Name: Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion humaner mesenchymaler Stammzellen Homing in den Darm zur Verwendung in murinen Modellen von experimentellen entzündlichen Darmerkrankungen erhöhen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Erfahren Sie die ultraschallgeführte intrakardiale Injektion humaner mesenchymaler Stammzellen zur Verbesserung der Homing-Effizienz im entzündeten Darm bei murinen Modellen. Diese Methode ermöglicht präzise Zellverabreichung mit minimaler Mortalität.

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Maneesh Dave wird vom US-Verteidigungsministerium Grant PR141774 und der Morbus Crohn und Colitis Foundation of America Career Development Award unterstützt. Das Labor von Fabio Cominelli stützt sich auf NIH DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) und DK07948 (F.C.) gewährt. Das Labor von Arnold Caplan wird teilweise von David L. und E. Virginia Baldwin Foundation unterstützt. Förderinstitutionen hatte keine Rolle bei der Analyse der Studie oder Schreiben des Manuskripts. Deren Inhalt sind ausschließlich in der Verantwortung der Autoren.

alle Mäuse Experimente und Verfahren in der Studie wurden von der Case Western Reserve University genehmigt &#39; s institutionelle Animal Care und Use Committee. Die Verfahren wurden im Verein zur Bewertung durchgeführt und Akkreditierung von Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Einrichtung. Der BM war unter einer Universität Krankenhäuser Institutional Review Board genehmigt Protokoll in der Stammzellen-Kern-Anlage an der Case Western Reserve University nach Einwilligung aspiriert.
 1. Kultur und Transduktion menschlichen Knochenmark mesenchymale Stammzellen (hMSCs) Hinweis: die Isolierung des hMSCs ist ausführlich in früheren Publikationen 15 , 20.
<ol><li>Kultur isoliert hMSCs in Dulbecco &#39; s geändert Eagle mittlere bis niedrige Glukose (DMEM-LG) Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt. Kultur der Zellen bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2 in T175 Fläschchen mit 25 mL Wachstumsmedium. Ersetzen Sie das Medium alle 3-4 Tage. Am 14. Tag führen Sie die primäre Passage des hMSCs.
	<ol><li>Wenn die Zellen erreichen 80 % Zusammenfluss, das alte Medium vollständig zu entfernen und vorsichtig Waschen der Zellen mit 5 mL sterilem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; für 75 cm Gewebe Kulturflaschen).</li>
		<li>Der PBS aus der Flasche zu entfernen und 4 mL 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Ort der Kolben wieder in den Inkubator bei 37 ° C für 5-10 min. halten Sie die Dauer der Exposition so kurz wie möglich.</li>
		<li>Wenn der Großteil der Zellen gut abgerundeten geworden sind oder von der Kulturschale abgelöst haben, stoppen die Reaktion durch Zugabe von einem Volumen von Rindern Kälberserum gleich die Hälfte des Volumens von Trypsin.</li>
		<li>Übertragen die Zellsuspension auf eine geeignete Größe Zentrifugenröhrchen. Die Zellen bei 400 X g für 5 min Zentrifugieren und dann entfernen Sie vorsichtig den überstand.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen in 5 mL Medium (DMEM-LG + 10 % FBS) und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. 
		Hinweis: An dieser Stelle die Zellen können subkultiviert oder mit dreifach Reporter ausgestrahlt.</li>
	</ol></li> <li>Führen die Signalweiterleitung hMSCs mit dreifach-Reporter.
	<ol><li>1,5 x 10 6 Samenzellen in einem T175 Kolben. Kulturzellen Sie in 25 mL Nährmedium bei 37 ° C, 95 %, Feuchtigkeit und 5 % CO 2. Warten Sie 24 h für die Zellen befestigen.</li>
		<li>Machen einen Virus in 15 mL-Tuben, cocktail, wie in Referenz 18 beschrieben.
		<ol><li>Tauwetter Lentivirus bei 37 ° C in einem Wasser-Bad. Fügen Sie 160 µL einer 5 mg/mL-Proteamine-Sulfat-Lösung in Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) bis 8 mL Kulturmedium (DMEM-LG + 10 % FBS) für eine Endkonzentration von 100 µg/mL. Wirbel für 3 S. Add vielfältige Virus Infektion (MOI) 5 (1. Mal aufgetaut) .</li>
		</ol></li> <li>Entfernen Sie das Medium aus der Zelle Kultur Kolben (Schritt 1.2.1) und die Zellen die Virus-Cocktail hinzufügen. 10 h bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO 2 inkubieren.</li>
	</ol></li> <li>Fügen Sie 4 mL 100 µg/mL Proteamine Sulfat in 4 mL DMEM-LG + 10 % FBS und inkubieren Sie für eine zusätzliche 14 h</li>
	<li>Stoppen die Signalweiterleitung nach 24 h durch den Austausch mit 25 mL Medium (DMEM-LG + 10 % FBS).</li>
	<li>Bestätigen Transduktion Effizienz durch die Auswertung mRFP Ausdruck von Flow Cytometry 18. 
