3.6: Zytogenetik

Zytogenetik ist die Lehre von der Struktur und den Eigenschaften von Chromosomen sowie von ihrem Verhalten während der Zellteilung und ihrer Rolle bei der Vererbung. Ein Chromosom, das ein Molekül der DNA und der zugehörigen Proteine ist, kann mit Hilfe von Farbstoffen und Sonden unter dem Mikroskop betrachtet werden. Solche Beobachtungen sind ein leistungsfähiger Ansatz zur Erkennung von Defekten in der Chromosomenstruktur und -anzahl, die oft mit Krankheiten und Störungen in Verbindung gebracht werden.

In diesem Video werden die Prinzipien der Zytogenetik, ein Protokoll für eine weit verbreitete Technik zur Hervorhebung spezifischer Chromosomenmerkmale, die als Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung bekannt ist, und einige Anwendungen dieser Technik behandelt.

Beginnen wir mit der Diskussion über die Bedeutung der Zytogenetik und die Prinzipien hinter einigen klassischen und modernen Techniken auf diesem Gebiet.

Unter der Zytogenetik versteht man die direkte Beobachtung der Chromosomenstruktur und -zahl einer Zelle, die als "Karyotyp" bezeichnet wird. Es kann verwendet werden, um Abweichungen von der normalen diploiden oder gepaarten Chromosomenzahl, die als Aneuploidie bezeichnet wird, sowie Defekte in der Chromosomenstruktur zu erkennen.

Viele Krankheiten und Störungen resultieren aus Chromosomenanomalien. So ist beispielsweise das Philadelphia-Chromosom, das aus einer reziproken Translokation zwischen Teilen der Chromosomen 9 und 22 resultiert, mit chronischer myeloischer Leukämie assoziiert. Ein weiteres Beispiel ist die Trisomie 21, die häufigste Ursache des Down-Syndroms, bei der eine zusätzliche Kopie des Chromosoms 21 vererbt wird.

Die Karyotypisierung wird in der Regel an Zellen durchgeführt, die sich auf die Teilung vorbereiten, wenn ihre Chromosomen kondensiert sind und leicht unterschieden werden können.

Chromosomen in einem Karyotyp können mit Flecken behandelt werden, die charakteristische Bandenmuster aufweisen. Gefärbte Chromosomen können dann für die Karyotyp-Analyse nach Größe und Form angeordnet werden. Es können verschiedene Farbstoffe verwendet werden, um spezifische chromosomale Merkmale hervorzuheben. Die Färbung mit Giemsa oder G-Banding markiert dicht gepackte, meist genarme Regionen, die reich an A-T-Basen sind. R-Banding ist eine umgekehrte Giemsa-Färbung, die chromosomale Regionen hervorhebt, die reich an G-C-Basen sind. Bei der C-Bandierung werden die dichtesten Chromosomenregionen um das Zentromer herum hervorgehoben, die Struktur, die die identischen Hälften eines duplizierten Chromosoms verbindet, während bei der T-Bande die Enden der Chromosomen oder Telomere hervorgehoben werden.

Eine andere Technik, die sogenannte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung oder FISH, ermöglicht den Nachweis spezifischer Chromosomen, DNA-Regionen oder RNA-Transkripte. Dies wird erreicht, indem eine Probe mit hochspezifischen Oligonukleotidsonden inkubiert wird, die fluoreszenzmarkiert sind. Da diese Sonden mit unkondensierten Chromosomen in sich nicht teilenden Zellen hybridisiert werden können, kann FISH breiter eingesetzt werden als klassische Karyotypisierungsmethoden.

Schließlich haben die Forscher auch eine Methode namens vergleichende genomische Hybridisierung entwickelt, um nach fehlenden oder doppelten Chromosomenregionen zu suchen. Genomische DNA von einem Test- und Kontrollsubjekt wird isoliert, fragmentiert und mit verschiedenfarbigen Fluorophoren markiert. Die fragmentierten genomischen Präparate werden dann gemischt und kompetitiv hybridisiert, um eine normale Chromosomenausbreitung zu erreichen. Farben auf dem resultierenden Karyotyp zeigen an, ob eine Region in der Testprobe dupliziert wird, wodurch mehr Fragmente zur Bindung der Ausbreitung erzeugt werden, oder ob die Region gelöscht wird, was zu einer bevorzugten Bindung an die häufiger vorkommenden Kontrollfragmente führt.

Nachdem Sie nun die Prinzipien der Zytogenetik verstanden haben, lassen Sie uns sie in die Praxis umsetzen und einen genaueren Blick darauf werfen, wie FISH durchgeführt wird.

