Name: Die Induktion von mesenchymalen-Epithelial Transitions in Sarcomzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mesenchymal-epitheliale Transitionen in Sarkomzellen induzieren, um Phänotypplastizität und Krebsaggressivität zu untersuchen. Diese Methode nutzt microRNA-200 und GRHL2 für reproduzierbare Ergebnisse.

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JA erkennt an Unterstützung von dem Duke Cancer Institute, The Duke University Genitourinary Oncology Laboratory, und die Duke University Abteilung für Orthopädie. HL wurde von der National Science Foundation (NSF) Zentrum für Theoretische Biologische Physik (NSF PHY-1.427.654) und NSF DMS-1361411 und als CPRIT (Cancer Prevention and Research Institute of Texas) Scholar in der Krebsforschung des Staates Texas unterstützt an der Rice University. KEW wurde vom NIH F32 CA192630 MKJ unterstützt und HL profitierte von nützlichen Gesprächen mit Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta und Donald S. Coffey.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten DMEM für Zellkultur durch Zugabe von 50 ml fötalen Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin-Streptomycin (5000 U / ml) zu 500 ml DMEM. Dieses Medium kann für bis zu sechs Monate bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Resuspendieren lyophilisierte Primer in Nuklease-freies Wasser bis zu einer Endkonzentration von 10 uM. Store resuspendierten Primer bei -20 ° C. </li><li> Bereiten Radioimmunpräzipitation-Assay (RIPA) -Puffer (150 mM NaCl, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Ergänzung mit Protease-Inhibitor-Cocktail vor dem Gebrauch und halte Puffer auf Eis, wenn im Einsatz. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Bereiten 10 mg / ml Polybren (Hexadimethrinbromid) in Wasser und Spritzenfilter zu sterilisieren einen 0,45 um Polyethersulfon-Filter. Lösung kann bis zu sechs Monate bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten eine 1 mg / ml Arbeitslösung von Nitroblautetrazoliumchlorid von 10 mg in 10 ml PBS aufgelöst. Lagerung bei 4 ° C.</li></ol> 2. Lentivirale Transduktion von GRHL2 Tag 1 <ol><li> Platte 3 x 10 5 HEK293T Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in 2 ml DMEM , ergänzt. Beziffern Zellen eines automatisierten Zellzähler verwendet wird. Mit 5% CO 2 bei 37 ° C nach der Übernachtkultur 60% konfluent - Zellen sollten 40 sein. </li></ol> Tag 2 <ol start="2"><li> Verdünnte 2 ug leeren Vektor (pCMV-UBC-EGFP) oder 2 &amp; mgr; g pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 in 200 ul serumfreiem Medium zusammen mit 1,8 ug pΔ8.9 und 0,2 ug pCMV-VSV -G Helferplasmiden. In einem separaten Röhrchen, verdünne 4 ul einer lipidbasierten Transfektionsreagenz in 200 ul serumfreiem Medium pro Transfektion (8 &amp; mgr; l in 400 &amp; mgr; L für zwei Proben). Füge 200 &amp; mgr; l Transfektionsreagenz Mischung zu jeder Plasmid-Lösung und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Während der Incubation, HEK293T-Zellen waschen, indem das Medium durch Vakuumabsaugung entfernt und die Zellen mit 1 ml PBS gespült. Ersetzen Sie die PBS mit 800 &amp; mgr; l Serum-freien Medien. Nach 20 min, 200 &amp; mgr; l Transfektionsreagenz: Plasmid - Mischung aus Schritt 2.2 tropfenweise zu jedem Well und Inkubieren Zellen für 2 h bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Sorgfältig Transfektionsmedium durch Vakuumabsaugung entfernen, und mit 2 ml DMEM, ergänzt ersetzen. Bringen Sie die Zellen in den Inkubator für Nachtkultur. HINWEIS: HEK293T-Zellen sind lose anhaftende. Medienwechsel muss mit Vorsicht durchgeführt werden, die Entfernung von Zellen aus dem Boden der Schale oder Kolben zu begrenzen. </li></ol> Tag 3 <ol start="5"><li> Aktualisieren Medien auf transfizierten HEK293T - Zellen und Platte 3 x 10 5 RD Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in 2 ml DMEM , ergänzt. Kulturzellen über Nacht. RD-Zellen sind eine im Handel erhältliche menschliche Rhabdomyosarkom-Zelllinie. </li></ol> Tag 4 </p&gt; <ol start="6"><li> Sammeln virale Medien aus HEK293T-Zellen. Pipette, um die Medien aus den DMEM HEK293T-Zellen und in einen neuen konischen 15 ml. ersetzen Sie vorsichtig mit neuen DMEM-Medium und Ort HEK293T Zellen zurück in den Inkubator für den nächsten Tag. </li><li> Fügen Sie 2 ul 10 mg / ml Polybren pro ml Viren Medien in zwei neue 50 ml konischen Röhrchen (ein für den leeren Vektor Transfektion und eine andere für die GRHL2 