Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

In der Epidermis. Die Immunhistochemie ist ein effizientes Mittel, um bestimmte Proteine in ihrem Expressionskompartiment zu lokalisieren. In diesem Video zeigen wir eine zuverlässige Methode zur Immunlokalisierung von Proteinen in der Epidermis, die wir routinemäßig in unserem Labor anwenden.

Hallo, ich bin Tammy von Dr. Turins Labor hier im niedrigen Gebäude des Ottawa Health Research Institute im Programm für chronische Krankheiten. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Immunhistochemie mit fluoreszierenden Antikörpern an paraffineingebetteten Gewebeschnitten der Epidermis der Maus. In unserem Labor haben wir Protokolle für die Immunlokalisierung von epidermalen Differenzierungsmarkern unter Verwendung von BOs fixiertem Gewebe optimiert.

Im Rahmen der Optimierung halten wir die Haut flach, indem wir sie vor dem Fixieren auf einem Papiertuch auslegen. Dieses Verfahren umfasst das Präparieren der Epidermis, die Fixierung, die Dehydratisierung, das Einbetten von Paraffin und das Schneiden des Schnitts, das Entwachsen, die Rehydration, die Demaskierung des Antigens, die Demaskierung von Antikörpern und schließlich das Einbinden und Visualisieren mit Epi-Fluoreszenz. Also lasst uns loslegen.

Bei der Verwendung von neugeborenen Mäusen ist es nicht erforderlich, die Rückenhaut zu rasieren. Wenn Sie jedoch ältere Mäuse haben, die Fell haben, müssen Sie die Rückenhaut abrasieren, damit sie dem Schneiden der Abschnitte nicht im Weg steht. Wenn Sie Ihre Dissektion durchführen, sollten Sie sehr vorsichtig sein, Ihre Pinzette nicht in die Bereiche der Haut zu stecken, die Sie für Ihren Assay verwenden möchten.

Was wir also tun, ist, dass wir die Pinzette einfach um den Rand der Stelle legen, an der wir schneiden werden, und dann heben wir sehr vorsichtig an, schneiden die Epidermis und denken daran, den Bereich, den Sie für Ihr Experiment verwenden möchten, nicht zu berühren. Wenn wir die Haut reparieren, wollen wir nicht, dass sich die Haut aufrollt und in der Tube ist. Wir wollen, dass es schön flach ist.

Um das zu unterstützen, legen wir die Haut auf ein Papiertuch, damit sie flach bleibt, während sie fixiert wird. Jetzt, da wir die Haut schön flach auf dem Papiertuch haben, schneiden wir die Ränder ab oder schneiden sie ab, um die Teile zu entfernen, die wir möglicherweise mit der Pinzette beschädigt haben. Und dann schneidet man die Haut in sehr kleine Stücke, etwa zwei Millimeter mal zwei Millimeter

Jetzt wird das Gewebe fixiert. Nachdem Sie die Haut in handliche Stücke geschnitten haben, tauchen Sie sie in die Boin-Lösung. Verschließen Sie die Röhrchen, umwickeln Sie die Röhrchen mit Perfil und legen Sie sie auf eine Wippe.

Für eine Inkubation über Nacht ist es wichtig, nur 16 bis 18 Stunden in der Boin-Lösung zu inkubieren. Kürzere oder längere Fixationszeiten schädigen Ihr Gewebe. Die Inkubation ist vorbei.

Sie spülen Ihr Taschentuch mit PBS und dann durch eine Reihe von Ethanol-Waschungen mit 30 %, 50 % und 70 % Alkohol. Sie können sehen, dass der BO eine gelbe Farbe hat und dass die Farbe der Waschung immer weniger gelb wird, wenn die Boons verdünnt werden. Du wäschst jedes Mal zweimal 30 Minuten.

Nach der letzten Wäsche in Ethanol werden die Proben in ein frisches 70%iges Ethanol gelegt und können bis zur Weiterverarbeitung einige Schlote mit Paraffin bei vier Grad Celsius gelagert werden. Einbettung. Die übermäßige Verwendung von gefrorenem Gewebe bedeutet, dass die Gewebeintegrität überlegen ist und Proben über lange Zeiträume gelagert werden können. Im Allgemeinen liefern Core Facilities reproduzierbarere Ergebnisse.

Wenn Sie jedoch über die Anlage und einen engagierten Bediener verfügen, der über das Know-how verfügt, können die Abschnitte intern geschnitten werden. Zu lernen, gute Abschnitte zu schneiden, ist eher eine Kunstform. Daher nutzen wir eine Core Facility.

Nachdem Sie die Objektträger von der Core-Einrichtung zurückerhalten haben, können Sie sehen, dass das Paraffin auf den Objektträgern vorhanden ist. Als dünner Film werden die Objektträger wie eine Ofenkartoffel auf ein mit Alufolie umwickeltes Gestell gelegt und fünf Minuten bei 55 Grad inkubiert. Nachdem die Inkubation beendet ist, wickeln Sie die Objektträger schnell aus und legen Sie sie für drei Wäschen von fünf Minuten in Toluol.

