Expressions-Profiling mit Microarrays

DNA-Microarrays sind weit verbreitete Werkzeuge, um den Ausdruck von vielen verschiedenen Genen gleichzeitig zu messen. Sie bestehen aus Tausenden von Sonden – jeweils ein anderes gen — immobilisiert auf "chips" oder Folien, und verlassen Sie sich auf komplementäre Hybridisierung, Genexpression in verschiedenen biologischen Bedingungen zu bewerten.

Dieses Video wird die grundlegenden Prinzipien der Microarray-Technologie, ein Protokoll für die gen-Expression profiling mit Microarrays und einige aktuelle Anwendungen abdecken.

Beginnen wir mit die Grundsätzen der gen-Expression profiling und Microarray Technologie diskutieren.

Eine der frühesten Methoden entwickelt, um die Genexpression in biologischen Proben zu beurteilen ist Northern Blot, einhergehende "sondieren" für spezifische RNA-Moleküle auf Membranen immobilisiert. "Frei schwebenden" Sonden komplementäre RNA-Sequenzen in der Probe zu erkennen, und sind in der Regel mit radioaktiven oder fluoreszierende Moleküle gekennzeichnet, so dass sie visualisiert werden können.

Fortschritte in der Mikrofabrikation, die Sequenzierung des Genoms und andere Technologien führten zu die Entwicklung der Microarray-Biochips. Wie Nordflecken Microarrays basiert auf dem Prinzip der komplementären Bindung zwischen Sonde und Probe Nukleinsäuresequenzen. Im Gegensatz zu Hechten ist jedoch in Microarrays es Oligonukleotid Sonden, die auf einem Objektträger oder Chip immobilisiert sind. Die "schwebenden" Proben entstehen aus RNA isoliert von Zellen oder Organismen von Interesse, die umkehren transkribierten ergänzende oder "C"-DNA. Dies kann entweder direkt mit fluoreszierenden Molekülen beschriftet werden, oder deren Beträge können verstärkt durch in Vitro Transkription in cRNA. Die Probe wird dann mit dem Chip hybridisiert. Da Sonden auf Microarrays für verschiedene Anwendungen entwickelt werden "Sinn", was, dass ihre Sequenzen in die gleiche Richtung bedeutet wie eines Organismus RNA oder "Antisense" zum Ausdruck kommt entweder können, müssen Forscher sicherstellen, dass der Strang Direktionalität der Probe ergänzend zu den Sonden.

Die "rohen" Fluoreszenz Intensitätsdaten für jedes Gen-spezifischen Punkt auf dem Chip können dann quantifiziert und verarbeitet werden. Die Daten können für weitere statistische Tests, wie der Student t-Test, um festzustellen, ob die Fluoreszenz signalisiert unterzogen werden – und damit Ausdruck Levels – für ein Gen des Interesses unterscheiden sich deutlich zwischen zwei Zelltypen oder experimentellen Bedingungen.

Forscher können auch diese Daten "Cluster" oder Gruppe Gene basierend auf ähnliche Muster des Ausdrucks. Beispielsweise beim Vergleich von Expressionsmuster zwischen zwei Zellpopulationen bestimmter Gene Ausdruck Änderungen zeigen von etwa Äquivalenzbeträge in die gleiche Richtung gefunden werden können, und würde somit zusammengefasst werden. Forscher können diese Beziehungen in einem Baumdiagramm oder "Dendrogramm" wo, Höhen und Arrangements von "Zweige angeben" darstellen wie ähnlich — oder unähnlich — gen Expressionsmuster sind. Diese Art der Analyse bieten Einblick in Gen-Netzwerken, wie "gruppierten" Gene in der gleichen biologischen Bahnen beteiligen können.

Nun, da wir die Grundsätze der Microarray Methode besprochen haben, werfen wir einen Blick auf einen typischen Microarray Experiment.

Um die Qualität der isolierten RNA zu gewährleisten, Arbeitsbereiche und Ausrüstung behandelt werden mit Chemikalien, die RNases inaktivieren, Enzyme, die sonst RNA zerstören würde. Die RNA ist dann isoliert von Proben von Interesse und gereinigt, und seine Konzentration und Integrität werden bestimmt durch Spektralphotometrie.