Transfektion). Spritzenfilter viraler Medien durch den Kolben aus einer 3 ml-Spritze zu entfernen und ein 0,45 um-Polyethersulfonmembran Filter an der Spitze befestigen. <ol><li> Fügen Sie die viralen gesammelten Medien in Schritt 2.6 in den Zylinder der Spritze, und tauchen in die neuen Medien 50 ml konischen Röhrchen mit Polybren. Entfernen Sie das Medium von RD-Zellen durch Vakuum-Aspiration und fügen gefiltert virale Medien RD-Zellen. </li></ol></li></ol> Tag 5 <ol start="8"><li> Wiederholen Tag 4. HEK293T Zellen können verworfen werden, nachdem die viralen Medien gesammelt worden ist. </li></ol> Tag 7 </strong&gt; <ol start="9"><li> Wash RD Zellen mit 1 ml PBS und mit 200 &amp; mgr; l von 0,05% Trypsin pro Vertiefung. Inkubieren bei 37 ° C für 5 min, 2 ml des ergänzten Medium und die Zellsuspension auf eine neue 15 ml konischen bewegen. Centrifuge Zellen bei 250 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und absaugen Medien. Resuspendieren in 1 ml DMEM (mit 5% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin). HINWEIS: einen höheren Anteil an FBS verwenden, kann dazu führen, während der Durchflusszytometrie Verstopfung <ol><li> Filterzellen für die Durchflusszytometrie. Verwenden einer Pipette 1 ml der RD-Zellsuspension durch ein 30 um-Filter in der Durchflusszytometrie Rohre und Ort Röhrchen auf Eis anzuwenden. </li><li> Sortieren EGFP + 26 - Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 ml DMEM , das mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin und auf Eis. Platte EGFP + Zellen in insgesamt 1 ml DMEM, ergänzt zu einem einzelnen Well einer 12-Well-Platte und in den Inkubator für Kultur sortiert. , Anmerkung: Die Ausbeute an EGFP + Zellen aus der Durchflusszytometrie nach dieser Transduktion ist in der Regel niedrig (50.000-100.000 Zellen). Die Zellen müssen für 10 kultiviert werden - 14 Tage vor dem Fortfahren zu Schritt 3. </li></ol></li></ol> 3. Reverse Transfektion von miR-200s <ol><li> Bereiten 50 uM Bestände von miR-200 unter Verwendung von Mimetika Nuklease-freien H 2 O. Aliquot Aktien und bei -20 ° C wiederholten Einfrier / Auftau - Zyklen zu vermeiden. </li><li> Fügen 3 ul jeden 50 &amp; mgr; M ich-200 mimic (du-200a, ich-200b und ich-200c) und 300 &amp; mgr; l serumfreien Medien oder 9 ul 50 uM negative Kontrolle miRNA bis 300 &amp; mgr; l serumfreien Medien. </li><li> Fügen 6 ul von siRNA-spezifischen Transfektionsreagenz bis 600 &amp; mgr; l serumfreien Medien und dividieren 300 ul dieser Mischung in zwei Rohre, eines für jeden der beiden miR Mischungen aus Schritt 3.2. Vereinige den 300 &amp; mgr; l jede ich Mischung aus Schritt 3.2 mit einer Mischung aus 300 ul Transfektionsreagenz. Inkubieren für 20 Minuten bei Raum temperatur. </li><li> eine Zellsuspension von 600.000 EGFP exprimierenden Zellen + RD EV oder GRHL2 in Abschnitt 2 in 2,4 ml erstellt (250 Zellen / ul) von serumfreiem Medium pro Behandlung während Inkubieren vorzubereiten. </li><li> In einer 24-Well-Platte, 100 &amp; mgr; l pro Well von miR-200 Mischung oder negative Kontrollmischung aus Schritt 3.3 in sechs Vertiefungen, und dann wurden 400 &amp; mgr; l jeder Zellsuspension in drei Vertiefungen jeder miR Mischung hinzufügen. </li><li> Inkubiere Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht und Medien ändern , um vollständig DMEM am folgenden Tag ergänzt. Collect Zellen 2 Tage später für die Analyse geeignete Puffer (siehe unten). Zeitraffer-Imaging von RD Sarcomzellen MET laufen ist als ergänzendes Material zur Verfügung. Bild jede Vertiefung je 2 h mit einem 10X - Objektiv mit einer automatischen lebenden Zellen Imager 27. </li></ol> 4. RNA-Extraktion, reverse Transkription und qPCR <ol><li> Extrahieren von RNA nach Herstellerangaben unter Verwendung eines Standard-RNAExtraction Kit 24. Extrahierte RNA kann bei -80 ° C gelagert werden. </li><li> Quantifizieren RNA-Konzentration. Auftauen und die Arbeit mit RNA auf Eis. Um RNA-Konzentrationen messen UV-Absorption bei 260 nm mit einem Plattenleser-Spektrophotometer gemäß dem Protokoll des Herstellers quantifiziert. Verdünnte Proben alle auf die niedrigste Konzentration mit Nuklease-freien Wasser. </li><li> Führen reverse Transkription von Gesamt-RNA in komplementäre DNA (cDNA). Kombinieren nicht weniger als 100 ng Gesamt - RNA mit PCR - Puffer, dNTP - Mix (100 mM), Random - Hexamer - Primer, reverse Transkriptase und Nuklease-freies Wasser in einem 20 ul Reaktionsvolumen 24. Führen RT Zyklen nach