Name: Bewertung der sarkoplasmatischen Retikulum Calcium Reserve und intrazellulären diastolische Calcium Entfernung in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Erfahren Sie die Bewertung des sarkoplasmatischen Retikulum Calcium-Reserven und der diastolischen Calcium-Entfernung in isolierten Kardiomyozyten. Diese Methode hilft bei der Untersuchung von Calcium-Handhabungsmechanismen bei Diabetes und Herzinsuffizienz.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), der Medizin und Gesundheit Wissenschaft Programm der Provinz Zhejiang (Nr. 201646246, Dongwu Lai) und der Gesundheitswissenschaften und Technologie-Plan der Stadt Hangzhou (Nr. 2013A28, Ding Lin).

alle Tierversuche durchgeführt gemäß Protokollen durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences und Zhejiang University genehmigt.
 1. Vorbereitung der Lösung <ol><li>bereiten Sie alle Lösungen, wie in Tabelle 1 beschrieben.</li></ol>
 2. Isolation des linken Ventricular (LV) Kardiomyozyten Hinweis: LV Kardiomyozyten sind isoliert enzymatisch mit einem Langendroff Perfusion System wie oben beschrieben 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
<ol><li>Stellen Sie das Langendroff Perfusion System. Füllen Sie die Perfusion System mit normalen Tyrode (NT) Lösung, stellen Sie die Temperatur bei 36,5 ° C und beseitigen Sie eventuelle Luftblasen in der Röhre.</li>
	<li>Wiegen und eine Sprague-Dawley Ratten durch intraperitoneale Injektion (Ip) von Chloral Hydrate (400 mg/kg) zu betäuben. Bestätigen Sie die Narkose Status durch Auswertung von Rute oder Zehe Prise Reaktion nach 5 min.</li>
	<li>Die Bauchhöhle unter dem Xiphoid Prozeß mit einer chirurgischen Schere öffnen, heben das Xiphoid Prozeß und öffne die Truhe mit der Schere. Entfernen Sie das Perikard, leicht heben das Herz mit der gebogenen Pinzette identifizieren den Aortenbogen und Herzen durch Scheren aus der Wurzel der Aorta abgeschnitten.</li>
	<li>Übertragen die Herzen zu einem 60-mm-Gericht und waschen Sie es mit NT-Lösung. Halten die Aorta mit zwei Mikro-sezieren Pinzetten, und montieren Sie ihn auf die Langendorff Perfusion Kanüle und dann fest verbinden die Aorta auf die Kanüle mit chirurgischem Nahtmaterial. 
	Hinweis: Ein erfahrener Bediener kann beenden dieses Prozesses innerhalb 15 s.</li>
	<li>Perfundieren Herzen mit 30 mL NT-Lösung für die Durchblutung der Herzkranzgefäße zu erholen. Dann wechseln die Perfusat zu 30 mL Ca 2 +-freie Tyrode-Lösung (10 mM Taurin, 1 mg/mL BSA) um den Herzschlag zu stoppen. Wechseln Sie als nächstes die Perfusat zu Collagenase A Isolierungslösung (0,6 mg/mL) für Enzym Verdauung. 
	Hinweis: Mit Collagenase A für Experimente mit diabetischen Ratten oder Kollagenase II für Experimente ohne diabetischen Ratten.</li>
	<li>Nach der Verdauung für 20-25 min, schnell ändern die Perfusion-Lösung, die Ca 2 +-freie Tyrode-Lösung um weitere Verdauung zu stoppen. Halten Sie dann, das Herz mit der Pinzette, abgeschnitten von der Kanüle und legen Sie das Herz in eine 35-mm-Schale mit KB-Lösung (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Sezieren die LV-Wand mit Schere und Pinzette. Schneiden Sie den Vorhof, rechte Herzkammer und ventrikulären Kreuzung Bereich. Das restliche Gewebe ist der LV; übertragen sie in ein neues 35-mm-Gericht mit KB-Lösung. Das LV-Gewebe in kleine Stücke hacken.</li>
	<li>Sanft pipette die Stücke mit einem gefilterten Kunststoff Dropper und neu in 10 mL KB Lösung auszusetzen.</li>
	<li>Filtern die Zellen mit 150 µm Blende Edelstahl Filter und Transfer in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Zentrifugieren Sie bei 150 X g für 30 s und entsorgen der Überstand. Wieder aussetzen der Myozyten in 10 mL KB Lösung, frei für 6 min zu begleichen überstand verwerfen und erneut aussetzen das Pellet in 10 mL KB Lösung. 
	Hinweis: Alle Schritte durchgeführt wurden, bei 36 ° C in Lösungen mit 100 % O 2 vergast.</li>
</ol> 3. Kalzium-Wiedereinführung <ol><li>nach dem Absetzen für 20 min in KB-Lösung, den Überstand verwerfen und erneut aussetzen der Myozyten mit Kalzium Wiedereinführung Lösung A (0,3 mM Ca 2 +, 4,5 mL Ca 2 +-kostenlose Tyrode-Lösung, 1,5 mL NT-Lösung) für 10 min.</li>
