt-yfg1 und pCR-Blunt-yfg2 im pMGX A-Plasmid sowie pMGX A, das mit indel und EcoRI verdaut wurde. Um die ersten beiden Gene in pMGX A zu klonen, wurde das Plasmid mit indel und EcoRI verdaut.

Nach dem Klonieren wurden pMGX-yfg1 und pMGX-yfg2 mit AVR2 und xpol digeriert, um zu bestätigen, dass erfolgreiche Klone erhalten wurden. Diese Abbildung zeigt den pMGXyfg1-Vektor, der mit AVR2 digeriert wurde, und den pMGX-yfg2-Vektor, der mit AVR2 und xpol digeriert wurde, um das Gen der Interesse zwei zu isolieren. Das resultierende Insert wurde in pMGX-yfg1 geklont, um den pMGX-yfg1-zwei-Vektor zu erzeugen.

Wie hier zu sehen ist, bestätigte die Verdauung von pMGX-yfg1 zwei mit EcoRI die erfolgreiche Klonierung des Gens der Interesse Nummer zwei in pMGX-yfg1. Dieses Gelelektrophoresebild zeigt den Unterschied zwischen verdauten Plasmiden, die entweder die Insertion in korrekter oder in umgekehrter Orientierung aufweisen. Bei einer Insertion in umgekehrter Orientierung liegen zwei EcoRI-Stellen in unmittelbarer Nähe zueinander, wodurch die resultierenden verdauten 50-Basenpaar-Fragmente im Gel nicht nachweisbar sind und das Vektorskelett größer erscheint.

Schließlich bestätigt eine Westernblot-Analyse der exprimierten Proteine nach der Erzeugung eines fünfgeningen polyzystronischen Expressionsvektors, dass alle fünf Proteine von einem einzigen Vektor exprimiert wurden. Beachten Sie, dass das von yfg5 produzierte Protein die gleiche Größe wie yfg1 aufweist und im Gel nicht getrennt wird. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei bis vier Tagen pro eingefügtem Gen in das pMGX-Backbone abgeschlossen werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Vektor mit einer Phosphatase wie der Kälberdarmphosphatase zu behandeln und zu linearisieren, um den fünf Vektor zu dephosphorylieren. Nach diesem Verfahren können weitere Experimente wie die multigenetische Expression in vivo durchgeführt werden, um biosynthetische Stoffwechselwege zur Herstellung natürlicher Produkte zu charakterisieren und nutzbar zu machen oder um Protein-Protein-Komplexe zu untersuchen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der synthetischen Biologie, komplexe Kohlenhydrate und genetisch veränderte E. coli herzustellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Multigen-Expressions-System in E. coli implementiert wird.