Protokoll des Herstellers. cDNA kann langfristig bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Verdünne 20 &amp; mgr; l Reaktionen auf 100 &amp; mgr; l mit 80 &amp; mgr; l Nuklease-freien H 2 O. </li><li> Mix 5 &amp; mgr; l eines fluoreszenzbasierten interkalierenden Farbstoff 2x qPCR Master Mix, 0,06 &amp; mgr; l je 10 &amp; mgr; M Primer, and 2 ul der verdünnten RT-Reaktion pro Probe. </li><li> Run qPCR nach Herstellerprotokoll für die Fluoreszenz-basierten Master-Mix. </li><li> Quantifizierung relative Mengen von mRNA durch das delta CT-Verfahren und normalisieren, um GAPDH. Zeichnen Sie die mittlere mRNA-Expression von biologischen Replikaten ± Standardabweichung für jede Behandlungsgruppe. HINWEIS: Besondere Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden sollten, wenn sie mit RNA Arbeitskontakt mit RNasen zu vermeiden, wie RNase-freie Kunststoffe und Reagenzien. Nicht-Einweg-Geräte sollten vor der Verwendung behandelt werden RNasen zu entfernen. </li></ol> 5. Immunfluoreszenzanfärbung <ol><li> Nach dem Schritt 3.6, absaugen Medien durch Vakuumabsaugung von RD-Zellen in 24-Well-Format. </li><li> Fix-Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) pro Vertiefung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur (RT). Nach der Fixierung statt Zellen in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und bei 4 ° C über Nacht, falls notwendig. </li><li> PermeabilisierungZellen, die durch Zugabe von 500 &amp; mgr; l PBS + 0,2% Triton-X100 und 30 min bei RT inkubiert. Durch Vakuum-Aspiration, Permeabilisierung Puffer und wasche dreimal mit PBS entfernen. </li><li> Block in 500 ul 5% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS und Inkubieren Zellen für 30 min bei RT. Die Zellen können bei 4 ° C über Nacht bei Bedarf gespeichert werden. </li><li> Bereiten primäre Antikörperverdünnung. Pipette 200 ul 5% BSA / PBS pro Napf in ein konisches 15 ml (12 Wells = 2,4 ml) gelöst und 1 &amp; mgr; l des primären Antikörpers pro ml 5% BSA / PBS benötigt. Entfernen Blockierungspuffer durch Vakuum Aspiration und Abgabe 200 ul verdünnten primären Antikörpers in jede Vertiefung. <ol><li> Inkubiere Zellen in 1: 1.000 verdünnten Primärantikörper in 5% BSA / PBS für 1 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C. Nach der Inkubation, Waschen Zellen zweimal mit PBS. </li></ol></li><li> Vorbereiten der sekundäre Antikörperverdünnung in dem gleichen Volumen von 5% BSA / PBS, wie oben. Fügen Sie den fernen roten Farbstoff-konjugiertem sekundären Antikörper unter Verwendung einer 1: 2.000-Verdünnung. zusätzlich hinzufügen1 &amp; mgr; g / ml Hoechst Farbstoff zu der Mischung. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie zu jeder Vertiefung 200 &amp; mgr; l der Mischung. <ol><li> 1 h im Dunkeln bei RT inkubieren. Waschen 3 mal mit PBS, läßt die Zellen in PBS und schützt die Zellen vor Licht mittels Folie. Die Zellen können bei 4 ° C bei Bedarf gespeichert werden. </li></ol></li><li> Bildzellen bei 400-facher Gesamtvergrößerung auf einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop mit Anregungswellenlänge von 594 bis 650 nm. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> Wash-Zellen von 3,6 zweimal mit eiskaltem PBS. Auf Eis lysieren Zellen mit 50 &amp; mgr; l 1x RIPA mit 1x Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt Puffern. </li><li> Rock Lysate bei 4 ° C für 15 min, sammelt Lysate in 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei hohen Geschwindigkeit (20,000 · g) für 5 min Proben zu klären. Zelllysate kann langfristig bei -80 ° C bei Bedarf gespeichert werden. </li><li> Quantifizieren von Gesamt-Protein mit einer Bradford-Assay unter Verwendung und eine gleiche Menge an Protein in neue 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert. Bring Proben gleiche Volumen mit 2-Mercaptoethanol unter Verwendung von RIPA-Puffer und 3 × Laemmli-Ladepuffer ergänzt. </li><li> Inkubieren Proben in 1x Laemmli-Probenladepuffer für 5 min bei 95 ° C und führen SDS-PAGE ein 4-12% Tris-Glycin-Gel bei 200 V unter Verwendung von 45 min. Die Menge an Protein geladen Bereiche in Abhängigkeit von der Zelllinie. In manchen Fällen ist ein 50 bis 100 &amp; mgr; g Gesamtprotein benötigt E-Cadherin in mesenchymalen Zelllinien zu erkennen. </li><li> Transfer Proteine ​​auf einen Nitrocellulose-Membran 2 h bei 50 V in 1 × Tris-Glycin-Transferpuffer. </li><li> Block Membran für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C