	Hinweis: Hier, hMSCs, die ausgestrahlt wurden mit über 65 % Effizienz dienten.</li>
	<li>Erweitern die Zellen durch den Austausch mit 25 mL frisches Medium (DMEM-LG + 10 % FBS) zweimal in der Woche. Kultur der Zellen bei 37 ° C, 95 %, Feuchtigkeit und 5 % CO 2. Durchgang Zellen, nachdem sie 80 % Zusammenfluss erreichen.</li>
	<li>Sobald die gewünschte Anzahl von Zellen erreicht wird, führen Sie Trypsinization pro Schritte 1.1.2 - 1.1.4.</li>
	<li>Der Zellen zu zählen und in sterilen PBS auszusetzen (1 X) in die Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen/µL 75. halten die Zellen auf dem Eis für den Transport, das Ultraschallgerät. Für Experimente, verwenden hMSCs aus Durchgang Ziffern 2-5.</li>
</ol> 2. Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion von hMSCs in die linke Herzkammer Hinweis: Verwendung SAMP1/YitFc mit etablierten klein-Darm-Entzündung und Alter und Geschlecht abgestimmt AKR/J Mäusen für die Experimente. Pflegen Sie die SAMP und AKR Mäuse unter bestimmten Bedingungen Pathogen-freies, füttern Sie Standardlabor Chow, und halten sie über 12 h hell/dunkel-Zyklen. Hier wurden die Ultraschall-geführte kardiale Injektionen in einem dedizierten Pathogen-freies Herzultraschalluntersuchung Raum befindet sich in der Home-Tier Forschungsanlage, die mit einem Desinfektionsmittel desinfiziert und mit 70 % Alkohol gespült wurde durchgeführt. Laborpersonal Forschung tragen persönlichen Schutzausrüstung, einschließlich Kleider, Gesichtsmasken mit Auge Schilden und sterile Handschuhe während die intrakardialen Injektionen. Die Körperwärme der Maus muss für die Dauer des Verfahrens beibehalten werden.
<ol><li>Eingerichtet, die Ultraschall-Bildgebung System vor die Maus zu betäuben. Verwenden Sie für dieses Protokoll das Ultraschallgerät für Maus Echokardiogramm konzipiert.
	<ol><li>Schalten Sie die Macht und Initialisieren der Wandler (30 MHz), um die neue Studie einzurichten.</li>
	</ol></li> <li>Betäuben die Maus in eine Induktion-Kammer mit 3-4 % Isofluran in 100 % Sauerstoff mit einer Rate von 0,2 - 0,5 L/min pflegen das Tier für das gesamte Verfahren mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff über eine Nase Kegel. Richtige Anesthetization vor der Durchführung der Bildgebung zu bestätigen durch Kneifen der Zehs, Rollen Sie die Maus, und ohne Bewegung zu beobachten. 