	<li>Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren mit Kalzium Wiedereinführung Lösung B (0,3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-kostenlose Tyrode-Lösung, 3 mL NT-Lösung).</li>
	<li>Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren mit NT-Lösung (1,2 mM Ca 2 +), die verfügbaren Myozyten zu reinigen. Die isolierten LV Myozyten in dieser Lösung zu lagern und studieren Sie sie innerhalb von ca. 4-6 h.</li>
</ol> 4. Set Up der Perfusion System <ol><li>Schließen Sie den Zulauf-Schlauch mit der NT-Lösung für Kammer Perfusion ( Abbildung 1A).</li>
	<li>Für Nadel-Perfusion der Ziel Myozyten, verbinden die Multi-barrel vielfältigen Spitze (z. B. Perfusion Bleistift, fortan als Bleistift bezeichnet), in dem Mikromanipulator fixiert, am Ventil Perfusion System gesteuert. Jede Spalte des Bleistifts ( Abbildung 1A) NT und 10 mM Koffein Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Evakuieren Luftblasen in den Röhren Luft Blockade zu vermeiden.</li>
	<li>Die Tropf Anzahl von Mikron-Spitze des Bleistifts für 10 s, und stellen Sie manuell die Durchflussregler zu halten die Strömungsgeschwindigkeit in einer ungefähren Geschwindigkeit von 3 Tropfen/10 s.</li>
</ol> 5. Messungen der intrazellulären Ca 2 + Transienten- und Verkürzung des Sarkomers 7 , 8 , 9 <ol><li>Pipette 10 µL Zellsuspension auf der Folie Zellzahlen durch einen Zähler der Zelle unter dem Mikroskop zählen, und die Dichte zu berechnen. Verdünnen Sie Myozyten eine ungefähre Konzentration von 50.000 Zellen/mL.</li>
	<li>In der Dunkelheit für 20 min bei Raumtemperatur halten Add Fura-2 Acetoxymethyl (AM) Lager (Kalzium sensibler Farbstoff) in einer 1 mL Suspension der Myozyten bringen die Endkonzentration bis 2 µM..</li>
	<li>Zentrifuge bei 150 g für 30 s und wieder auszusetzen die Herzzellen mit NT-Lösung 2 x.</li>
	<li>Drehen das Licht aus und halten die Zellen im Dunkeln. Ort der Myozyten in der Perfusion Kammer für 15 Minuten. Starten Sie dann die Kammer Perfusion (1,5 mL/min) mit NT-Lösung. Tempo der Myozyten mit 1 Hz Feld Stimulation mit einem Stimulator (Welle Dauer 4,0 ms Pulse Amplitude 8,0 V) für 5 min.</li>
	<li>Wählen Sie eine Myozyten mit guter Form (Stab Form, scharfe Kante, und klar Kreuz Streifung) und stabile stimuliert Twitch (keine spontane Kontraktion) unter die 10 x mikroskopischen Objektivlinse. Ändern Sie die mikroskopische Vergrößerung 40 x, und drehen Sie die CCD Kameraausrichtung um die Myozyten in horizontaler Position zu halten.</li>
	<li>Rahmen der einzelnen Myozyten durch Anpassung des Zelle Rahmung Adapters. Sicherzustellen, dass der Hintergrund klar ist.</li>
	<li>Der Myozyten, das Licht von einer Xenon-Lampe mit 340 und 380 nm Wellenlänge Erregung Filter, entlarven und Bild der Myozyten durch ein Objektiv 40 X. Erkennen Fluoreszenzsignal bei 510 nm. In der Zwischenzeit beachten Sie die Sarkomers Längenänderungen der der Myozyten und Aufzeichnen der Softedge-Modul gleichzeitig zu verwenden.</li>
	<li>Datensatz Fluoreszenz durch ein Dual-Erregung Fluoreszenz-Photomultiplier-System. Das Aufnahmeprogramm für das Kalzium imaging-System ausführen, klicken Sie &#34; Datei/neue Datei &#34; erstellen Sie eine neue Aufnahmedatei, und klicken Sie auf die &#34; Start &#34;-Taste, um synchron Datensatzlänge Fluoreszenz und Sarkomers.</li>
</ol> 6. Bewertung der SR Ca 2 + Reserve und diastolische Ca 2 + Removal-Funktion 7 , 8 , 9 <ol><li>Interlink der &#34; Aux Out &#34; Seehafen der Stimulator mit den &#34; Analog In &#34; Port auf der Ventilsteuerung (z. B. Ventil Kommandant, siehe Tabelle der Materialien) über ein BNC-Kabel (mit TTL-Signal synchronisiert).</li>
	<li>Voreingestellte ein Programm für die Perfusion Schaltventile automatisch als zuvor beschriebenen 8 , 9; Ausführliche Anleitung zum Betrieb sind wie folgt aufgeführt.
	<ol><li>Vorgabe der Parameter in das Ventil Steuerungs-Software gemäß Tabelle 2, und klicken Sie auf die &#34; Download &#34; Button zum download der Sequenzablaufs in das Programm geladen. Klicken Sie auf die &#34; Triggäh &#34;-Taste, um den Trigger aktivieren. 
		Hinweis: Die Ventilsteuerung die Sequenz nach Erhalt TTL-Signal ausführen kann.</li>
		<li>Den Stimulator zu Sequenzmodus voreingestellt, und legen Sie die Parameter gemäß Tabelle 3.</li>