in einem BSA-Basis Blockierungspuffern. </li><li> Verdünnte primären Antikörper bei 1: 1000-Konzentration in 5 ml Blockierungspuffern, fügt Verdünnung auf die Membran, und Inkubieren unter sanftem für 1 h bei Raumtemperatur schaukelt oder über Nacht bei 4 ° C. Wasch Membran 3 mal in PBS mit 0,05% Tween-20. </li><li> Inkubieren Membranen 1 h bei RT mit Infrarot-Fluoreszenzgekoppelten NEBENTy-Antikörper bei 1: 20.000-Verdünnung in Puffer wie oben blockiert. </li><li> Waschen Membran zweimal in PBS mit 0,05% Tween-20 und dann einmal in PBS. </li><li> Bild Membran unter Verwendung von Standard Infrarot-Fluoreszenz-Detektion. </li></ol> 7. Anchorage-unabhängiges Wachstum Assays HINWEIS: Für ein detailliertes Weichagarassay Protokoll, 28 zu sehen. <ol><li> Warm steriles 2x DMEM-Medium auf 42 ° C in heißem Wasserbad. Während dieser Zeit wird Wärme 1% Agarose in der Mikrowelle für 3 min vorautoklavierten. Mikrowellen für weitere 30 s in einer Zeit nach Bedarf oder bis sie vollständig geschmolzen. Bewegen Agarose zu einem 42 ° C Wasserbad. </li><li> Legen Sie ein 50 ml konischen Röhrchen in einem Becherglas mit 42 ° C Wasser in einer sterilen Haube und mischen 1% Agarose und 2x DMEM-Medium in einer 1: 1-Verhältnis Bilanzierung von 1,5 ml Gemisch pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen. Immer bereiten zusätzliche DMEM / Agarose zum Pipettieren Fehler zu berücksichtigen und Blasen zu vermeiden. </li><li> In Mischung auf dieSeiten des Brunnens, um sicherzustellen, keine Blasen bilden, und lassen Sie sich für 30 min bei RT stehen. </li><li> Während die untere Schicht zu verfestigen, bereitet transfiziert jede Gruppe von RD-Zellen in Schritt 3 durch Waschen Medien und einmal mit 1 ml PBS abgesaugt. Aspirat PBS und mit 0,2 ml 0,05% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Neutralisieren Trypsin in 0,8 ml Medium und verreiben Zellen eine Einzelzellsuspension zu bilden. Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zählen von Zellen und Berechnen Volumen der Zellsuspension, die für 10.000 Zellen pro Vertiefung. </li><li> Erhitzt von 0,6% Agarose in der Mikrowelle für 3 min, gefolgt von 30 s in einer Zeit, bis sie vollständig geschmolzen. Bewegen Sie Agarose auf 42 ° C Wasserbad. </li><li> Legen Sie ein 50 ml konischen Röhrchen in einem Becherglas mit 42 ° C Wasser in einer sterilen Haube. Mische 0,6% Agarose und verdünnte Zellsuspension in einem Verhältnis 1: 1 1,5 ml Mischung in einer Platte mit 6 Vertiefungen pro Vertiefung herzustellen. Immer vorbereitet zusätzliche Zellsuspension / Agarose mischen zum Pipettieren Fehler zu berücksichtigen undzu vermeiden Blasen. HINWEIS: Es ist wichtig, bei 42 ° C, hier zu arbeiten. Wenn die Temperatur zu niedrig ist, wird die Mischung vor dem Plattieren verfestigen, und Temperaturen über 42 ° C werden die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen. </li><li> Gut mischen durch Verreiben Zellen mehrmals und fügen Zellgemisch in die Vertiefungen, um sicherzustellen, keine Blasen bilden, und lassen Sie sich für 20 min bei RT erstarren. </li><li> In 2 ml ergänzten Medium zu jeder Vertiefung und bewegen Platten Inkubator. <ol><li> Ändern Medien einmal pro Woche für 3-4 Wochen oder bis vielzellige Kolonien bilden. Achten Sie darauf, Berühren der Agar zu vermeiden, wenn Medien durch Absaugung entfernt wird. Alternativ dazu verwenden, um eine P1000 die oberste Schicht der flüssigen Medien zu entfernen. </li><li> Beflecken Weichagarplatten durch Zugabe von 200 &amp; mgr; L Nitroblautetrazoliumchlorid-Lösung (1 mg / ml in PBS) und Inkubieren der Platte über Nacht bei 37 ° C. Ersetzen Medien am nächsten Tag mit PBS für die Bildgebung. </li><li> Bild Vertiefungen bei 40-facher Gesamtvergrößerung auf einem inversen Mikroskop. </li><li> Führen Sie Analyse auf ImageJ für Koloniefläche und Zahl. Plot bedeuten Koloniezahl der biologischen Replikaten ± Standardabweichung. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Sarkome sind selten, aber sehr aggressive Krebsarten von einer mesenchymalen Abstammungslinie. Trotz ihrer mesenchymalen Abstammungslinie, wird eine Teilmenge von Sarkomen einen phänotypischen Übergang zu einem epithelial-ähnlichen Zustand zu unterziehen. Der MET-like - Schalter hat prognostische Relevanz, da Patienten mit Epithel-ähnlichen Tumoren sind weniger aggressiv 24. Trotz ihrer klinischen Relevanz, gibt es nur wenige Studien, die molekularen Mechanismen der Bewältigung dieser phänotypisc...