Zunächst werden isolierte Gewebe oder Zellen mit einem Fixiermittel wie Paraformaldehyd behandelt, um die Chromosomenmorphologie und -integrität zu erhalten. Als nächstes wird eine Chromosomenspreizung vorbereitet, zum Beispiel durch mechanisches Aufbrechen des Materials. Die Chromosomen werden dann in einer Lösungsreihe mit steigenden Ethanolkonzentrationen dehydriert und in einer Pepsinlösung permeabilisiert, um die Zielsequenzen für die Sonden leichter zugänglich zu machen. Die Chromosomen werden dann gewaschen und mit einem Postfix stabilisiert, mit Formamid denaturiert, damit die nun einzelsträngige DNA die Sonden binden kann, und in einer zweiten Serie von zunehmend konzentrierten Ethanollösungen dehydriert.

Fluoreszenzmarkierte, hochspezifische DNA-Sonden werden präpariert und mit unmarkierten, sich wiederholenden DNA-Fragmenten gemischt, um eine unspezifische Bindung zu blockieren. Die Sonde wird dann auf die Chromosomenspreizung aufgebracht, wo sie mit ihrer Zielsequenz hybridisiert, und die ungebundene Sonde wird mit einer Reihe von Waschvorgängen entfernt.

Schließlich werden die Chromosomen in ein Medium eingebaut, das die Probe konserviert und eine allgemeine DNA-Gegenfärbung enthält, wie z. B. DAPI, die die genomische Hintergrund-DNA markiert, und ein Deckglas wird aufgebracht. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop mit den entsprechenden Filtersets betrachtet werden, um genomische DNA und sequenzspezifische Merkmale sichtbar zu machen.

Nachdem wir gesehen haben, wie FISH durchgeführt wird, schauen wir uns einige Anwendungen dieser leistungsstarken Technik an.

FISH kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass der Karyotyp eines Embryos vor der Implantation normal ist. Hier wurde drei Tage nach der Befruchtung eine einzelne Zelle, ein sogenanntes Blastomer, von einem Embryo biopsiert, dann lysiert und direkt auf einem Objektträger fixiert. Die Chromosomenausbreitung wurde dann mit Sonden hybridisiert, die speziell ausgewählt wurden, um potenzielle Chromosomenstörungen zu identifizieren. In diesem Fall deuten Abweichungen vom erwarteten Muster der Hybridisierungssignale auf Störungen in der Chromosomenzahl oder -struktur hin.

Es wurden auch innovative Techniken entwickelt, um alle Chromosomen aus einer einzigen biologischen Probe zu markieren. Eine dieser Methoden ist das Octochrome-Gerät, ein achtzelliger Objektträger, der mit Fluoreszenzsonden vorgeladen ist. Alle 22 nicht geschlechtsbestimmenden Chromosomen, sogenannte Autosomen, und die beiden Geschlechtschromosomen wurden markiert, indem sie auf die acht Fenster verteilt wurden, die jeweils drei chromosomenspezifische Fluorophore enthielten. Dies ermöglichte das gleichzeitige Screening aller Chromosomen einer einzigen Hybridisierung.

Anstatt die Sonden in verschiedene Fenster auf einem Objektträger zu unterteilen, können alle Chromosomen markiert und dann zusammen mit einem Ansatz namens spektrale Karyotypisierung oder SKY nachgewiesen werden. Mehrere chromosomenspezifische Sonden mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen wurden mit jedem Chromosom hybridisiert, wodurch jedes Chromosom eine einzigartige Spektralfarbe erhielt. Gleichzeitige Beobachtungen der kombinierten Chromosomenmischung sind besonders nützlich für die Identifizierung von Karyotypdefekten und können zur Identifizierung von Aneuploidie sowie chromosomalen Deletionen und Translokationen verwendet werden.

Sie haben gerade das Video von JoVE über Zytogenetik gesehen. In diesem Video haben Sie die Prinzipien der Zytogenetik, Techniken wie Karyotypisierung und FISH, die zur Hervorhebung spezifischer Chromosomenmerkmale verwendet werden, und die Anwendungen dieser Techniken kennengelernt. Die jüngsten Fortschritte in der Zytogenetik haben ihre Fähigkeiten in Forschungs- und Pathologielabors gleichermaßen erhöht, und sie werden auch weiterhin an der Spitze der Krankheitsforschung und -diagnostik breite Anwendung finden. Danke fürs Zuschauen!