	Hinweis: Ophthalmologische Salbe sollte auf die Augen nach der Induktion der Anästhesie, Hornhaut Trocknung zu verhindern angewendet werden. Die narkotisierten Mäuse zum Übertragen der bildgebenden Maschinen (z. B. Biolumineszenz Abbildungssystem und Ultraschall), wo erhalten sie eine Erhaltungsdosis von Narkosemittel Isofluran Bestimmen Sie die Narkose Startzeit und die Tiefe der Narkose durch die Beobachtung eines Mangels an Reaktion auf Prisen an der Rute und Fuß pad alle 10 Minuten für die gesamte Dauer der Narkose.</li>
	<li>Stellen Sie die Temperatur des bildgebenden Tisch und Ultraschall-Gels auf 37 ° c</li>
	<li>Vollständig zu entfernen das Fell über den Thorax-Bereich der narkotisierten Maus mit Enthaarungscreme.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf den bildgebenden Tisch in Rückenlage und sichern Sie die oberen und unteren Gliedmaßen mit Klebeband an die Bewegung des Körpers während des Verfahrens zu vermeiden. Verwenden Sie einen EKG-Monitor während des Verfahrens für alle Mäuse.</li>
	<li>Die Haut von den Thorax-Bereich mit einem 10 % Povidon/Jod Tupfer, gefolgt von einem 70 % Ethanol Tupfer reinigen. Auftragen des Gels auf den Thorax-Bereich der Maus.</li>
	<li>Die Wandler in den Halter montieren und stellen Sie seine Position, bis der linke Ventrikel gut sichtbar auf das Sichtfeld ist.</li>
	<li>Last 150 µL Zellsuspension ausgestrahlt Stammzellenreserve (2 x 10 6 hMSCs in 150 µL steriler PBS) in einer 1-mL-Spritze mit einem 28-G Nadel und Spritze an den entsprechenden Halter zu sichern. Um pulsierende Blut zu visualisieren, halten Sie eine kleine Luftsäule in die Spritze. Um Klumpenbildung zu vermeiden, die Zellen vor der Injektion auszusetzen.</li>
	<li>Fördern die Spritze in Richtung Maus Thorax, passen Sie die Nadel Flugbahn mit Hilfe der Ultraschallkontrolle, und geben Sie die linke Herzkammer.</li>
	<li>Anschluss an die Führung der Ultraschall-Bildgebung die Spritzennadel durch den Intercostalneuralgie Raum und in den linken Ventrikel der Maus durchdringen. 
	Hinweis: Die Spitze der Spritze Nadel sollte in der linken Herzkammer auf die ultrasonographische Bild deutlich sichtbar sein. Richtige Platzierung sollte durch frisches arterielles Blut Abfluss in die Spritze bestätigt werden. Dies sind Anzeichen für eine erfolgreiche Eingliederung.</li>
	<li>Spritzen Stammzellenreserve Zellsuspension sehr langsam über 2 min, sanfte Pre anwendenSsure.</li>
	<li>Im Anschluss an die Injektion von suspendierten Zellen vorsichtig ziehen Sie die Nadel heraus, sauber aus dem Ultraschallgel, und lassen Sie die Maustaste von der Band fesseln.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in einen neuen, sauberen Käfig mit einem vorgeheizten Pad. 
	Hinweis: Nach Abschluss des Verfahrens, eine warme Umgebung den Mäusen bis zur Genesung vorzusehen. Überhitzung sollte vermieden werden, da periphere Vasodilatation den Aufschwung gefährdet. Die Mäuse sollten engmaschig überwacht und von anderen Mäusen bis zu ihrer vollständigen Genesung, gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen isoliert gehalten.</li>
	<li>Das Tier zu überwachen, bis sie vollständige Wiederherstellung aus der Narkose und täglich bis zum Ende des Experiments erreichen.</li>
</ol> 3. Biolumineszenz (BLI) Darstellung der hMSCs <ol><li>Bild die Mäuse 24 h nach der intrakardialen Injektion in die Biolumineszenz imaging-System. Starten Sie den in-Vivo imaging-Software. Initialisieren Sie das Abbildungssystem zu und öffnen Sie eine neue Studie.
	<ol><li>In der Systemsteuerung parametrisieren Bildgebung durch Klicken auf &#34; Sequenz Setup. &#34; im imaging-Modus wählen Sie &#34; Lumineszenz &#34; und &#34; Foto. &#34; legen Sie die Belichtungszeiten von 0,5 s bis 10 min. soll das binning &#34; Medium &#34; und die F / Stop, &#34; 1. &#34; stellen die Erregung Filter auf &#34; Block &#34; und der Emission Filter &#34; offen. &#34; soll das Sichtfeld &#34; C &#34; für zwei Mäuse. Bild-Assistenten das Sequenz-Setup hinzufügen, indem Sie auf den Erwerb der Systemsteuerung.</li>
	</ol></li> <li>Schalten Sie die Sauerstoff-Pumpe und die Isofluran auf 2,5 % in der Induktion-Kammer und die Bugnase im Inneren der Maschine.</li>
	<li>Spritzen die Maus i.p mit 300 µL D-Luciferin (12,5 mg/mL).</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in der Anästhesie-Induktion-Kammer.