	</ol></li> <li>Legen Sie den Stimulator am &#34; S1 Schritt &#34;, die LV Tempo Myozyten bei 1 Hz. beginnen die Nadel Perfusion mit der Geschwindigkeit von 1,5 mL/min mit NT Lösung. 
	Hinweis: Da die Geschwindigkeit des Wildbaches Nadel schneller als Kammer Perfusion ist, unterscheidet die Lichtbrechung des Wildbaches Nadel die Lichtbrechung der Kammer Perfusion. Der Unterschied der Lichtbrechung zeigt den Bereich der effektiven Nadel Perfusion, umgibt das Ziel Myozyten.</li>
	<li>Wählen Sie ein Ziel Myozyten unter den low-Power mikroskopische Ansicht (in der Reihenfolge der downstream, upstream), und stellen Sie sicher kann erreicht werden durch das micro Spitze des Bleistifts. Ändern Sie die Mikroskop-Vergrößerung auf 400 X. Drehen Sie die CCD Kameraausrichtung um die Myozyten in die horizontale Position zu halten. Stellen Sie die rechteckige Blende unter der Zelle Rahmung Adapter zu einem geeigneten Fenster, das mit der Myozyten erfüllt. Sicherstellen Sie, dass es minimaler Hintergrund; lassen Sie nicht andere Myozyten oder tote Zellenrückstand in diesem Fenster.</li>
	<li>Passen Sie die Position des Stifts auf dem Mikromanipulator fixiert, und setzen Sie sorgfältig die Mikro Spitze in der Entfernung des Radius des Gesichtsfeld um Ziel Myozyten unter 400 x Mikroskop-Vergrößerung.</li>
	<li>Stellen Sie die Nadel Stream Bereich meist das Ziel Myozyten und stellen Sie sicher, dass die Myozyten durch die Nadel Strömung weggespült werden kann nicht.</li>
	<li>Nach 60 s grundlegende Tempo, Rollen Sie den Stimulator-Cursor, um die &#34; D2 Schritt &#34;. 
	Hinweis: Der Rest des Protokolls wird automatisch von der Stimulator und Ventilsteuerung ausgeführt werden. Basierend auf der oben genannten Einstellung, das Protokoll ausgeführt werden konnte automatisch wie in Abbildung 2A, 1 Hz grundlegende Tempo mit NT-Lösung für 60 s. Dann pause, Tempo und Verzögerung für 2 s, wechseln Sie schnell in 10 mM Koffein Perfusion für 15 s (freizugebende funktional Ca 2 +-Lager in der SR), und wechseln Sie dann zurück zur NT-Lösung.</li>
	<li>Am Ende der Aufnahme erkennen die Hintergrundfluoreszenz für einzelne Myozyten. Klicken Sie auf die &#34; Pause &#34; Taste, um die Datei aufnehmen, Anhalten der mikroskopische Blick auf einen nahe gelegenen leeren Bereich bewegen. Klicken Sie auf die &#34; Platte &#34; Taste, um die Aufzeichnung für Sekunden fortzusetzen, und notieren Sie numerische 340 und 380 nm Intensitätswerte für Untergrundkorrektur.</li>
	<li>Offen die &#34; Betrieb/konstante &#34; des Dialogfeldes "" und füllen Sie die Werte in den &#34; Hintergrund &#34; bilden, beziehungsweise; die Software korrigiert Fura-2 Verhältniswerte durch Subtraktion Hintergrund.</li>
</ol> 7. Daten-Analyse- 9 <ol><li>für Messungen von Kalzium Transienten und Sarkomers Verkürzung auf die grundlegende Tempo Etappe, durchschnittliche zucken Hülsenfrüchte, zu analysieren und dann dynamische Parameter, wie z. B. Kalzium Transienten, die Zeitkonstante des Calcium transiente Zerfall (Tau-1 Hz), mit Hilfe der Software automatisch. 
	Hinweis: Wenn die Software Segment Verfall nicht gut passt, exportieren die Abnahme-Ablaufverfolgung für manuelle Mono-exponentielle Kurvenanpassung.</li>
	<li>Für Koffein-induzierte Kalzium Impulse, wählen Sie nur den Puls mit einer steilen Welle für die Analyse von Kalzium-Removal-Funktion. Zellen mit Signalstörungen, abnorme Puls oder diejenigen, die Weg in der Mitte floss ausschließen.</li>
	<li>Messen die Amplitude des Impulses Koffein-induzierte Kalzium (Ca-Koffein, einen Index der SRCa 2 + Reserve).</li>
	<li>Erhalten die Zeitkonstante Verfall der Koffein-induzierte Kalzium Puls (Tau-Koffein) durch den Mono-exponentielle Kurve Einbau (10 s Dauer) manuell aus Software ( Abbildung 2).</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
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<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Kalzium-Flussmittel befreit die SR ist Ca2 + Hauptquelle für Systole im Herzen. Teilweise, die Amplitude der SR Ca2 + Content und die gebrochene Ca reflektieren2 + SR befreit die SR Ca2 + Reserve für kardiale Kontraktion zur Verfügung. Auf der anderen Seite hängt die Ca2 + Reserve von SR von der Fähigkeit der SR Ca2 + Reuptake, Ca2 + Leck von SR und ihr Gleichgewicht über die SR während der Diastole12,<sup clas...

