Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

In der Epidermis. Die Immunhistochemie ist ein effizientes Verfahren, um spezifische Proteine in ihrem Expressionskompartiment zu lokalisieren. In diesem Video demonstrieren wir eine zuverlässige Methode zur Immunlokalisierung von Proteinen in der Epidermis, die wir routinemäßig in unserem Labor anwenden.

Hallo, ich bin Tammy aus dem Labor von Dr. Turin hier im niedrigen Gebäude des Ottawa Health Research Institute im Bereich Chronische Erkrankungen. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Immunhistochemie unter Verwendung fluoreszierender Antikörper an paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten der Maushaut. In unserem Labor haben wir Protokolle zur immunmikroskopischen Lokalisierung von Markern der epidermalen Differenzierung mit BO'S-fixiertem Gewebe optimiert.

Als Teil der Optimierung halten wir die Haut flach, indem wir sie vor der Fixierung auf Papiertuch auslegen. Dieses Verfahren umfasst die Dissektion der Epidermis, Fixierung, Dehydrierung, Paraffineinbettung, Schneiden von Schnitten, Entparaffinierung, Rehydratation, Antigenfreilegung, Antikörperfärbung und schließlich das Aufbringen und die Visualisierung mittels Epifluoreszenz. Beginnen wir also.

Bei der Verwendung von neugeborenen Mäusen besteht keine Notwendigkeit, die Rückenhaut zu rasieren. Wenn Sie jedoch ältere, behaarte Mäuse verwenden, müssen Sie die Rückenhaut rasieren, damit sie beim Schneiden der Schnitte nicht im Weg ist. Während der Dissektion sollten Sie darauf achten, die Pinzette nicht in den Bereichen der Haut anzusetzen, die Sie später für Ihren Assay verwenden möchten.

Was wir tun, ist, die Pinzette einfach um den Rand der Stelle zu legen, an der wir schneiden werden, dann heben Sie sehr vorsichtig an, durchtrennen die Epidermis und achten darauf, den Bereich, den Sie für Ihr Experiment verwenden möchten, nicht zu berühren. Wenn wir die Haut fixieren, wollen wir nicht, dass sie sich aufrollt und im Reagenzglas landet. Wir möchten, dass sie schön flach bleibt.

Um dies zu unterstützen, legen wir die Haut auf ein Papiertuch, damit sie während der Fixierung flach bleibt. Nachdem wir die Haut nun gut und flach auf dem Papiertuch liegen haben, schneiden wir die Ränder ab oder beschneiden sie, um die Bereiche zu entfernen, die möglicherweise mit der Pinzette beschädigt wurden. Anschließend schneidet man die Haut in sehr kleine Stücke von etwa zwei Millimeter mal zwei Millimeter.

Jetzt wird das Gewebe fixiert. Nachdem die Haut in handliche Stücke geschnitten wurde, tauchen Sie sie in die Boin-Lösung ein. Verschließen Sie die Röhrchen, wickeln Sie sie mit Perfil ein und stellen Sie sie auf einen Schüttler.

Für eine Übernacht-Inkubation ist es wichtig, nur 16 bis 18 Stunden in der Boin-Lösung zu inkubieren. Kürzere oder längere Fixierungszeiten schädigen Ihr Gewebe. Die Inkubation ist beendet.

Sie spülen Ihr Gewebe mit PBS und anschließend durch eine Reihe von Ethanolwäschen mit 30 %, 50 % und 70 % Alkohol. Sie können erkennen, dass das BO gelblich ist und dass die Farbe der Waschflüssigkeit mit fortschreitender Verdünnung des BO immer weniger gelb wird. Sie waschen zwei Mal, jeweils 30 Minuten lang.

Nach der letzten Waschung in Ethanol werden die Proben in frisches 70 % Ethanol gegeben und können bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis sie später einer Paraffineinbettung unterzogen werden. Ein Vorteil von gefrorenen Geweben ist, dass die Gewebeintegrität überlegen ist und die Proben über längere Zeiträume gelagert werden können. Im Allgemeinen erzielen zentrale Einrichtungen reproduzierbarere Ergebnisse.

Jedoch können Schnitte intern angefertigt werden, wenn die entsprechende Einrichtung und ein geschulter Bediener mit Fachkenntnissen zur Verfügung stehen. Das Anfertigen guter Schnitte ist eher eine Kunstform. Daher nutzen wir eine zentrale Einrichtung.

Nachdem Sie die Objektträger von der Core-Einrichtung zurückerhalten haben, können Sie erkennen, dass Paraffin auf den Objektträgern vorhanden ist. Als dünner Film werden die Objektträger auf einen mit Aluminiumfolie umwickelten Rack gestellt, genau wie eine Ofenkartoffel, und für fünf Minuten bei 55 °C inkubiert. Sobald die Inkubation beendet ist, entfernen Sie die Objektträger schnell von der Folie und legen sie zur dreimaligen Wäsche jeweils fünf Minuten lang in Toluol.