	<ol><li>Nach 2-3 min, übertragen Sie die Maus in der in-Vivo imaging-Kammer, mit seinem Kopf in die Bugnase auf dem Anästhesie-Verteiler. Wenden Sie optische Salbe zum Schutz der Augen während der Bildgebung an. Um mehrere Mäuse Bild, Schwarzlicht Schallwand verwenden, um zu verhindern, dass die Reflexion des Lichtes auf angrenzenden Mäuse.</li>
	</ol></li> <li>Klicken Sie auf die &#34; erwerben &#34; Taste, um die Bildaufnahme 10 min nach der Injektion von D-Luciferin.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.5 um mehr Mäuse Bild.</li>
	<li>Nach der Bildaufnahme in Vivo einschläfern die Mäuse durch CO 2 einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation, um Tod zu bestätigen. Durchzuführen Sie die ex-Vivo-Analyse.
	<ol><li>Wenn die ex-Vivo-Analyse nach 20 min durchgeführt wird, wiederholen Sie die Luciferin Injektion (Schritt 3.3) vor Einbußen bei den Mäusen; das BLI-Signal kann 20 Minuten nach der Injektion von Luciferin zu verringern.</li>
	</ol></li> <li>Sezieren die Mäuse um die gesamte Magen-Darmtrakt (d. h. aus dem Magen, Enddarm), mesenterialen Lymphknoten (MLN), Lunge, Milz und Leber entfernen. Legen Sie sie in Petrischalen mit Zange und Schere 2 , 4.</li>
	<li>Legen Sie die Petrischale mit der explantierten Organe in der bildgebenden Kammer und BLI Bilder pro Schritte 3.1-3.6.</li>
	<li>Nach der Bildaufnahme der explantierten Organe auf Probe Formen mit optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung übertragen. Cryofreeze die Formen bei-80 ° C mit Trockeneis. Führen Sie Immunohistochemistry mit Anti-Luciferase Antikörper auf Gefrierschnitte um zu bestätigen das Vorhandensein von hMSCs 16.</li>
	<li>Für die Quantifizierung der Lichtintensität, verwenden die Region von Interesse (ROI) Werkzeug in der Tool-Palette 16 , 19. Wählen Sie den ROI-Rahmen und verschieben sie dieses Interesse auf das Bild. Klicken Sie &#34; ROI Messung &#34; und sichern Sie die Daten in SEQ-Datei-Format. Exportieren Sie die Daten als txt-Datei und Statistik-Software verwenden, um grundlegende statistische Tests für Quantifizierung 16 durchzuführen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Studie beschreibt eine neue Technik für die Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion von hMSCs in einem kleinen Darm Mausmodell der experimentellen CD. Diese Technik hat sehr hohe Rate des Überlebens und Erfolg, da die Flugbahn der Nadel basierend auf Echtzeit-, hochauflösende Bilder des linken Ventrikels Maus, bereitgestellt durch den Ultraschall angepasst werden kann. Der Vorteil der Lieferung an die linke Herzkammer ist, dass hMSCs dann Intra arterially verteilt und venösen Kreislauf, wodurch die Aggregation...

Morbus Crohn (CD) ist eine häufig chronisch-entzündliche Erkrankung des dünn- und Dickdarm und wird gedacht, um daraus eine unangemessene Reaktion des Immunsystems Host auf Darm Mikroben7,8. Jüngste Studien haben gezeigt, dass sowohl menschliche als auch murinen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) Entzündung Mausmodellen Darmentzündung1,3,4,5unterdrücken können. Es gibt mehrere laufende klinische Studien, mit denen menschliche MSCs abgeleitet aus Knochenmark oder Fettgewebe zur Behandlung von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), die CD9umfasst. Zwei Routen für MSC-Therapie in diesen klinischen Studien verwendet wurden: eine beinhaltet die systemische Infusion (z.B. intravenös) von MSCs luminalen IBD (inkl. CD), und der andere umfasst die lokalisierte Anwendung/Injektion von Stammzellen in die Fistel von Patienten mit perianale CD-Darm-Trakt. In einer aktuellen Meta-Analyse der MSC-Therapie für IBD, systemische (z.B. intravenös) MSC Therapie für luminalen IBD (inkl. CD) war wirksam in bis zu 40 % (95 % CI: 7-79 %) der Patienten, während die Wirksamkeit viel höher, bei 61 war % (95 % CI: 36-85 %), wenn die MSCs die erkrankten CD Fistel9wurden lokal injiziert werden. Eine jüngste Phase-III-Multicenter randomisierte Placebo-kontrollierte Studie von allogenen Fettgewebe Stammzellen direkt in die perianale Fistel CD Patienten statistisch signifikante klinische und radiologische Anzeichen von perianale Fisteln heilen injiziert, die Ergebnisse der Meta-Analyse10erhärten. Die Gründe für die geringe Wirksamkeit der MSC Therapie intravenös für luminalen CD wurde nicht ausreichend untersucht, aber möglicherweise ein Grund der unzureichenden Homing von MSCs an den Ort der Entzündung. Modelle von Kolon Entzündung murine Studien haben gezeigt, dass nur ein kleiner Prozentsatz der MSCs (1-5 %) intravenös injiziert erreichen den entzündeten Darm; die restlichen