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Shenghan Xu
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Shengnan Xu

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phänotypische Plastizität bezieht sich auf einen reversible Übergang zwischen zellulären Phänotypen, und wird allgemein in zwei Typen unterteilt, epithelial-to-mesenchymalen (EMT) Transitionen und mesenchymalen-to-epithelialen Transitionen (MET). Diese phänotypische Plastizität spielt eine wichtige Rolle bei der normalen Prozessen mehrzelliger Organismen, wie Entwicklung und Wundheilung 1; jedoch können dieselben Wege und Genexpressionsprogramme auch zu Krankheiten führen, wie Fibrose ( beschrieben in 2, 3, 4) und Karzinom - Metastasen (rezensiert in Referenzen 5, 6, 7, 8). Während Metastasierung zum Beispiel stört EMT Zellpolarität, Zell-Zell - Wechselwirkungen und fördert Invasion 9, 10. Zusammen EMT beitragens zu einem phänotypischen Zustand, dass Krebszellen Verbreitung erleichtert. Außerdem führt EMT auch mit vielen anderen phänotypischen Veränderungen , die einen aggressiven Phänotyp treiben, einschließlich der Deregulierung von Krebszellmetabolismus 6, der Entwicklung der Arzneimittelresistenz 11, 12, erhöhte Tumor-Initiierungsfähigkeit 13, 14 und Host Immunevasion 15. Phänotypische Plastizität wurde in Karzinom Progression gut untersucht; zeigen jedoch Sarkome auch phänotypische Plastizität. Interessanterweise scheint es, als ob einige der gleichen Treiber der phänotypischen Plastizität bei Karzinomen auch Sarkom Plastizität und Aggressivität beitragen. Zum Beispiel zirkulierende Tumorzellen (CTCs) von Sarkom - Patienten wurden EpCAM, ein Zelloberflächenprotein exprimieren gezeigt , die typischerweise auf epithelialen Zellen 16 zu finden ist. Additional wurden 250 Weichteilsarkom Proben als Epithel-ähnlichen oder mesenchymalen artigen basierend auf Genexpression kategorisiert. Den Patienten in der Epithel-ähnlichen Biomarker Unterschrift hatten eine bessere Prognose als Patienten mit der mesenchymalen ähnlichen Biomarkers Signatur 17. Dies steht im Einklang mit vielen Karzinomen, in denen Patienten mit Epithel-ähnlichen Karzinome haben bessere Ergebnisse im Vergleich zu Patienten mit mesenchymalen artigen Tumoren 18. Während einige Sarkome Biomarker und Genexpression Wege im Einklang mit MET, die molekularen Grundlagen dieser phänotypischen Plastizität zeigen noch schwer abzuschätzen. Um die Mechanismen und Fahrer von MET in Sarkom zu studieren wir ein Modell der MET Induktion entwickeln unter Verwendung von zwei epithelialen spezifischen Faktoren, die microRNA (du) -200 Familie und grainyhead-like 2 (GRHL2). Der miR-200s ist eine Familie von kleinem nicht-kodierenden RNAs, die die Genexpression regulieren, indem sie an den 3&#39;-UTRs der Bindung messenger RNA und verhindert Übersetzung in ein Protein. Die miR-200-Familie besteht aus zwei Untergruppen - eines enthält, miR-141 und miR-200a, und das andere darunter miR-200b, miR-200c, miR-429 und. Mitglieder der ich-200 - Familie werden in epithelialen Geweben angereichert, und der Verlust von miR-200s ist mit Metastase in Karzinomen 19 verbunden. Die ich-200 - Familie ist auch in Weichteilsarkomen im Vergleich zu normalen Gewebe 20 nach unten reguliert. Ähnlich den miR-200s ist GRHL2 ein Schlüsselregulator für die Entwicklung epithelialer 21 wichtig ist. Der GRHL2 Transkriptionsfaktor wirkt auf zwei Arten epitheliale Gene, wie E-Cadherin hochzuregulieren: 1) in Epithelzellen, GRHL2 reprimiert direkt der EMT Master - Regulator, ZEB1 22; und 2) GRHL2 aktiviert direkt die Transkription von Genen epithelialer 23. Unsere bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass die kombinierte Expression von miR-200s und GRHL2 in Sarcomzelleninduziert einen MET-ähnlichen Phänotyp 24. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll ein in vitro - Modell der MET - Induktion in Sarkomzellen Verwendung ektopische Expression von miR-200s und GRHL2 zu schaffen.