Intrazellulären Calcium recycling ([Ca2 +]ich) spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Kardiomyozyten1. Wie wir wissen, initiiert die Kalzium-induzierte Ca2 + Freigabe der Erregung-Kontraktion Kupplung, die übersetzen des elektrischen Signals zur Kontraktion. Membran-Depolarisation aktiviert die sarcolemmal L-Typ Ca2 + -Kanäle, die Ca2 + induzieren von SR in das Zytoplasma über Ryanodin-Rezeptoren 2 (RyR2) zu befreien. Die vorübergehende erhöhte zytoplasmatischen Ca2 + initiiert Kontraktion der Myofibrillen. Während der Diastole zytoplasmatischen Ca2 + ist Reuptaken in der SR durch die SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) und pumpte aus der Cardiomyocyte über die Na+-Ca2 + Wärmetauscher (NCX)2. Dieser Prozess führt zur Kontraktion-Entspannung-recycling in der Cardiomyocyte.
Die kardiale SR ist ein intrazellulären Membran-Netzwerk, die die kontraktile Maschinen umgibt. Es dient als Ca2 + Reservoir für Kontraktion, und es nimmt intrazellulären Ca2 + während der Entspannung. Die SR Ca2 + Reserve für Beats ist bestimmt für kardiale Kontraktilität. Unterdessen ist die Entfernung der intrazellulären Ca2 + für kardiale Diastole von entscheidender Bedeutung. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen kann wie Diabetes und Herzinsuffizienz, eingeschränkter Ca2 + Abstand und deprimiert SR Ca2 + Shop in Herzmuskelzellen in den Prozess der kardialen Dysfunktion2,3 mit einbezogen werden ,4.
Zur Messung der SR Ca2 + Release und diastolische Ca2 + Entfernung in Kardiomyozyten, gibt es zwei weit verbreitete Ansätze: die Integrität des aktuellen NCX basierend auf Patch-Clamp5,6, und die Koffein-induzierte Ca 2 + Puls basierend auf Ca2 + Fluoreszenz imaging7,8,9. Das erste Verfahren hängt davon ab, dass die Ca2 + SR befreit weitgehend aus der Zelle durch NCX gepumpt wird. Allerdings ist dieser Ansatz von seiner Forderung nach vorgerückte Ausrüstung und geschickte Betrieb begrenzt. In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine bequeme Herangehensweise zur SR Ca2 + Reserve und Ca2 + Entfernung in Myozyten Beurteilung durch die Messung eines Koffein-induzierte Ca2 + Puls basiert auf einem Ca2 + Fluoreszenz imaging System. Kurz, wird die intrazelluläre Ca2 + Fluoreszenz durch Fura-2. Durch Vernetzung der Stimulation und Durchblutung System, präsentieren wir Ihnen ein Programm zur Umstellung der Perfusion und Tempo System automatisch. 10 mM Koffein wurde eingesetzt, um schnell total Ca2 + Release in der SR induzieren Der exponentiellen Zerfall Zeitkonstante (Tau) von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse wurden von Mono-exponentielle Kurvenanpassung, erhalten, die den Beitrag der SERCA und NCX, diastolische Ca2 + Entfernung entsprechend widerspiegeln.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure</td><td>Alfa Aesar A15031</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA Roche</td><td></td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>Koffein</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff System</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Marchauser</td><td>MM33 Links</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionskammer</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>Valve Controlled Gravity Perfusion System</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>Valve Commander Software</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Durchflussregler</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Mikron abnehmbare Spitze</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmess- und Zelldimensionierungssysteme</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Aufzeichnungssoftware</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Ratten</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der sarkoplasmatischen retikulum calcium reserve und intrazellulären diastolische calcium entfernung in isolierten ventrikulären kardiomyozyten

