3: Analyse von DNA-Methylierung

DNA-Methylierung ist eine chemische Modifikation der DNA, die die Genexpression in verschiedenen zellulären Kontexten beeinflusst. Viele Forscher interessieren sich für den Mechanismus und die Funktionen dieses Prozesses, da eine aberrante DNA-Methylierung mit Krankheiten wie Krebs in Verbindung gebracht wird.

In diesem Video werden wir die Prinzipien der DNA-Methylierung und die Methoden zu ihrem Nachweis behandeln. Anschließend werden wir ein allgemeines Protokoll für eine dieser Methoden, die Bisulfitanalyse, und einige Anwendungen dieser Technik untersuchen.

Werfen wir zunächst einen Blick darauf, was DNA-Methylierung ist und wie sie nachgewiesen werden kann.

Während dieses biochemischen Prozesses fügt eine Zelle den Cytosinbasen in ihrer DNA eine chemische Markierung hinzu, die als Methylgruppe bekannt ist. Die meisten methylierten Cytosine kommen neben Guaninbasen im selben DNA-Strang vor, und diese benachbarten Nukleotide und die Phosphodiesterbindung, die sie verbindet, werden als "CpGs" bezeichnet. Obwohl die meisten Wirbeltier-CpGs methyliert sind, neigen diejenigen, die nicht methyliert sind, dazu, nahe beieinander in CpG-Inseln vorzukommen. in der Nähe der Promotoren aktiv exprimierter Gene und verschiedener anderer regulatorischer Sequenzelemente.

Wie Veränderungen in der DNA-Methylierung zur Genregulation beitragen, wird noch intensiv untersucht. Die Methylierung von CpG-Inseln scheint wichtig für das stabile, langfristige Gen-Silencing zu sein, das bei epigenetischen Prozessen wie der genomischen Prägung, bei der es sich um die spezifische Expression bestimmter Gene handelt, sowie der X-Chromosomen-Inaktivierung, der Stilllegung eines der beiden X-Chromosomen in jeder Zelle weiblicher Säugetiere, zu beobachten ist. Es hat sich auch gezeigt, dass die Unterdrückung kritischer Gene aufgrund der aberranten Methylierung von CpG-Inseln zu einem unkontrollierten Zellwachstum beiträgt, das zu Krebs führen kann. Mechanistisch gesehen kann die DNA-Methylierung zum Gen-Silencing beitragen, indem sie entweder verhindert, dass Transkriptionsfaktoren mit Promotoren assoziiert werden, oder indem sie Proteine rekrutiert, die Histone modifizieren und das Chromatin in einen transkriptionell nicht-permissiven Zustand umgestalten.

Es gibt verschiedene Methoden, um den Methylierungszustand der DNA nachzuweisen.

Eine Technik, der HELP-Assay, umfasst zwei Restriktionsendonukleasen namens HpaII und MspI, die jeweils nur unmethylierte bzw. sowohl methylierte als auch unmethylierte CCGG-Sequenzen spalten. Durch den Vergleich der Verdauungsmuster, die von diesen beiden Enzymen erzeugt werden, kann der Methylierungsstatus der DNA abgeleitet werden.

Eine andere Methode, die als methylierte DNA-Immunpräzipitation oder ? MeDIP,? verwendet Antikörper, die an methylierte Cytosine binden, um methylierte DNA-Sequenzen anzureichern.

Schließlich wird die Bisulfit-Analyse verwendet, um methyliertes von unmethyliertem Cytosin in der DNA zu unterscheiden, indem eine chemische Reaktion durchgeführt wird, die unmethyliertes Cytosin in Uracil umwandelt. Nach dieser Umwandlung kann die mit Bisulfit behandelte DNA einer PCR unterzogen, sequenziert und mit einem Referenzgenom verglichen werden. Unmethylierte Cytosine sind solche, die in der Referenz vorhanden sind, aber nach Bisulfit-Analyse und PCR durch Thymine ersetzt wurden. Indem sie mit Bisulfit behandelte DNA einer Massenspektrometrie unterziehen, können Forscher auch "Methylierungsepigramme" erstellen. die verschiedene CpGs im Genom linear darstellen und den Grad der Methylierung an jedem von ihnen darstellen. Solche Epigramme sind vor allem dann nützlich, wenn Forscher Methylierungsmuster zwischen verschiedenen Zelltypen vergleichen wollen.

Werfen wir nun einen detaillierten Blick auf das Protokoll für die Bisulfitanalyse.