Es ist sehr wichtig, daran zu denken, dass diese fünfminütigen Waschschritte genau zeitlich abgestimmt werden müssen, da eine zu lange Inkubation dazu führt, dass Toluol Ihre Proben schädigen kann. Nach den drei Waschungen und Toluol führen Sie eine kurze Spülung mit hundertprozentigem Ethanol durch. Da Ethanol und Toluol ein Präzipitat bilden, das Ihre Experimente stören würde, ist dieser Schritt besonders wichtig.

Anschließend werden die Proben durch Inkubation der Objektträger fünf Minuten in 95 % Ethanol, fünf Minuten in 70 % Ethanol und dann zweimal fünf Minuten in Wasser rehydriert. Zu diesem Zeitpunkt können die Gewebe für die Färbung mit H und E aufgearbeitet werden. Für diesen Zweck nutzen wir ebenfalls die zentrale Einrichtung.

Für die Antigenfreilegung geben Sie 500 ml frisches Citratpuffer in einen einliterigen Kunststoffbecher und tauchen Sie Ihre Objektträger ein. Denken Sie daran, den Metallgriff zu entfernen, und stellen Sie den Becher in die Mikrowelle. Erhitzen Sie im Mikrowellengerät bei voller Leistung zwei Mal je fünf Minuten.

Darauf achten, die Tür zwischen den beiden Inkubationsschritten zu öffnen, um die Mikrowelle abzukühlen. Nach Beendigung der Mikrowellenbehandlung die Objektträger aus dem siedenden Citratpuffer nehmen und in eine Färbeschale mit warmem Wasser überführen. Wir verwenden einfach warmes Leitungswasser, um die Objektträger langsam von Siedetemperatur auf Raumtemperatur abzukühlen.

Jetzt können Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten in PBS waschen, und wir sind bereit, mit der Immunhistochemie zu beginnen. Als Erstes müssen wir die Umgebung unserer Proben mit einem Stück Papiertuch trocknen, um eine Antikörper-Kreuzkontamination zu vermeiden. Dazu begrenzen wir den Bereich um unsere Proben mit einem flüssigen Abgrenzmittel.

Bereiten Sie eine befeuchtete Kammer vor, indem Sie ein Filterpapier in eine Petrischale geben. Befeuchten Sie es mit Wasser, entfernen Sie überschüssiges Wasser und geben Sie Ihre Objektträger hinein. Der Grund, warum wir eine befeuchtete Kammer verwenden, liegt darin, sicherzustellen, dass während der Inkubationszeiten die Objektträger nicht austrocknen.

Es ist sehr wichtig, dass die Objektträger nicht austrocknen, da dies den Hintergrund erhöhen würde. Die Objektträger werden zu diesem Zeitpunkt mit Inkubationspuffer für 30 Minuten blockiert. Nach der Blockierung überführen Sie die Objektträger zurück in das Objektträgergestell und inkubieren sie in Waschpuffer.

Entfernen Sie den überschüssigen Puffer, wie zuvor. Legen Sie den Objektträger zurück in die befeuchtete Kammer und inkubieren Sie eine Stunde lang mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur.

Wenn die einstündige Inkubation abgelaufen ist, legen Sie die Objektträger zurück in den Objektträgerbehälter und waschen Sie dreimal für jeweils 10 Minuten mit Waschpuffer. Nach den Waschschritten entfernen Sie den überschüssigen Waschpuffer um Ihr Präparat mit einem Tissuepapier. Legen Sie die Objektträger zurück in die befeuchtete Kammer und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur mit sekundärem Antikörper. Nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper waschen Sie dreimal mit frischem Waschpuffer, jeweils 15 Minuten.

Danach waschen wir dreimal fünf Minuten lang in PBS, entfernen überschüssige Flüssigkeit um das Präparat und wischen das PBS von der Unterseite des Objektträgers ab, um Deckgläser auf dem Objektträger zu montieren. Wir verwenden Mobil mit 2,5 % DAB co.

Um die Ausbleichung zu reduzieren, geben Sie 80 Mikroliter tropfenweise auf die Objektträger. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuschließen. Senken Sie dann langsam einen Deckgläser auf.

Darauf achten, dass keine Blasen zurückbleiben. Blasen sind problematisch, weil sie sich oft direkt auf Ihrem Präparat absetzen, genau dort, wo Sie Ihre Aufnahmen machen möchten, nachdem Ihr Mobiltelefon trocken ist. Jetzt sind Sie startklar. Sehen Sie sich Ihre Objektträger an.

Hier sehen wir eine erfolgreiche Färbung mit einem FITC-Filter. Mit einem 20x-Objektiv erkennen wir Claudin 6 in Verbindung mit allen suprabasalen Schichten der Epidermis. Unser Labor interessiert sich sehr für die Expression und Lokalisation von Claudinen in der Epidermis.

Was die engen Verbindungen und die Bildung der epidermalen Permeabilitätsbarriere betrifft, haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Immunhistochemie an der Maushaut durchführt. Bei dieser Methode ist es wichtig, daran zu denken, dass Ihre Gewebeschnitte flach liegen sollen und dass Sie sicherstellen müssen, dass Ihre Objektträger zwischen den Inkubationsschritten nicht austrocknen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.