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Kardiale sarkoplasmatischen Retikulum (SR) dient als Ca2 + Reservoir für Kontraktion, welche Reuptakes intrazellulären Ca2 + während der Entspannung. Die SR Ca2 + Reserve für Beats ist determinate für kardiale Kontraktilität, und die Entfernung von intrazellulären Ca2 + ist entscheidend für die diastolische Herzfunktion. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen wie Diabetes und Herzinsuffizienz können den Fortschritt der kardialen Dysfunktion beeinträchtigt Kalzium Clearance und SR Ca2 + Shop in Kardiomyozyten beteiligt werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur SRCa2 + Reserve und diastolische Ca2 + Entfernung zu bewerten. Kurz, eine einzelne Cardiomyocyte wurde enzymatisch isoliert, und die intrazelluläre Ca2 + Fluoreszenz von Fura-2 angegeben wurde von einem Kalzium-imaging-System aufgezeichnet. Um Koffein zur Induktion SR Ca2 + Gesamtfreigabe beschäftigen, preset wir eine automatische Perfusion Schalter Programm durch Vernetzung der Stimulation und die Perfusion System. Dann wurde die Mono-exponentielle Kurvenanpassung für die Analyse von Verfall Zeitkonstanten von Kalzium Transienten und Koffein-induzierte Kalzium Impulse verwendet. Entsprechend der Beitrag des SR Ca2 +-ATPase (SERCA) und Na+-Ca2 + Wärmetauscher (NCX) diastolischen Kalzium Entfernung wurde ausgewertet.

