Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mikrovaskuläre Fragmente aus murinem Fettgewebe zu isolieren, um Vaskularisationseinheiten für das Tissue Engineering zu erzeugen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich des Tissue Engineering zur in vivo Vaskularisierung von Gewebesubstitutionen zu beantworten. Ein Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ohne aufwändige In-vitro-Verarbeitung voll funktionsfähige mikrovaskuläre Segmente liefert, die auf Gerüste gesät und in Gewebedefekte implantiert werden können.

Diese Methode kann auch auf andere Systeme wie In-vitro-Angiogenese-Assays angewendet werden, um molekulare Mechanismen zu entschlüsseln, die der Bildung und dem Umbau mikrovaskulärer Netzwerke zugrunde liegen. Beginnen Sie damit, eine anästhesierte männliche Wildtyp-C57-Black-Six-Maus in Rückenlage unter ein chirurgisches Stereomikroskop zu legen und bestätigen Sie, dass es keine Reaktion auf das Einklemmen der Zehen gibt. Die Pfoten mit Klebeband ruhigstellen und den Bauch desinfizieren.

Trennen Sie anschließend mit einer Präparierschere die Bauchschicht vom darunter liegenden Muskelgewebe und führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie durch. Klappen Sie die Lappen der Bauchdecke seitlich auf und identifizieren Sie beidseitig die Hoden, den Nebenhoden und die Nebenhodenfettpolster. Entnehmen Sie dann mit einer kleinen Präparationsschere und einer feinen Pinzette die Fettpolster, achten Sie darauf, dass sich kein Nebenhodengewebe ansammelt, und legen Sie die Fettpolster in eine Petrischale mit 15 ml 37 Grad Celsius DMEM.

Waschen Sie die Fettpolster in einer Laminar-Flow-Haube in drei separaten Petrischalen mit 15 ml PBS und geben Sie das gewaschene Fett in ein leeres 14-ml-Polypropylen-Röhrchen. Verwenden Sie eine Röhrchenwaage, um das Volumen des geernteten Fetts zu bestimmen. Anschließend wird das Fettgewebe mit einer feinen Schere mechanisch zerkleinert.

Wenn eine homogene Gewebesuspension erhalten wird, wird das zerkleinerte Gewebe mit einer 10-ml-Messpipette mit zwei Volumina Collaginase NB 4G in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben mit einem 25-Millimeter-Rührstab überführt. Den Kolben für 10 Minuten unter kräftigem Rühren in einen Zellkultur-Inkubator stellen. Beobachten Sie dann 10 mcL des verdauten Gewebes unter einem Mikroskop.

Der schwierigste Schritt in diesem Isolierungsverfahren besteht darin, den geeigneten Zeitpunkt für den Stopp der Verdauung zu bestimmen. Wenn Sie die Fettpolster zu lange verdauen, erhalten Sie eine einzellige Suspension ohne mikrovaskuläre Fragmente. Wenn der Gärrest neben einzelnen Zellen aus freiem Fettgewebe mikrovaskuläre Fragmente enthält, neutralisieren Sie das Enzym mit zwei Volumina PBS, die mit 20 % FCS ergänzt sind, und überführen Sie die Zellgefäßsuspension in neue Polypropylenröhrchen.

Inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die mikrovaskulären Fragmente durch die Schwerkraft vom restlichen Fett zu trennen. Verwenden Sie dann eine 1-ml-Präzisionspipette, um vorsichtig einen ml des Hauptfettüberhauts zu entfernen, gefolgt von der Verwendung einer 100-ml-Präzisionspipette, um den Rest des Überhauts zu entfernen, bis die Suspension fettfrei zu sein scheint. Wenn das gesamte Fett entfernt wurde, filtrieren Sie die Zellgefäßsuspension mit einer 10-ml-Messpipette durch ein 50-Mikron-Sieb über einem konischen 50-ml-Röhrchen und überführen Sie die gefilterte Suspension in ein neues 14-ml-Polypropylenröhrchen für jedes einzelne mikrovaskuläre Fragmentisolat.

Sammeln Sie die mikrovaskulären Fragmentpellets durch Zentrifugation und entfernen Sie alle bis auf den letzten ml Supernatent aus jedem Röhrchen. Die Pellets in den restlichen Überständen resuspendieren. Übertragen Sie dann jede Suspension in einzelne konische 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die mikrovaskulären Fragmente erneut zur Resuspension in dem entsprechenden Endvolumen von PBS und 20 % FCS für die geplante nachgelagerte Analyse.

Hier wird die Längenverteilung von frisch isolierten mikrovaskulären Fragmenten von sechs, sieben bis zwölf Monate alten Wildtyp-C57-Black-Six-Mäusen gezeigt, wobei eine mittlere durchschnittliche Länge von etwa 42 Mikrometern beobachtet wird. Wie dieser repräsentative Zellgefäßsuspensionsabstrich zeigt, werden große, mittlere und kleine mikrovaskuläre Fragmente sowie einzelne Zellen beobachtet, wenn das Fettgewebe ausreichend verdaut wurde. Eine höhere Vergrößerung zeigt, dass die mikrovaskulären Fragmente eine ausgereifte Mikrogefäßmorphologie mit hierarchischen Mikrogefäßsegmenten aufweisen.

Die Charakterisierung der mikrovaskulären Fragmente mittels Durchflusszytometrie deutet darauf hin, dass sie CD31-positive Endothelzellen, Alpha-Akton-positive paravaskuläre Zellen der glatten Muskulatur und CD117-positive mesenchymale Stammzellen, markerexprimierende Zellen, enthalten. Nach der Aussaat auf einem dermalen Hautersatz sind größere mikrovaskuläre Fragmente hauptsächlich auf der Implantatoberfläche lokalisiert, wobei einige Kapillargefäßsegmente innerhalb der Implantatkerne nachgewiesen werden. Die immunhystochemische Färbung der ausgesäten mikrovaskulären Fragmente zeigt darüber hinaus physiologische Mikrogefäßkonfigurationen mit arteriolären, venulären und kapillarartigen Fragmenten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mikrovaskuläre Fragmente aus murinem Fettgewebe als Vaskularisationseinheiten für das Tissue Engineering isoliert werden können.