MSCs durch die Lungen (First-Pass-Effekt)1,2 gefiltert werden ,5,11,12. Mehreren murinen Studien haben daher die intraperitoneale Route (i.p.) für MSC Verwaltung in Tiermodellen der Kolitis4verwendet. Sie haben jedoch auch gezeigt, dass nur ein kleiner Bruchteil der Zellen zu erreichen und weiterhin den Doppelpunkt und, dass die Wirksamkeit auf die Sekretion von löslichen parakrine Faktoren wie Tumor-Nekrose-Faktor-induzierbaren Gen 6 Protein (TSG-6)2. Der MSC-Mechanismus der Immunsuppression und Heilung beinhaltet einen mehrgleisige Ansatz, parakrine; Zelle Nähe-unabhängige Faktoren wie TSG-6; und Zell-Nähe-abhängige Faktoren wie programmiert Tod-Liganden 1 (PD-L1); oder gezackt 1. Daher kann erhöhte Wirksamkeit9,13MSC Lokalisierung auf der Website der Entzündung führen. In der Tat zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass MSCs direkt auf dem Gelände des Kolon Verletzungen implantiert Heilung durch Sekretion Förderung der Angiogenese vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) führte. Auf der anderen Seite wurde eine minimale heilende Wirkung nach intravenöser Injektion5festgestellt. Um ihre Lokalisierung auf der Website der Entzündung (d. h. den Dünndarm in SAMP Mäuse) zu erhöhen, wurde diese Ultraschall-geführte intrakardialen Injektionstechnik für MSC-Verwaltung in die linke Herzkammer entwickelt. Bildgestützte Einspritzung sorgt für eine präzise Einspritzung, die führt zu einer höheren Erfolgsquote und sank auf Morbidität und Sterblichkeit. Darüber hinaus liefert sie die Injektion von MSCs in die linke Herzkammer an arteriellen Kreislauf, wo sie die entzündeten Dünndarm erreichen kann, bevor er gefangen in der Lunge.
In dieser Studie wurden menschliche Knochenmark stammenden MSCs (hMSCs) für die Injektion in die SAMP-1/YitFc (SAMP) Mausmodell CD14verwendet. SAMP ist ein gut charakterisierten spontane Mausmodell der chronischen Entzündung, der klein-Darm-Entzündung mit fast 100 % Penetranz14entwickelt. Die Entzündung entwickelt sich in Reaktion auf die Mikroflora in Ermangelung jeglicher chemischen, immunologischen oder genetische Manipulation und ähnelt menschlichen CD11. Geschlecht und Alter abgestimmt Entzündung-freie AKR/J (AKR) Mäuse, die Kindersicherung Mäuse von SAMP, wurden in dieser Studie verwendet.
Die hMSCs wurden isoliert und im Labor aus dem Knochenmark (BM) Proben aus normalen, nicht identifizierte Spender nach Einwilligung validiert und zuvor Protokolle15,16 veröffentlichtenerweitert. Nach der Isolierung und Expansion, die MSC-Fähigkeit in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Differenzierung wurde durch mehrere Tests15im Labor ausgewertet. Osteogene funktionelle Assays erfolgte durch Implantation von keramischen Würfel von Hydroxylapatit/Tricalcium-Phosphat-Matrix mit hMSCs subkutan in immungeschwächten CB17-Prkdc SCID Mäuse17. Der Cube-Test weist Osteogenesis und werden potenzielle und gilt als den ultimativen Test für die Bewertung der einzelnen MSC Vorbereitungen17. Um hMSCs in Vivo nach der Injektion zu visualisieren, wurde Lentivirus verwendet, um hMSCs mit dreifach Reporter Genkonstrukt transduzieren, der Firefly Luciferase (fl), Monomeren rot fluoreszierenden Proteins (mRFP) und Herpes-Simplex-Virus Thymidin-Kinase (Ttk besteht ), angetrieben durch eine modifizierte myeloproliferative Sarkom-Virus (Mnd) Projektträger18. Die Firefly Luciferase in der dreifachen Reporter ist ein Enzym, dass Coverts injizierten Luciferin zu Oxyluciferin in hMSCs und Photonen/Weißlicht erzeugt. Dies wird durch die sensible – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera (Biolumineszenz) in einem in Vivo optical imaging-System, ermöglicht die Visualisierung von live hMSCs bei Mäusen erkannt. Biolumineszenz imaging (BLI) ist eine sensible Technik, die serienmäßig für die Verfolgung von Zellen und für die ex-Vivo -Analyse verwendet werden kann. Die Verwendung eines starken Mnd-Promotors treibt den kontinuierlichen Ausdruck das Genkonstrukt triple Fusion Reporter und ermöglicht die Darstellung der injizierten hMSCs für mehr als 16 Wochen19. Die hMSCs sind schwer zu transduzieren und haben einen niedrigen Transduktion Wirkungsgrad. Mit einer optimierten Protokoll, hMSCs Transduktion Effizienz verbessert und die Expression des Transgens verbesserte18war. Mit mRFP Ausdruck (eines der drei Reporter Gene) auf Durchflusszytometrie, zeigte sich die Möglichkeit, hMSCs mit einem hohen Wirkungsgrad von bis zu 83 % transduzieren. Differenzierung-Assays und in Vivo Cube Assays zeigte die Fähigkeit von transduced hMSCs in Chondrozyten, Adipozyten und Osteozyten17zu unterscheiden.