<table><tbody><tr><td>Countess automatisierter Zähler</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer Objektträger</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermocycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Real Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR Mikroplatte</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Starting Block (PBS) Blockierungspuffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>BSA-basierter Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Agarose General Purpose LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS-Puffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Laufpuffer</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin-Puffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Transferpuffer</td></tr><tr><td>RIPA-Puffer</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0,45 &mu; m Nitrocellulose</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Probenpuffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA imitiert die Negativkontrolle #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA imitiert</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA imitiert</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA imitiert</td><td>Thermo Fisher 4404066</td><td></td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>11088-021</td><td>serumfreie Medien</td></tr><tr><td>Anti-Ecadherin-Antikörper</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Beta-Aktin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease und Phosphatesse Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu; m Filter für Durchfluss</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>NITRO BLUE TETRAZOLIUM&NBSP;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>Hexadimethrinbromid</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Polybren</td></tr><tr><td>3 mL Spritze</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Spritzenvorsatzfilter</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polypropylen Rundbodenröhrchen</td><td>352063</td><td></td><td>Durchflusszytometrieröhrchen</td></tr><tr><td>cDNA Reverse Transkriptionskit mit hoher Kapazität</td><td>Thermo Fisher</td><td>4368814</td><td>reverse Transkriptionskit</td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyd</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