Wir zeigen hier, Streptozocin (STZ) - induzierte diabetische Ratten (DM) und Alter abgestimmten Sprague - Dawley (SD) Ratten zum Beispiel. 8 Wochen alten männliche SD-Ratten (200 ± 20 g) erhielt eine einmalige intraperitoneale Injektion von STZ (70 mg/kg, Ip) für den DM-Gruppe oder Citrat-Puffer für die Kontrollgruppe. Eine Woche nach STZ Verwaltung, Ratten mit Blutzucker &#62; 16,7 Mmol/L wurden als Diabetiker. Nach 8 Wochen wurden die LV Myozyten enzymatisch isoliert. Nach Kalzium Wiede...

Recycling von intrazellulären Calcium spielt eine entscheidende Rolle bei Regulierung der systolischen und diastolischen Funktion in Herzmuskelzellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur sarkoplasmatischen Retikulum Ca2 + Reserve und diastolische Kalzium-Removal-Funktion in Herzmuskelzellen durch ein Calcium imaging-System zu bewerten.

Bewertung der sarkoplasmatischen Retikulum Calcium Reserve und intrazellulären diastolische Calcium Entfernung in isolierten ventrikulären Kardiomyozyten

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kalziumreserve des sarkoplasmatischen Retikulums und die Funktion der intrazellulären diastolischen Kalzientfernung in isolierten Kardiomyozyten zu bewerten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu den Mechanismen der intrazellulären Kalziumhandhabung unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen wie Diabetes und Herzinsuffizienz zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Handhabungskomfort und der geringeren technischen und apparativen Einschränkung.Um dieses Verfahren zu beginnen, richten Sie das Langendorff-Perfusionsystem ein. Füllen Sie das Perfusionsystem mit NT-Lösung, stellen Sie die Temperatur auf 36,5 Grad Celsius ein und entfernen Sie alle Luftblasen aus dem Schlauch. Öffnen Sie anschließend die Bauchhöhle unterhalb des Xiphoidprozesses, heben Sie den Xiphoidprozess an und öffnen Sie den Brustkorb mit einer Schere.Entfernen Sie dann das Perikard, heben Sie das Herz leicht mit einer gebogenen Pinzette an, identifizieren Sie den Aortenbogen und trennen Sie das Herz an der Aortenwurzel ab. Danach überführen Sie das Herz in eine 60 mm-Dish und waschen es mit NT-Lösung. Halten Sie die Aorta mit zwei mikrochirurgischen Pinzetten fest und montieren Sie sie auf die Langendorff-Perfusionskanüle.Dann die Aorta mit chirurgischen Nähten fest an der Kanüle befestigen. Anschließend das Herz mit 30 Milliliter NT-Lösung perfundieren, um die Durchblutung der Koronararterien wiederherzustellen. Danach das Perfusat auf 30 Milliliter kalziumfreie Tyrode-Lösung umstellen, um den Herzschlag zu stoppen.Anschließend den Perfusat auf die Kollagenase-A-Isolationslösung umstellen, um die enzymatische Verdauung durchzuführen. Nach einer Verdauungsdauer von 20 bis 25 Minuten das Perfusionsmedium rasch auf die kalziumfreie Tyrode-Lösung umschalten, um die weitere Verdauung zu stoppen. Danach das Herz mit einer Pinzette festhalten, von der Kanüle ablösen und in eine 35-Millimeter-Schale mit KB-Lösung legen.Danach den Bereich des linken Ventrikels finden. Den Vorhof, den rechten Ventrikel und den Bereich der atrioventrikulären Verbindung abschneiden. Anschließend den linken Ventrikel in eine neue 35-Millimeter-Schale mit KB-Lösung überführen und das Gewebe in kleine Stücke zerkleinern.Pipettieren Sie die Stücke vorsichtig mit einem gefilterten Plastiktropfer. Danach filtrieren Sie die Zellen durch einen Edelstahlfilter mit 150-Mikron-Öffnung und überführen sie in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 150 × g für 30 Sekunden und verwerfen den Überstand.Suspendieren Sie die Myozyten in 10 Milliliter KB-Lösung und lassen Sie sie sechs Minuten lang absedimentieren. Danach entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet 20 Minuten lang in 10 Milliliter KB-Lösung. Nach der Sedimentation in KB-Lösung für 20 Minuten entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren die Myozyten mit Kalziumreintroduktionslösung A. Wiederholen Sie das obige Verfahren mit Kalziumeinführungslösung B. Anschließend wiederholen Sie das obige Verfahren mit NT-Lösung, um die verfügbaren Myozyten zu reinigen.Lagern Sie die isolierten LV-Kardiomyozyten in dieser Lösung und untersuchen Sie sie innerhalb von vier bis sechs Stunden. Geben Sie anschließend NT-Lösung und eine 10 Millimolar Caffein-Lösung in jede Spalte des Stifts. Entfernen Sie alle Luftblasen in den Schläuchen, um eine Luftblockade zu vermeiden.Verbinden Sie nun den Zulaufschlauch mit der NT-Lösung für die Kammerperfusion. Für die Nadelperfusion des Zielmyozyten verbinden Sie die Spitze des Multibehältermankopfs mit dem ventilgesteuerten Perfusionssystem. Danach zählen Sie die Tropfenzahl an der Mikronspitze des Stifts über 10 Sekunden und stellen den Flussregler manuell so ein, dass die Flussgeschwindigkeit etwa drei Tropfen pro 10 Sekunden beträgt.Fügen Sie in diesem Verfahren den Fura-2-Acetoxymethyl-Stock in einen Milliliter der Myozyten-Suspension ein, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolar zu erreichen. Belassen Sie sie 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Danach entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren die Kardiomyozyten zweimal mit NT-Lösung.Danach das Licht ausschalten und die Zellen im Dunkeln belassen. Die Myozyten vor der Perfusion mit NT-Lösung 15 Minuten lang in die Perfusionskammer stellen. Die Myozyten fünf Minuten lang mit Ein-Hertz-Feldstimulation mittels eines Stimulators stimulieren.Wählen Sie nun einen Myozyten mit guter Form und stabiler stimulierter Zuckung unter dem 10X-mikroskopischen Objektiv aus. Klicken Sie auf Datei Neue Datei, um eine neue Aufnahmedatei zu erstellen. Wechseln Sie danach die mikroskopische Vergrößerung auf 40X und drehen Sie die Ausrichtung der CCD-Kamera, um den Myozyten in horizontaler Position zu halten.Danach das einzelne Myozyt durch Anpassen des Zellpositionierungsadapters einrahmen und sicherstellen, dass der Hintergrund frei ist. Anschließend die Myozyten dem Licht einer Xenonlampe mit Anregungsfiltern für 340 oder 380 Nanometer aussetzen und die Myozyten über ein 40X-Objektiv abbilden. Den fluoreszierenden Signal bei 510 Nanometern detektieren.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Start“, um Fluoreszenz und Sarkomerlänge synchron mithilfe des Fluoreszenz-Photomultipliersystems mit doppelter Anregung aufzuzeichnen. Achten Sie auf die Änderungen der Sarkomerlänge der Kardiomyozyten und nehmen Sie diese gleichzeitig mit dem Soft-Edge-Modul auf. Verbinden Sie in diesem Verfahren den Aux-Out-Anschluss des Stimulators über ein BNC-Kabel mit dem Analogeingang des Ventilsteuersystems.Als Nächstes stellen Sie die Parameter in der Ventilsteuerungssoftware ein, klicken Sie auf die Schaltfläche „Download“, um die im Programm geladene Sequenz herunterzuladen, und klicken Sie auf die Auslösertaste, um die Auslöserfunktion zu aktivieren. Danach stellen Sie den Stimulator auf Sequenzmodus ein und legen die Parameter fest. Anschließend stellen Sie den Stimulator auf den S1-Schritt ein, um die LV-Kardiomyozyten mit einem Hertz zu stimulieren.Beginnen Sie die Nadelperfusion mit einer Geschwindigkeit von 1,5 Milliliter pro Minute mit NT-Lösung. Wählen Sie ein Zielmyozyt unter der mikroskopischen Ansicht mit niedriger Vergrößerung aus und stellen Sie sicher, dass es mit der Mikrospitze des Stifts erreichbar ist. Danach wechseln Sie die Mikroskopvergrößerung auf 400X.Drehen Sie die Ausrichtung der CCD-Kamera, um den Myozyten in horizontaler Position zu halten. Anschließend stellen Sie die rechteckige Blende unter dem Zellenrahmen-Adapter auf ein geeignetes Fenster ein, das sich mit den Myozyten füllt. Danach justieren Sie die Position des am Mikromanipulator befestigten Stifts und platzieren die Mikrospitze vorsichtig in einem Abstand, der dem Radius des Sichtfelds zum Zielmyozyten entspricht.Danach den Nadelstrom so einstellen, dass er hauptsächlich den Zielmyozyten abdeckt, und sicherstellen, dass der Myozyt nicht durch den Nadelstrom weggespült werden kann. Nach 60 Sekunden grundlegendem Stimulieren den Stimulator-Cursor auf den D2-Schritt bewegen. Der Rest des Protokolls wird automatisch vom Stimulator und dem Ventilsteuergerät ausgeführt.Klicken Sie auf die Schaltfläche Pause, um die Dateiaufnahme anzuhalten, und verschieben Sie die mikroskopische Ansicht in einen benachbarten leeren Bereich. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Aufnahme, um die Aufnahme für Sekunden fortzusetzen und die Intensitätswerte bei 340 und 380 Nanometern für die Hintergrundkorrektur aufzuzeichnen. Öffnen Sie danach das Dialogfeld Operationskonstante, und tragen Sie die Werte in das Hintergrundformular ein.Die Software kann Fura-2-Verhältniswerte korrigieren, indem sie den Hintergrund subtrahiert. Hier ist eine Darstellung des Protokolls zum automatischen Umschalten der Perfusionsventile und des Stimulationsystems gezeigt. Diese Abbildung zeigt die statistischen Werte der Kalziumreserve des sarkoplasmatischen Retikulums und der fraktionellen Kalziumfreisetzung für bei einem Hertz stimulierte Zuckungen in den diabetischen und Sprague-Dawley-Gruppen.Die diabetische Gruppe zeigte eine signifikant verminderte SR-Calcium-Reserve und eine geringere SR-fractionelle Calcium-Freisetzung im Vergleich zur Sprague-Dawley-Gruppe. Hier zeigt die Software-Oberfläche eine manuelle monoexponentielle Kurvenanpassung für die Abklingzeitkonstante des durch Coffein induzierten Calcium-Impulses. Diese Balkendiagramme vergleichen die Werte für Tau-Coffein sowie das Verhältnis Tau-1Hz/Tau-Coffein zwischen der diabetischen und der Sprague-Dawley-Gruppe.Die diabetische Gruppe wies signifikant erhöhte Werte von Tau-Coffein und Tau-1Hz/Tau-Coffein im Vergleich zur Sprague-Dawley-Gruppe auf. Dieses Verfahren stellt ein machbares und praktisches Werkzeug dar, um den Mechanismus der intrazellulären Kalziumverarbeitung bei kardialer Dysfunktion zu untersuchen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind einige Schlüsselpunkte zu beachten, wie beispielsweise die stabile Anheftung der Kardiomyozyten an die Petrischale, das Umwickeln des Kanalschalters, die Kontrolle der Strömungsgeschwindigkeit der Nadelperfusion sowie der geeignete Abstand zwischen der Nadelspitze und dem Zielkardiomyozyten.