<table><tbody><tr><td>DMEM-LG&nbsp; &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31600-091</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Proteaminsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Goldbio</td><td>luck-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>175 cm Tissue-Cutlure-Kolben</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>75 cm Tissue-Cutlure-Kolben</td><td>Corning</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Crysalgen</td><td>23-2265</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold Standard</td><td>Tissue-Tek&nbsp;</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-Pac HIV-Expressionsverpackungssystem</td><td>GeneCopoeia</td><td>HPK-LvTR-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Povidon Ionidin Tupfer</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran &nbsp;</td><td>Piramal Helathcare&nbsp;</td><td>NDC 66794 013 25</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschere (Wagner)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Tierarztsalbe</td><td>Puralube</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 100 Ultraschall-Transmissionsgel</td><td>Parker Laboratories</td><td>01 08</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>SAMP Mäuse</td><td>Cleveland Digestive Disease Research Core Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKR-Mäuse</td><td>Cleveland Digestive Disease Research Core Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 Bildgebungssystem</td><td>&nbsp; Visual Sonics, Toronto, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; System der IVIS-Spektrum-Serie&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software für lebende Bilder&nbsp;</td><td>CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dreifacher Reporter</td><td>Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Zheng-Hong Lee, CWRU, (Zitat 19)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ultraschall-geführte intrakardiale injektion humaner mesenchymaler stammzellen homing in den darm zur verwendung in murinen modellen von experimentellen entzündlichen darmerkrankungen erhöhen

Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases

Morbus Crohn (CD) ist eine häufig chronisch-entzündliche Erkrankung des dünn- und Dickdarm. Murinen und menschlichen mesenchymaler Stammzellen (MSCs) immunsuppressive Potential haben und haben gezeigt, dass unterdrücken Entzündung Mausmodellen der Darmentzündung, obwohl die Art der Verabreichung ihre Homing und Wirksamkeit 1 einschränken können , 3 , 4 , 5. lokale Anwendung von MSCs Kolon Verletzungen Modelle hat höhere Wirksamkeit bei Entzündungen im Dickdarm bessernde gezeigt. Allerdings gibt es Mangel an Daten über Techniken, um die Lokalisierung von menschlichen Knochenmark stammenden MSCs (hMSCs) in den Dünndarm, Entzündungsherd im SAMP-1/YitFc (SAMP) Modell der experimentellen Morbus Crohn zu verbessern. Diese Arbeit beschreibt eine neue Technik für die Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion von hMSCs bei Mäusen SAMP gut charakterisierten spontane Modellcharakter für die chronische Darmentzündung. Geschlecht und Alter-abgestimmt, Entzündungen-freie AKR/J (AKR) Mäuse dienten als Kontrollen. Um die Bioverteilung und die Lokalisierung zu analysieren, wurden hMSCs mit einen Lentivirus mit einem dreifachen Reporter ausgestrahlt. Die dreifache Reporter bestand aus Firefly Luciferase (fl), für die Biolumineszenz Bildgebung; Monomeren rot fluoreszierenden Proteins (Mrfp), für die Zelle Sortierung; und imaging-abgeschnittene Herpes-Simplex-Virus-Thymidin-Kinase (Ttk), für Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass 24 h nach der intrakardialen Verabreichung hMSCs im Dünndarm von SAMP Mäusen im Gegensatz zu Entzündungen-freie AKR Mäuse zu lokalisieren. Dieser Roman, Ultraschall-gesteuerte Injektion von hMSCs in der linken Herzkammer von SAMP Mäusen sorgt für eine hohe Erfolgsquote bei der Zelle Lieferung, so dass für die rasche Erholung von Mäusen mit minimalen Morbidität und Mortalität. Diese Technik könnte eine nützliche Methode für die verbesserte Lokalisierung von MSCs in anderen Modellen von klein-Darm-Entzündung, z. B. TNFΔRE6. Zukünftige Studien bestimmt, ob die erhöhte Lokalisierung des hMSCs durch die intra-arterielle Lieferung zu erhöhten therapeutische Wirksamkeit führen kann.