Es ist sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Fünf-Minuten-Waschmaschinen gut getimt sein sollten, zu lange inkubieren und Toluol nicht gut für Ihre Proben ist. Nach den drei Wäschen und Toluol spülen Sie es schnell mit hundertprozentigem Ethanol ab. Da Ethanol und Toluol einen Niederschlag bilden, der Ihr Experiment stört, ist dies ein sehr wichtiger Schritt, den Sie sich merken sollten.

Anschließend werden die Proben durch Inkubation von Objektträgern rehydriert, fünf Minuten in 95 % Ethanol, fünf Minuten in 70 % Ethanol und dann zweimal fünf Minuten in Wasser. Zu diesem Zeitpunkt können Gewebe für die Färbung mit h und e aufbereitet werden. Zu diesem Zweck nutzen wir auch die Core Facility.

Für die Antigen-Demaskierung arme 500 mil Einmalcitratpuffer in ein Ein-Liter-Plastikbecherglas geben und Ihre Objektträger eintauchen. Denken Sie daran, den Metallgriff zu entfernen und Ihren Becher in die Mikrowelle zu stellen. Mikrowelle bei hoher Leistung für zwei mal fünf Minuten.

Denken Sie daran, die Tür zu öffnen, um die Mikrowelle zwischen Ihren beiden Inkubationen abzukühlen. Nachdem die Mikrowelle beendet ist, nehmen Sie die Objektträger aus dem kochenden Citratpuffer und legen Sie sie in eine Färbeschale mit warmem Wasser. Wir verwenden nur warmes Leitungswasser und der Zweck davon besteht darin, Ihre Dias langsam vom Sieden auf Raumtemperatur abzukühlen.

Jetzt können Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten in PBS waschen und wir sind bereit, mit der Immunhistochemie zu beginnen. Das erste, was wir tun müssen, um mit der Immunfärbung zu beginnen, ist, den Bereich um unsere Proben mit einem Stück Seidenpapier zu trocknen. Um eine Kreuzkontamination mit Antikörpern zu verhindern, grenzen wir den Bereich um unsere Proben mit einem Flüssigblocker ab.

Bereiten Sie eine befeuchtete Kammer vor, indem Sie ein Filterpapier in eine Petrischale geben. Tränken Sie es mit Wasser, entfernen Sie das überschüssige Wasser und setzen Sie Ihre Dias ein. Der Grund, warum wir eine befeuchtete Kammer verwenden, besteht darin, sicherzustellen, dass unsere Objektträger während unserer Inkubationszeiten nicht austrocknen.

Es ist sehr wichtig, dass die Folien nicht trocknen, da das Zeichnen den Hintergrund vergrößert. Die Objektträger werden zu diesem Zeitpunkt mit einem Inkubationspuffer für 30 Minuten blockiert. Übertragen Sie Ihre Objektträger nach dem Blockieren zurück in das Objektträgergestell und inkubieren Sie sie im Waschpuffer.

Entfernen Sie den überschüssigen Puffer wie zuvor. Legen Sie den Objektträger wieder in die befeuchtete Kammer und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang mit dem Primärantikörper. Bei Raumtemperatur.

Wenn Ihre einstündige Inkubation abgelaufen ist, legen Sie die Objektträger wieder in den Objektträgerrost und waschen Sie sie dreimal 10 Minuten lang mit Waschpuffer. Entfernen Sie nach dem Waschen den überschüssigen Waschpuffer mit einem Seidenpapier um Ihre Probe herum. Legen Sie die Objektträger zurück in die befeuchtete Kammer und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit Sekundärantikörper, nach der Inkubation mit dem Sekundärantikörper waschen Sie in drei Wechseln des Waschpuffers jeweils 15 Minuten.

Als nächstes waschen wir in drei mal fünf Minuten. Entfernen Sie in PBS alle überschüssigen Flüssigkeiten, die die Probe umgeben, und wischen Sie das PBS von der Rückseite des Objektträgers ab, um Deckgläser am Objektträger anzubringen. Wir nutzen Handy mit 2,5%DAB co.

Um das Ausbleichen zu reduzieren, fügen Sie den Objektträgern 80 Mikroliter tropfenweise hinzu. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Dann ganz langsam auf einem Deckglas absenken.

Achten Sie darauf, keine Blasen zu hinterlassen. Blasen sind schlecht, weil sie oft direkt auf Ihrem Exemplar landen, genau dort, wo Sie Ihre Bilder aufnehmen möchten, nachdem Ihr Handy getrocknet ist. Jetzt können Sie loslegen Schauen Sie sich Ihre Folien an.

Hier ein Blick auf eine gelungene Färbung mit einem FITC-Filter. In einem 20-fach-Objektiv sehen wir Clain sechs, das mit allen superbasalen Schichten der Epidermis verbunden ist. Unser Labor interessiert sich sehr für die Expression und Lokalisation von Claudinen in der Epidermis.

In Bezug auf Tight Junctions und die Bildung der epidermalen Permeabilitätsbarriere haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Immunhistochemie an der Haut von Mäusen durchführen können. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Ihre Gewebeschnitte flach sein sollen und dass Sie sicherstellen möchten, dass Ihre Objektträger zwischen den Inkubationen nicht austrocknen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.