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Forschung

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Einzelne Kardiomyozyten aus Wildtyp- und mutierten Mäusen können aus dem Herzen isoliert werden, um ihre Kontraktilität und Kalziumtransienten zu untersuchen. Dies ermöglicht die Charakterisierung des Beitrags zellulärer Dysfunktion zur Herzfunktionsstörung aus beliebiger Ursache.

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Dieser Artikel beschreibt das detaillierte Protokoll und Anlagen für die duale optische Abbildung von Transmembranpotential (V m) und freie inner Retikulum (SR) notwendig Ca 2+ in der Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von V m und SR Ca 2+ Dynamik im intakten Herzens.

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Derzeit werden die meisten verfügbaren Kalziumindikatoren verwendet, um zytoplasmatische Kalziumtransienten als indirekte Maße für das aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzte Kalzium in kultivierten glatten Muskelzellen zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines spezifischen FRET-basierten Indikators, der die direkte Messung von Calciumsignalen innerhalb des sarkoplasmatischen Retikulumlumens ermöglicht.

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Hier beschreiben wir eine optimierte, Langendorff-basierte Verfahren zur Isolierung von einzelligen Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion. Eine manuelle Regelung der Intraluminal Druck von kardialen Hohlräumen wird implementiert, um funktionell intakt Myozyten geeignet für Erregung-Kontraktion-Kupplung Studien ergeben.

Isolierung von Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion

Wir stellen die Methodik zur Isolierung von murinen Myozyten vor und wie Spannungs- oder Kalziumspuren gleichzeitig mit Sarcomere-Verkürzungsspuren mittels Fluoreszenzphotometrie mit gleichzeitigen Messungen der digitalen Zellgeometrie erhalten werden können.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Schritt für Schritt die Technik der Extraktion und Bewertung der Herzfunktion mit enthäuten Kardiomyozyten zu beschreiben. Diese Methode ermöglicht die Messung und akute Modulation der Myofilament-Funktion mit kleinen gefrorenen Biopsien, die von verschiedenen Herzstellen, von Mäusen bis zu Männern, gesammelt werden können.

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (&lt;50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

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Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca2+ Transienten in Nagetiermyozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur gleichzeitigen Messung von zytosolischem, freiem Calcium [Ca2+]i und Gefäßdurchmesser in kontrahierenden Lymphgefäßen in Echtzeit und zur Berechnung der absoluten Ca2+ -Konzentrationen sowie der Kontraktilitäts-/Rhythmizitätsparameter. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Ca2+ und kontraktile Dynamik unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu untersuchen.

Echtzeit-Auswertung der absoluten, zytosolischen, freien ca2+ und der entsprechenden Kontraktilität in isolierten, druckbeaufschlagten Lymphgefäßen

Erfahren Sie die Bewertung des sarkoplasmatischen Retikulum Calcium-Reserven und der diastolischen Calcium-Entfernung in isolierten Kardiomyozyten. Diese Methode hilft bei der Untersuchung von Calcium-Handhabungsmechanismen bei Diabetes und Herzinsuffizienz.

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