Abbildung 1 zeigt, dass hMSCs mit dem dreifachen Reporter bei einem hohen Wirkungsgrad, bewahren ihre Stammzellen Eigenschaften ausgestrahlt werden können. Ausgestrahlt hMSCs kann in Echtzeit durch BLI (Abbildung 1, Abbildung 3) visualisiert werden. Dieser Roman, Ultraschall-gesteuerte Injektion von hMSCs in den linken Ventrikel SAMP Mäuse sorgt für eine sehr hohe Erfolgsquote bei der Injektion, so d...

Modelle von Kolon Entzündung murine Studien haben gezeigt, dass ein kleiner Prozentsatz (1-5 %) von mesenchymalen Stammzellen (MSC) intravenös injiziert oder intraperitoneal beherbergt die entzündeten Darm1,2. Diese Studie zeigt, dass Ultraschall-geführte intrakardiale Injektionen von MSCs erhöhte Lokalisierung in den Darm führen.

Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion humaner mesenchymaler Stammzellen Homing in den Darm zur Verwendung in murinen Modellen von experimentellen entzündlichen Darmerkrankungen erhöhen

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Ultraschall-gesteuerte intrakardiale Injektion menschlicher, aus dem Knochenmark stammender mesenchymaler Stammzellen oder HMSC in einem Mausmodell der experimentellen Morbus Crohn durchzuführen, um die Homing-Bewegung der HMSC in den Darm zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der entzündlichen Darmerkrankungen zu beantworten, insbesondere hinsichtlich des Bedarfs an einer erhöhten Lokalisation von HMSC im Dünndarm während einer Entzündung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine hohe Erfolgsrate bei der HMSC-Abgabe ermöglicht, bei gleichzeitig minimaler Bewegungseinschränkung der Maus und geringer Mortalität.Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da mehrere Variablen das Verfahrensergebnis beeinflussen können. Dies erfordert ein tiefes Verständnis der Biologie menschlicher mesenchymaler Stammzellen seitens der Auszubildenden. Die Verfahren wird Paola Menghini, eine Postdoktorandin aus unserem Labor, demonstrieren.Richten Sie in einer spezifisch pathogenfreien Anlage den Protokollablauf für die Ultraschallbildgebung des Maus-Echokardiogramms ein und initialisieren Sie den 30-Megahertz-Wandler. Überprüfen Sie anschließend den angemessenen Sedierungsgrad durch Zehenquetschung und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Entfernen Sie mit einer Enthaarungscreme die Behaarung über dem Thorax und platzieren Sie das Tier in Rückenlage auf dem 37-Grad-Celsius-Bildgebungstisch.Befestigen Sie die Gliedmaßen mit Klebeband, um Bewegungen während des Eingriffs zu verhindern, und desinfizieren Sie die freiliegende Haut des Thorax mit 10 % Povidon-Iod und 70 % Ethanol. Tragen Sie eine dicke Schicht Ultraschallgel mit einer Temperatur von 37 Grad Celsius auf die Haut auf und befestigen Sie den Schallkopf in der Halterung. Verstellen Sie die Position des Schallkopfs, bis die linke Herzkammer im Sichtfeld deutlich sichtbar ist. Suspendieren Sie anschließend vorsichtig 2 × 10⁶ transduzierte humane mesenchymale Stammzellen in 150 Mikroliter steriler PBS, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, und füllen Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 28-Gauge-Nadel ausgestattet ist.Injizieren Sie weniger als 150 Mikroliter Zellsuspension pro Maus, um eine Volumenbelastung und den Tod zu vermeiden. Befestigen Sie die Spritze in einem Spritzenhalter. Bewegen Sie dann die Spritze unter Ultraschallführung auf den Brustkorb der Maus zu, passen Sie die Nadelbahn bei Bedarf an und führen Sie die Nadelspitze durch den Interkostalraum in das linke Ventrikel ein.Eine ausreichende Sichtbarmachung der Nadel im sonografischen Bild ist entscheidend, um eine korrekte Bahnführung und Einführung der Nadel in den linken Ventrikel sicherzustellen, eine erfolgreiche Injektion zu gewährleisten und eine kardiale Dämpfung sowie den Tod zu vermeiden. Die Nadelspitze sollte deutlich innerhalb des linken Ventrikels sichtbar sein, und die korrekte Platzierung kann zusätzlich durch den Austritt frischen arteriellen Blutes in die Spritze bestätigt werden. Üben Sie sanften Druck auf den Kolben aus, um die HMSC-Suspension über einen Zeitraum von zwei Minuten langsam zu injizieren.Wenn alle Zellen injiziert wurden, die Nadel vorsichtig zurückziehen und das Tier in einen sauberen Käfig auf eine vorgewärmte Unterlage bringen und bis zur vollständigen Genesung überwachen. 