Diese Probe RNA wird in cDNA, woraufhin cRNA konvertiert. Als nächstes die Probe mit fluoreszierenden Molekülen beschriftet und fragmentiert, und seine Qualität und Quantität kann erneut überprüft werden, zu welchem Zeitpunkt das Ausmaß der fluoreszierenden Kennzeichnung auch bewertet werden kann.

Die beschrifteten cRNA wird dann mit "Hybridisierung Lösung" vor dem Verladen auf einem Microarray gemischt. Um erfolgreiche Hybridisierung zu erleichtern, befindet sich ein "Mixer" auf dem Chip zu bilden "Hybridisierung Kammern." Die Hybridisierung Mischung wird dann langsam auf das Array hinzugefügt. Vorsicht ist geboten, um Luftblasen, zu vermeiden, da diese stören die Bindung der Probe auf bestimmte Regionen auf die Microarray und ein falsches negatives Signal führen können. Sobald die Probe hinzugefügt wird, werden Späne bei der entsprechenden Temperatur bis zu 24 Stunden inkubiert.

Nach Hybridisierung Mixer aus der Chip entfernt, ungebundenen Probe abgewaschen und das Array wird durch Zentrifugation in einer spezialisierten, Dia-Holding Zentrifuge getrocknet. Die getrockneten Chip in einem Microarray Scanner eingesetzt wird, und die Maschine ist so eingestellt, dass die hellsten Signale beobachtet auf einem Chip nicht übersättigt sind. Die Microarray wird dann gescannt, und ein Bild des gesamten Chips produziert.

Sobald der Chip gescannt wurde, wird die Bilddatei in Daten-Extraktion Software geladen und für Unregelmäßigkeiten Signal bewertet. Daten aus der Microarray-Bild ist eine Reihe von statistischen Manipulationen, einschließlich Log₂ Transformation, die erlaubt es den Forschern zahlenmäßig darzustellen Daten in Form von Falten erhöht oder verringert sich in der Genexpression ausgesetzt; sowie Normalisierung, das Signal Unterschiede zwischen Microarray Chips ausmacht. Diese Daten können verarbeitet dann weiter analysiert werden.

Nun, wir gezeigt haben, wie die Expression profiling mit Microarrays durchgeführt wird, schauen Sie wie Microarrays in bestimmten Experimenten verwendet werden kann.

Forscher setzen häufig Microarrays zu bewerten, wie gen-Expression in einen biologischen Prozess, wie zellulare Unterscheidung ändert. Hier beurteilt Wissenschaftler die Ebenen der Micro-RNAs, die 22-Nukleotid, die kleinen RNAs Feinabstimmung Genexpression in drei menschlichen Zelltypen aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien Netzhaut beteiligt. Durch den Vergleich MicroRNA Ausdruck zwischen diesen Zellen, konnten Forscher Netzhautgewebe Differenzierung und Entwicklung potenziell beteiligten Gene zu identifizieren.

Microarrays kann auch verwendet werden, Ausdruck Unterschiede zwischen verschiedenen Zellen oder Gewebetypen zu beurteilen. In diesem Experiment wurde ein Nagetier Modell der posttraumatischen Belastungsstörung oder PTSD, von Ratten Elektroschocks auszusetzen. Neuronen wurden von verschiedenen Gehirnregionen gesammelt und RNA isoliert. Microarrays wurden dann verwendet, um differentielle Expression der Mitochondrien-Assoziierte Gene in diese Neuronen zu identifizieren, Einblicke in die komplexen molekularen Mechanismen hinter PTSD.

Zu guter Letzt beantragen Forscher auch Microarrays Krebsstudien, in der Hoffnung, dass neue Krankheit bei Biomarker identifiziert werden können. Durch Infektionen durch Viren im Laufe unserer Evolution enthalten menschlichen Genom virale Gensequenzen, bezeichnet als "endogene Retroviren" oder ERVs, von denen einige noch aktiv zum Ausdruck kommen. Hier wurden die Expression von ERVs in Krebszellen und normalen Prostata Gewebe verglichen mit Microarrays. Diese Methode konnten Forscher lokalisieren mehrere ERVs wurden hochreguliert bei Prostatakrebs, so dass sie potenzielle Biomarker, die verwendet werden können, um Krankheiten zu diagnostizieren.

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