Zu Beginn wird Natriumhydroxid zu Präparaten genomischer DNA hinzugefügt, die dann bei 95 °C inkubiert werden. Dadurch wird die DNA denaturiert und ihre Basen für nachfolgende chemische Reaktionen zugänglich. Anschließend wird Natriummetabisulfit in das denaturierte DNA-Gemisch eingebracht, und es finden zwei chemische Reaktionsschritte statt. Im ersten Schritt, der Sulfonierung, wird eine Sulfitgruppe an ein unmethyliertes Cytosin angehängt, um Cytosinsulfonat zu bilden. Während der hydrolischen Desaminierung wird dann eine Aminogruppe aus dem Cytosinsulfonat entfernt, um Uracilsulfonat zu erzeugen.

Um diese ersten Phasen der chemischen Reaktion zu erleichtern, wird das DNA-Präparat mit Mineralöl überzogen, das die Verdunstung verhindert und dazu beiträgt, die Konzentration von Natriummetabisulfit aufrechtzuerhalten. Die Reaktion wird dann bei 55? C im Dunkeln. Während dieses Schritts wird der Mischung auch ein Mittel zur Verhinderung der Oxidation, wie z. B. Chinol, zugesetzt.

Um modifizierte DNA zu gewinnen, die Uracilsulfonat, aber kein Mineralöl enthält, wird das Gemisch zentrifugiert und die unterste Flüssigkeitsschicht zurückgewonnen. Die DNA in dieser Lösung wird dann gereinigt.

Als nächstes wird der DNA-Mischung Natriumhydroxid zugesetzt, das dann bei 37 °C inkubiert wird. Dies geschieht, um eine Desulfonierung zu induzieren, die, wie Sie vielleicht schon vermutet haben, die Sulfitgruppe aus dem Uracilsulfonat entfernt, Uracil bildet und die chemische Reaktion abschließt.

Schließlich wird das Gemisch unter Zugabe von Ammoniumacetat neutralisiert und die DNA durch Ethanolfällung gesammelt. Sobald die Bisulfit-konvertierte DNA aufgereinigt wurde, wird sie einer PCR und Sequenzierung unterzogen.

Nachdem wir nun die grundlegende Technik für die Bisulfit-Analyse besprochen haben, schauen wir uns einige experimentelle Anwendungen an.

Einige Forscher nutzen die Bisulfit-Analyse, um die genomische Prägung zu untersuchen. Hier kreuzten die Forscher zwei Stämme von Arabidopsis mit genetischen Unterschieden, so dass mütterliche und väterliche DNA unterschieden werden konnten. Anschließend wurden die Methylierungsmuster in den resultierenden Embryonen und dem zugehörigen Endosperm oder dem Gewebe, das den Embryo trägt, verglichen. Mit dieser Methode fanden die Wissenschaftler heraus, dass CpGs im mütterlichen Allel eines proteinkodierenden Gens, MEA, in Embryonen tendenziell methyliert, im Endosperm jedoch nicht methyliert waren, was auf eine gewebespezifische Prägung hinweist.

Andere Forscher nutzen diese Technik, um zu verstehen, wie Umwelt- oder soziale Faktoren die Methylierungsmuster verändern können. Hier wurden die Jungtiere der Maus von ihren Müttern getrennt, um Stress zu erzeugen, und ihr Gehirngewebe wurde anschließend isoliert. Nach der Sequenzierung von mit Bisulfit behandelter DNA stellten die Wissenschaftler fest, dass sich die Methylierungsmuster in einem hormonkodierenden Gen, AVP, in einer bestimmten Gehirnregion in ?getrennten" Welpen, was auf einen möglichen molekularen Mechanismus für langfristige biologische Auswirkungen früher Lebenserfahrungen hindeutet.

Schließlich versuchen viele Forscher, die Bisulfit-Analyse zu optimieren, um den Vergleich von Methylierungsmustern zwischen einzelnen, einzigartigen Zellen zu erleichtern. Hier modifizierten die Forscher die Bisulfit-Analysemethode so, dass alle Schritte an einzelnen Maus-Eizellen durchgeführt wurden, die in Agarose eingebettet waren, was zum Schutz vor DNA-Verlust beitrug. Mit dieser Methode waren die Forscher in der Lage, einzelne Eizellenproben, die mit anderen Zellen kontaminiert waren, leicht zu identifizieren, indem sie nach solchen suchten, die mehrere Methylierungsmuster aufwiesen.

Sie haben gerade das Video von JoVE über methylierungsempfindliche Analysen gesehen. Hier haben wir die Rolle diskutiert, die die DNA-Methylierung bei der Genregulation spielt, Methoden, die Forscher zur Identifizierung methylierter Regionen im Genom verwenden, ein verallgemeinertes Protokoll für die Bisulfit-Analyse und schließlich einige Anwendungen dieser Technik. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!