24 Stunden nach der Injektion das Biolumineszenz-Bildgebungssystem initialisieren und eine neue Studie in der In-vivo-Bildgebungssoftware öffnen. Um die Bildgebungsparameter im Steuerfeld einzustellen, auf die Sequenzeinrichtung klicken.Wählen Sie im Bildmodus Lumineszenz und Fotografie aus. Stellen Sie die Belichtungszeiten von 0,5 Sekunden bis 10 Minuten ein, die Binning-Stufe auf mittel und die Blende auf eins. Stellen Sie den Anregungsfilter auf blockieren, den Emissionsfilter auf offen und das Sichtfeld so ein, dass zwei Mäuse sichtbar sind.Klicken Sie dann auf das Erfassungssteuerfeld, um den Sequenzsatz dem Bild-Assistenten hinzuzufügen. Injizieren Sie anschließend die erste Maus mit 300 Mikrolitern D-Luciferin. Tragen Sie Salbe auf die Augen der Tiere auf und bringen Sie die Maus in die In-vivo-Bildgebungskammer.10 Minuten nach der Injektion von d-Luciferin auf „Erfassen“ klicken, um die Bildaufnahme zu starten. Nachdem alle Mäuse abgebildet wurden, das gesamte Magen-Darm-Trakt, die mesenterialen Lymphknoten, Lungen, Milz und Leber von jedem Tier entnehmen. Anschließend die Organe wie zuvor gezeigt abbilden, für die Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung.HMSC können mit dem dreifachen Reporter hochgradig effizient transduziert werden, wodurch die Stammzell-Eigenschaften erhalten bleiben und eine Echtzeit-Visualisierung mittels Biolumineszenz-Bildgebung ermöglicht wird. Die ex vivo-Analyse der intrakardial verabreichten Stammzellen bestätigt, dass dieser Verabreichungsweg die Homing von HMSC in den entzündeten Dünndarm der experimentellen Crohn-Krankheit-Mäuse fördert. HMSC, die in kontrollierte, entzündungsfreie Tiere injiziert werden, sammeln sich hingegen nicht im Dünndarm an.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als 15 Minuten pro Maus abgeschlossen werden. Während des Vorgehens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, das Ultraschallbild zur Anpassung der Nadeltrajektorie zu verwenden. Eine schlechte Technik und eine falsche Trajektorie können zu einem hämorrhagischen Perikarderguss mit kardialem Tamponade und letztlich zum Tod führen.Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Histologie und 3D-Mikroskopie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob eine erhöhte Homing von HMSCs in den Dünndarm deren therapeutische Wirksamkeit verstärkt. Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der experimentellen chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), alle ihre Mausmodelle wie die TNF-Trajektorie zu untersuchen, die mit HMSCs injiziert werden können, um das Homing in den Dünndarm zu verbessern. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine ultraschallgeführte intrakardiale Injektion von HMSCs bei Mäusen durchführt und wie man die biolumineszenzgestützte Bildgebung verwendet, um eine unzureichende Verteilung und das Homing zu analysieren.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen MSCs gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einer Gesichtsmaske mit Schild getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Ultraschall-geführte intrakardiale Injektion humaner mesenchymaler Stammzellen Homing in den Darm zur Verwendung in murinen Modellen von experimentellen entzündlichen Darmerkrankungen erhöhen (Video) | JoVE Journal

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