die induktion von mesenchymalen-epithelial transitions in sarcomzellen

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phänotypische Plastizität bezieht sich auf ein Phänomen, bei dem Zellen, die transient Züge eines anderen Abstammungslinie gewinnen. Während Karzinom Progression treibt phänotypische Plastizität Invasion, Verbreitung und Metastasierung. Tatsächlich, während die meisten Studien der phänotypischen Plastizität im Zusammenhang mit der epithelialen abgeleiteten Karzinome waren, stellt sich Sarkome aus, die mesenchymalen Ursprungs sind, auch phänotypische Plastizität aufweisen, mit einer Teilmenge von Sarkomen ein Phänomen unterziehen, die eine mesenchymal- ähnelt epithelial Übergang (MET). Hier entwickeln wir ein Verfahren mit der ich-200-Familie und grainyhead-like 2 (GRHL2) diese MET-Phänomene wie in Sarkom Patienten beobachtet samples.we nachzuahmen sequentiell GRHL2 exprimieren und die ich-200-Familie unter Verwendung von Zell-Transduktion und Transfektion bzw. zu verstehen, um besser auf die molekularen Grundlagen dieser phänotypischen Übergänge in Sarcomzellen. Sarcoma-Zellen, ich-200s und GRHL2 demonstrierten verbesserten epithelialen characteristICs in der Zellmorphologie und den Umbau von epithelialen und mesenchymalen Biomarker. Zukünftige Studien mit Hilfe dieser Methoden können besser genutzt werden, um die phänotypischen Folgen der MET-ähnlicher Prozesse auf Sarkom-Zellen zu verstehen, wie Migration, Invasion, metastasierendem Neigung und Therapieresistenz.

Schema für MET Induktion in Sarkomzellen Eine allgemeine Zeitleiste für die Induktion von MET artigen Veränderungen in Sarkomzellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll beginnt mit GRHL2 (Abbildung 1A), gefolgt von Transfektion der miR-200 - Familie (Abbildung 1B) Umwandlungs. GRHL2 oder ich-200 Familienmitglieder waren nicht in der Lage das Auftreten von RD-Zellen zu be...

Wir stellen hier ein Zellkulturverfahren für die auf Basis von kombinierten ektopische Expression von microRNA-200 Familienmitgliedern und grainyhead-like 2 (GRHL2) mesenchymale-epithelialen Transitionen (MET) in Sarkomzellen zu induzieren. Dieses Verfahren ist für eine besseren geeignet, die biologische Wirkung der phänotypischen Plastizität auf Krebs Aggressivität und Behandlungen zu verstehen.

Die Induktion von mesenchymalen-Epithelial Transitions in Sarcomzellen

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die phänotypischen Auswirkungen von mesenchymal-epithelialen Übergängen in Sarkomen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu beantworten, warum Sarkome mit epithelialen Merkmalen bessere Behandlungsergebnisse aufweisen als Sarkome mit stärker mesenchymalen Eigenschaften. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache und reproduzierbare Möglichkeit bietet, die downstream liegenden genregulatorischen Netzwerke und Phänotypen zu erforschen, die mit mesenchymal-epithelialen Übergängen in Sarkomen assoziiert sind.Indem wir die phänotypische Plastizität von Sarkomen besser verstehen, hoffen wir, therapeutische Maßnahmen identifizieren zu können, die es uns ermöglichen, Sarkome in einen weniger aggressiven, epithelialartigen Zustand zu überführen. Die Durchführung des Verfahrens wird von zwei Studierenden in unserem Labor demonstriert, Jackson Xu und Shivee Gilja. Am ersten Tag der Transduktion werden 3 × 10⁵ HEK293T-Zellen pro wohl in je zwei Milliliter zugesetztem DMEM in zwei Wölbchen einer sechswölbchen-Platte ausgesät.Die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach

induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Gewebezüchtungen Fibroblasten-nativen Matrix ist eine aufstrebende Werkzeug, um eine Stroma-Substrat, das epitheliale Zellproliferation und Differenzierung unterstützt generieren. Hier wird ein Protokoll gemäß dieser Methode die Auswirkung verschiedener stromalen Zelltypen auf Tumor Zellbiologie Beurteilung vorgelegt.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Hier beschreiben wir die Entwicklung und Anwendung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Funktion in mesenchymalen Zellen, die einen epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen haben.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Der Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT) ermöglicht es Krebserkrankungen, invasiv zu werden. Zur Untersuchung der EMT wird ein auf neuralen Stammzellen (NSC) basierendes In-vitro-Modell beschrieben, das frei von Serum und Enzymen ist. Dieses standardisierte System ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zellmigration, der Gen- und Proteinexpression. Das Modell eignet sich für die Wirkstoffforschung.

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Direkter Einspritzung von Krebs-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) führt zur Neuprogrammierung des Knochenmarks Tumorprogression zu unterstützen; die Zellen dieser Effekt vermitteln, ist jedoch unklar. Hierin beschreiben wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur EV-vermittelten Tumor-mesenchymale Stammzellen (MSC) Interaktionen in VivoUntersuchung offenbart eine entscheidende Rolle für EV-gebildete MSCs in Metastasen.

Eine präklinische Mausmodell der Osteosarkom, die extrazelluläre Vesikel-vermittelter Kommunikation zwischen Tumor und mesenchymalen Stammzellen zu definieren

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Isolierung tumorinitiierender Zellen aus humanen Sarkom-Patienten-patienten-abgeleiteten Xenografts durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, unter Verwendung des humanen Leukozyten-Antigens-1 (HLA-1) als negativem Marker, und für die weitere Validierung und Charakterisierung dieser HLA-1-negativen tumorinitiierenden Zellen.

Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

Ein Protokoll für in-vitro- Induktion von endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT), die nützlich für die Untersuchung von zelluläre Signalwege an EndMT beteiligt ist, wird beschrieben. In diesem experimentellen Modell ist EndMT durch Behandlung mit TGF-β in MS-1 Endothelzellen induziert.

Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

Die extrazelluläre Matrix (BEM) Knochenmodell für Osteosarkom (OS) ist hier gut etabliert und gezeigt. Es kann als geeignete Gerüst für Primärtumor Wachstum in Vitro imitiert und bietet ein ideales Modell für das Studium der histologischen und cytogenic Heterogenität des Betriebssystems verwendet werden.

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Wir beschreiben einen systematischen Workflow zur Untersuchung der TGF-β Signalisierung und tGF-β-induzierten EMT, indem wir die Protein- und Genexpression untersuchen, die an diesem Signalweg beteiligt sind. Die Methoden umfassen Western Blotting, ein Luziferase Reporter Assay, qPCR, und Immunfluoreszenz Färbung.

Untersuchung von TGF-β Signalisierung und TGF-β-induzierten epitheliaal-mesenchymalen Übergang bei Brustkrebs und normalen Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt den Aufbau von 3D-On-Top-Kulturen einer nicht transformierten Brustepithelzelllinie, MCF10A, die modifiziert wurde, um die durch den Thrombozytenaktivierungsfaktor (PAF) induzierte Transformation zu untersuchen. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die Transformation zu bewerten und wird ausführlich diskutiert.

Phospholipid-Mediator-induzierte Transformation in dreidimensionalen Kulturen

Erfahren Sie, wie Sie mesenchymal-epitheliale Transitionen in Sarkomzellen induzieren, um Phänotypplastizität und Krebsaggressivität zu untersuchen. Diese Methode nutzt microRNA-200 und GRHL2 für reproduzierbare Ergebnisse.

Die Induktion von mesenchymalen-Epithelial Transitions in Sarcomzellen

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